Name: polysome fractionation and analysis of mammalian translatomes on a genome-wide scale
Uploaded: 2014-05-17T14:00:00
Duration: 10 min 56 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Polysome Fractionation and Analysis of Mammalian Translatomes on a Genome-wide Scale at JoVE.com

Это исследование было поддержано Канадского института исследований в области здравоохранения гранта (CIHR СС-115195) и FRQ-S к нему, который одновременно является получателем CIHR премия для молодых следователь; и Шведский исследовательский совет и Шведское общество Рак в ПР

<ol>
	<li>Maier, T., Guell, M., Serrano, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlation+of+mRNA+and+protein+in+complex+biological+samples.">Correlation of mRNA and protein in complex biological samples.</a> FEBS Lett. 583, 3966-3973 (2009).</li><li>de Sousa Abreu, R., Penalva, L. O., Marcotte, E. M., Vogel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+signatures+of+protein+and+mRNA+expression+levels.">Global signatures of protein and mRNA expression levels.</a> Mol Biosyst. 5, 1512-1526 (2009).</li><li>Keene, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+regulons:+coordination+of+post-transcriptional+events.">RNA regulons: coordination of post-transcriptional events.</a> Nat Rev Genet. 8, 533-543 (2007).</li><li>Komili, S., Silver, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coupling+and+coordination+in+gene+expression+processes:+a+systems+biology+view.">Coupling and coordination in gene expression processes: a systems biology view.</a> Nat Rev Genet. 9, 38-48 (2008).</li><li>Schwanhausser, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+quantification+of+mammalian+gene+expression+control.">Global quantification of mammalian gene expression control.</a> Nature. 473, 337-342 (2011).</li><li>Sonenberg, N., Hinnebusch, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+translation+initiation+in+eukaryotes:+mechanisms+and+biological+targets.">Regulation of translation initiation in eukaryotes: mechanisms and biological targets.</a> Cell. 136, 731-745 (2009).</li><li>Rolfe, D. F., Brown, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+energy+utilization+and+molecular+origin+of+standard+metabolic+rate+in+mammals.">Cellular energy utilization and molecular origin of standard metabolic rate in mammals.</a> Physiol Rev. 77, 731-758 (1997).</li><li>Johnson, L. F., Levis, R., Abelson, H. T., Green, H., Penman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+RNA+in+relation+to+growth+of+the+fibroblast.+IV.+Alterations+in+theproduction+and+processing+of+mRNA+and+rRNA+in+resting+and+growing+cells.">Changes in RNA in relation to growth of the fibroblast. IV. Alterations in theproduction and processing of mRNA and rRNA in resting and growing cells.</a> J Cell Biol. 71, 933-938 (1976).</li><li>Fabian, M. R., Sonenberg, N., Filipowicz, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+mRNA+translation+and+stability+by+microRNAs.">Regulation of mRNA translation and stability by microRNAs.</a> Annu Rev Biochem. 79, 351-379 (2010).</li><li>De Benedetti, A., Graff, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=eIF-4E+expression+and+its+role+in+malignancies+and+metastases.">eIF-4E expression and its role in malignancies and metastases.</a> Oncogene. 23, 3189-3199 (2004).</li><li>Roux, P. P., Topisirovic, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+mRNA+translation+by+signaling+pathways.">Regulation of mRNA translation by signaling pathways.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 4, (2012).</li><li>Ron, D., Harding, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-folding+homeostasis+in+the+endoplasmic+reticulum+and+nutritional+regulation.">Protein-folding homeostasis in the endoplasmic reticulum and nutritional regulation.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 4, (2012).</li><li>Silvera, D., Formenti, S. C., Schneider, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translational+control+in+cancer.">Translational control in cancer.</a> Nat Rev Cancer. 10, 254-266 (2010).</li><li>Proud, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mTOR+Signalling+in+Health+and+Disease.">mTOR Signalling in Health and Disease.</a> Biochem Soc Trans. 39, 431-436 (2011).</li><li>Topisirovic, I., Sonenberg, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mRNA+Translation+and+Energy+Metabolism+in+Cancer:+The+Role+of+the+MAPK+and+mTORC1+Pathways.">mRNA Translation and Energy Metabolism in Cancer: The Role of the MAPK and mTORC1 Pathways.</a> Cold Spring Harb Symp Quant Biol. , (2011).</li><li>Pavitt, G. D., Proud, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+synthesis+and+its+control+in+neuronal+cells+with+a+focus+on+vanishing+white+matter+disease.">Protein synthesis and its control in neuronal cells with a focus on vanishing white matter disease.</a> Biochem Soc Trans. 37, 1298-1310 (2009).</li><li>Abe, M., Bonini, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs+and+neurodegeneration:+role+and+impact.">MicroRNAs and neurodegeneration: role and impact.</a> Trends Cell Biol. 23, 30-36 (2013).</li><li>Kasinath, B. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+mRNA+translation+in+renal+physiology+and+disease.">Regulation of mRNA translation in renal physiology and disease.</a> Am J Physiol Renal Physiol. 297, 1153-1165 (2009).</li><li>Zoncu, R., Efeyan, A., Sabatini, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mTOR:+from+growth+signal+integration+to+cancer,+diabetes+and+ageing.">mTOR: from growth signal integration to cancer, diabetes and ageing.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 12, 21-35 (2011).</li><li>Schneider-Poetsch, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+eukaryotic+translation+elongation+by+cycloheximide+and+lactimidomycin.">Inhibition of eukaryotic translation elongation by cycloheximide and lactimidomycin.</a> Nat Chem Biol. 6, 209-217 (2010).</li><li>Larsson, O., Tian, B., Sonenberg, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+a+genome-wide+landscape+of+translational+control.">Toward a genome-wide landscape of translational control.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 5, (2013).</li><li>Ingolia, N. T., Ghaemmaghami, S., Newman, J. R., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+in+vivo+of+translation+with+nucleotide+resolution+using+ribosome+profiling.">Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling.</a> Science. 324, 218-223 (2009).</li><li>Larsson, O., Sonenberg, N., Nadon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+differential+translation+in+genome+wide+studies.">Identification of differential translation in genome wide studies.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. , (2010).</li><li>Larsson, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+perturbation+of+the+translatome+by+the+antidiabetic+drug+metformin.">Distinct perturbation of the translatome by the antidiabetic drug metformin.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 8977-8982 (2012).</li><li>Colman, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+of+host+mRNA+translation+during+hepatitis+C+virus+infection.">Genome-wide analysis of host mRNA translation during hepatitis C virus infection.</a> J Virol. 87, 6668-6677 (2013).</li><li>Larsson, O., Sonenberg, N., Nadon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=anota:+Analysis+of+differential+translation+in+genome-wide+studies.">anota: Analysis of differential translation in genome-wide studies.</a> Bioinformatics. 27, 1440-1441 (2011).</li><li>Gandin, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Degradation+of+Newly+Synthesized+Polypeptides+by+Ribosome-Associated+RACK1/c-Jun+N-Terminal+Kinase/Eukaryotic+Elongation+Factor+1A2.">Degradation of Newly Synthesized Polypeptides by Ribosome-Associated RACK1/c-Jun N-Terminal Kinase/Eukaryotic Elongation Factor 1A2.</a> Complex. Mol Cell Biol. 33, 2510-2526 (2013).</li><li>Warner, J. R., Knopf, P. M., Rich, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multiple+ribosomal+structure+in+protein+synthesis.">A multiple ribosomal structure in protein synthesis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 49, 122-129 (1963).</li><li>Gierer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Function+of+aggregated+reticulocyte+ribosomes+in+protein+synthesis.">Function of aggregated reticulocyte ribosomes in protein synthesis.</a> J Mol Biol. 6, 148-157 (1963).</li><li>Wright, G. W., Simon, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+random+variance+model+for+detection+of+differential+gene+expression+in+small+microarray+experiments.">A random variance model for detection of differential gene expression in small microarray experiments.</a> Bioinformatics. 19, 2448-2455 (2003).</li><li>Eggers, D. K., Welch, W. J., Hansen, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complexes+between+nascent+polypeptides+and+their+molecular+chaperones+in+the+cytosol+of+mammalian+cells.">Complexes between nascent polypeptides and their molecular chaperones in the cytosol of mammalian cells.</a> Mol Biol Cell. 8, 1559-1573 (1997).</li><li>Grosso, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PKCbetaII+modulates+translation+independently+from+mTOR+and+through+RACK1.">PKCbetaII modulates translation independently from mTOR and through RACK1.</a> Biochem J. 415, 77-85 (2008).</li><li>Oh, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mTORC2+can+associate+with+ribosomes+to+promote+cotranslational+phosphorylation+and+stability+of+nascent+Akt+polypeptide.">mTORC2 can associate with ribosomes to promote cotranslational phosphorylation and stability of nascent Akt polypeptide.</a> EMBO J. 29, 3939-3951 (2010).</li><li>Zinzalla, V., Stracka, D., Oppliger, W., Hall, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+mTORC2+by+association+with+the+ribosome.">Activation of mTORC2 by association with the ribosome.</a> Cell. 144, 757-768 (2011).</li><li>Bjur, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+translational+control+in+CD4++T+cell+subsets.">Distinct translational control in CD4+ T cell subsets.</a> PLoS Genet. 9, e13 (2013).</li><li>Leek, J. T., Storey, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capturing+heterogeneity+in+gene+expression+studies+by+surrogate+variable+analysis.">Capturing heterogeneity in gene expression studies by surrogate variable analysis.</a> PLoS Genet. 3, 1724-1735 (2007).</li><li>Guttman, M., Russell, P., Ingolia, N. T., Weissman, J. S., Lander, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosome+Profiling+Provides+Evidence+that+Large+Noncoding+RNAs+Do+Not+Encode+Proteins.">Ribosome Profiling Provides Evidence that Large Noncoding RNAs Do Not Encode Proteins.</a> Cell. 154, 240-251 (2013).</li><li>Hsieh, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+translational+landscape+of+mTOR+signalling+steers+cancer+initiation+and+metastasis.">The translational landscape of mTOR signalling steers cancer initiation and metastasis.</a> Nature. 485, 55-61 (2012).</li><li>Thoreen, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+unifying+model+for+mTORC1-mediated+regulation+of+mRNA+translation.">A unifying model for mTORC1-mediated regulation of mRNA translation.</a> Nature. 485, 109-113 (2012).</li></ol>

Авторы заявляют каких конкурирующих финансовых интересов.

В этой статье описывается устоявшихся протокол полисом фракционирования с последующим способом разработаны анализа в доме для захвата качественные и количественные изменения в переводческой деятельности на генома масштабе в клетках млекопитающих. Для успешного завершения этого протокола особое внимание должно быть уделено 1) Сотовый слияния (как темпы распространения и доступность питательных веществ коррелирует с переводческой деятельности мРНК и может повлиять на состав translatome, сотовый конфлюентности должны согласовываться по повторах и экспериментальных условиях), 2) быстрого лизиса клеток (Несмотря присутствии циклогексимида и ингибиторы РНКазы в буферах, лизис должен быть быстрым и клеточные экстракты должны быть наложены на градиентах сахарозы сразу после лизиса для предотвращения деградации РНК и диссоциацию полисом), 3) Градиент препарат (для обеспечения высокая воспроизводимость данных, градиенты сахарозы должны быть получены с использованием градиента кофеваркой и SPECIAL следует позаботиться при обращении с ними). В дополнение к изучению изменений в поступательное активности, этот протокол может быть использован для изоляции рибосом-ассоциированный белковые комплексы и создают свои физиологические функции. С этой целью уровни и положение фосфорилирование различных рибосом белков, ассоциированных может быть определена путем ТСА осадков, с последующим вестерн-блоттинга, тогда как рибосомы, связанные белковые комплексы могут быть иммунопреципитации из градиентных фракций и анализировали вестерн-блоттингом или масс-спектрометрии. Недостатком этого метода является то, что медленный метод фракция градиент может привести к диссоциации даже сильно связанных белков, связывание кинетика в быстрой ассоциации / диссоциации. Факторы, ассоциированные с вновь синтезированных полипептидов являются типичными примерами. Вновь синтезированных полипептидов возникающие образуют рибосомы может быть иммобилизован на белковых комплексов, связанных с рибосомами с использованием химических сшивающих агентов, таких как три, 3&#39;-дитиобис [sulfosuccinimidylpropionate] (DTSSP) 31. Этот подход показал, что рецептор для активированного C киназы 1 (RACK1) / C-Jun N-концевой киназы (JNK) / эукариотических фактор элонгации трансляции 1A2 (eEF1A2) комплекс регулирует деградацию вновь синтезированных полипептидов в ответ на стресс 27. Кроме того, подобно методологии был использован в исследований, показывающих, что протеинкиназа С BII (PKCbII) набирается с рибосомами по RACK1 32 и что активация MTOR комплекса 2 (mTORC2) происходит на рибосомах, где она фосфорилирует вновь синтезированных полипептидов AKT и регулирует их Стабильность 33,34. Основные ограничения метода полисом фракционирования с последующим анализом anota являются: 1) требование к относительно высоким числом клеток (~ 15 х 10 6 клеток), 2) отсутствие позиционной информации о локализации рибосомы на данном мРНК молекулы, и 3 ) вопросы, связанные с клеточной и молекулярной гетерооднородностью нормальных и опухолевых тканей. Вопросы, связанные с необходимого количества клеток может быть решена путем совмещения спектры поглощения пики, соответствующие monosomes (80S) клеток, чьи суммы ограничения с данными, полученными от высокого численности клеток (например, клетки HeLa) 35. Рибосомы метод профилирования (см. ниже) могут быть использованы для определения точного положения рибосомы на данной мРНК молекулы, в то время как обсуждаются вопросы, связанные с смешанных эффектов ткани неоднородности на интерпретацию изменения в экспрессии генов, полученных из сложных систем, таких как тканей человека подробно в публикации лук-порей и Стори 36. Недавно был разработан новый рибосомы профилирования технику, в котором защищены рибосом фрагменты (РППБ) генерируются лечения РНКазы I и проанализированы глубокой последовательности 22. Этот метод позволяет определить рибосомы позиции в одной нуклеотидной разрешением, тем самым обеспечивая до сих пор unprecedented идеи в рибосомы биологии. Например, рибосома профилирование может быть использован для определения плотности рибосом на данной мРНК молекулы или идентификации элементов, что уровень перевод влияние инициации, такие как альтернативных сайтов инициации, инициирование в не-август кодонов и регуляторных элементов, таких как uORFs. Тем не менее, есть несколько методологические ограничения, которые ограничивают способность рибосом профилирования точно оценить эффективность трансляции мРНК. Они включают независимых погрешностей, вносимых случайной фрагментации и РНКазы I пищеварения, смещает введенные ингибиторов перевода (например, удлинение ингибиторы, такие как эметина и циклогексимида, вероятно, чтобы вызвать накопление рибосом на участках инициации трансляции), большое количество ложных положительных и ложноотрицательных результатов связаны с ТЕ оценки, а также их неточности в прогнозировании говорится, что происходят из белков мРНК, кодирующих 37. Возможно, самое главное, в то время какрибосома профилирование обеспечивает прямой идентификации рибосом положении на заданном мРНК молекулы, число рибосом, связанного с данной мРНК косвенно оценивается путем нормализации частоты считывает РППБ (рибосома-ассоциированной мРНК) над тем, которые наблюдались в случайно фрагментированных мРНК (всего мРНК). Например, в простой обстановке, где четыре &quot;B&quot; молекулы мРНК (BA, BB, BC и BD) заняты четырьмя рибосом в положениях 1, 2, 3 и 4, неотъемлемой недостаток профилирования техники рибосомы не позволит Различие между сценарии, где все 4 рибосомы ассоциировать только с Ba мРНК в положениях 1, 2, 3, и 4 и сценарии, где Ba, Bb, Bc и Bd мРНК каждый занимаемого одной рибосомы в положении 1, 2 , 3 и 4, соответственно. В отличие от этого, во время полисом фракционирования, полисом целостность сохраняется, что позволяет изоляцию пулов мРНК связанных с определенного числа рибосом (рис. 1). Это импортмуравей различие между полисом фракционирования и рибосомы профилирования позволяет предположить, что в то время как первый метод может быть использован для непосредственного сравнения мРНК в mRNP, легкой и тяжелой полисом фракции, последний метод, скорее всего, не в состоянии захватить изменения в translatome, которые вызваны мРНК, переход от легких до тяжелых полисом, а переоценить вклад тех, перейти от фракции mRNP к тяжелым полисом. Биологическое значение этих расхождений между вышеуказанными способами подчеркивается большой объем данных, показывая, что активация поступательное подмножества мРНК, таких как те, которые eIF4E чувствительных, переход от легких до тяжелых полисом, в то время как другие, такие как те, укрывательство элементы 5&#39;TOP, вербуются для тяжелых полисом непосредственно из пулов рибосомы без мРНК 6. Интересно, что МРМ путь, как было показано одновременно модулировать перевод &quot;eIF4E чувствительных&quot; и 5&#39;TOP мРНК 11. Таким образом, методологические различия, которые обсуждаются выше, могут объяснить видимое рассогласование заключения между исследований с использованием рибосомы профилирования 38,39 и полисом фракционирования 24 для оценки последствий MTOR торможения на translatome. В заключение полисом фракционирование и рибосома профилирование являются взаимодополняющими методы, в первую очередь обеспечивают информацию относительно числа рибосом, связанных с мРНК и положение рибосомы на мРНК, соответственно. Важно отметить, что несмотря на недостатки и преимущества этих методов, она остается важным, что данные генома, полученные обеих процедур надлежащим образом проанализированы и функционально и биохимически подтверждена.

Регуляторные сети, которые контролируют экспрессию генов были широко изучены в течение последних двух десятилетий. Подавляющее большинство из этих научно-исследовательских работ, направленных на регуляцию транскрипции, в результате чего изменения в уровнях стационарных мРНК на генома масштабе были использованы для определения так называемых &quot;экспрессии генов&quot; профили. Недавние исследования показывают, что уровень устойчивого состояния мРНК лишь в общих чертах соответствуют составе протеома 1,2, что указывает, что пост-транскрипционные механизмы, в том числе трансляции мРНК, играют важную роль в регуляции экспрессии генов 3,4. В самом деле, было подсчитано, что ~ 50% от уровня белка определяются на уровне трансляции мРНК в иммортализованных фибробластов мыши 5. перевод мРНК является строго регулируется процесс, при котором мРНК транслируются в белки через организованной действий рибосом, трансфер РНК (тРНК) и аксессуаров факторов сотрудничестваmmonly называют факторов перевода (TFS) 6. Синтез белка является наиболее трудоемким процессом энергии в клетках млекопитающих 7 и, следовательно, глобальный уровень перевода мРНК корректироваться с учетом доступности питательных веществ и клеточной пролиферации ставки 8. В дополнение к изменениям в глобальных темпов перевода мРНК, различных внеклеточных стимулов (например, гормонов и факторов роста), внутриклеточных сигналов (например, уровней аминокислот) и различных видов стресса (например, ER-стресс) вызывают селективные изменения в бассейнах мРНК, которые переводится (translatome) 6. В зависимости от типа раздражителя, переводческой деятельности некоторых, но не все мРНК резко пострадавших, в результате чего изменения в протеома, которые необходимы для установки быстрого клеточный ответ 6. Эти качественные и количественные изменения в translatome, как считается, при посредничестве взаимодействия между транс-действующих факторов (например, </EM&gt; компоненты трансляционного аппарата, вспомогательных факторов или микроРНК) и цис-элементов (элементов РНК или черт), присутствующих в выбранных подмножеств мРНК 6,9. Например, изменения в уровнях и / или деятельности, ограничивающей скорость инициации трансляции факторы eIF4E и eIF2 избирательно модулировать перевод стенограммы на основе конкретных 5&#39;UTR особенностей 6. eIF4E и eIF2 требуются для найма мРНК и инициатора тРНК с рибосомой, соответственно 6. Увеличение eIF4E деятельности выборочно укрепляет перевод мРНК, несущих длинные и хорошо структурированный 5&#39;UTRs в том числе распространения кодирования и выживания стимулирующего белки в том числе циклинов, С-тус и Bcl-XL 10. В свою очередь, инактивация eIF2 приводит к глобальной синтеза белка остановки, в то время как выборочно до регулирования перевод мРНК, содержащих короткие тормозные вверх по течению кадров открыт для чтения (uORFs) в их 5&#39;UTRs, такие как те, кодирования Master Transcriptional регуляторы разложенном ответ белка (например ATF4). В ответ на различные стимулы, включая питательных веществ, факторов роста и гормонов, механистической / цели рапамицина млекопитающих (МРМ) путь стимулирует eIF4E деятельность путем инактивации 4E-связывающего белка (4E-ВР) семейный ограничителей перевода, в то время как МАРК путь непосредственно фосфорилирует eIF4E 6,11. В свою очередь, eIF2α киназы (т.е. PERK, PKR, HRI и GCN2) ингибируют eIF2 путем фосфорилирования его eIF2α регуляторной субъединицы в ответ на питательной лишения, ER-стресс и вирусной инфекции 6,12. Изменения в активности и / или экспрессии ТФ, другие компоненты аппарата трансляции и нормативных факторов, включая микроРНК были обнаружены в различных патологических состояний, включая рак, метаболические синдромы, неврологических и психиатрических расстройств, и почечных и сердечно-сосудистых заболеваний 13-19. В совокупности эти данные свидетельствуют о том, что трансляционным меняchanisms играют ключевую роль в поддержании гомеостаза клетки и что их отмена играет центральную роль в этиологии различных заболеваний человека. При этом протокол для фракционирования полисом сахарозы центрифугирования в градиенте плотности в клетках млекопитающих, который используется, чтобы отделить от полисомы monosomes, рибосомных субъединиц и частиц вестник рибонуклеопротеидных (mRNPs) описывается. Это позволяет дискриминацию между эффективно переведены (связанный с тяжелыми полисом) в плохо переведенных (связанный с легкими полисом) мРНК. В этом анализе рибосомы иммобилизуют на мРНК с использованием ингибиторов элонгации трансляции, такие как циклогексимид 20 и цитозольных экстракты разделяют на 5-50% линейного градиента плотности сахарозы с помощью ультрацентрифугирования. Последующее фракционирование сахарозы градиенты позволяет изолировать мРНК в соответствии с количеством рибосом они связываются с. РНК экстрагировали из каждой фракции могут быть затем использованы для определенияизменения в распределении мРНК по всему градиенту между различными условиями, в результате чего повышается эффективность поступательные от верхней части к нижней части градиента. Нозерн-блоттингом или количественный обратной транскрипции полимеразной цепной реакции (QRT-PCR) используются для определения уровней мРНК в каждой фракции. Кроме того, тяжелые фракции, содержащие полисомы (обычно более 3-рибосомами) объедин ли и геномные полисом-ассоциированной уровни мРНК определяются с использованием микрочипов или глубоко последовательности. Это имеет первостепенное значение, чтобы подчеркнуть, что уровни полисом связанных мРНК являются, помимо перевода, зависит от транскрипции и посттранскрипционных механизмов, влияющих цитозольные мРНК уровнях 21. Поэтому для определения различий в переводе с использованием данных генома с полисом-ассоциированной мРНК необходимо для коррекции эффектов от шагов в экспрессии генов пути, которые перед трансляцииТион 21. Чтобы разрешить такую ​​коррекцию, цитозольного РНК получают параллельно с полисом-ассоциированной РНК из каждого образца и уровней мРНК стационарных генома определяются 21. В настоящее время так называемый &quot;перевод-эффективность&quot; (TE) результаты (т.е. лог-соотношение между полисом связанных данных мРНК и цитозольными данных мРНК) часто используются для коррекции последствий изменений в цитозольными уровней мРНК на эффективность трансляции из учитывая мРНК 22. Однако, используя TE баллы, чтобы определить дифференциальное перевод связан с значительного числа ложноположительных и отрицательных выводов в связи с математической имущества баллов ТЕ обычно называют ложной корреляции 27. Действительно обзор наборов данных из нескольких лабораториях показали, что такие ложные корреляции кажутся неизбежными при анализе изменений в translatomes 23. Это побудило развитие &quot;анализа дифференциального тр<html> anslation &quot;(anota) алгоритм, который не страдает от вышеупомянутых недостатков 23. Во anota-анализа модель регрессии используется для получения меры переводческой деятельности независимо от цитозольными уровней РНК. Затем Такие меры сравниваются между условиями и статистика рассчитывается. Пользователь имеет возможность применения метода усадки дисперсии, которая улучшает статистическую мощность и уменьшает возникновение ложных положительных результатов в исследованиях с нескольких повторов 24. Важно отметить, что недавно было показано, что возмущения в translatome захвачен anota, но не забивает TE, коррелируют с изменениями в протеоме 25. Поэтому, настоятельно рекомендуется применять анализ anota для идентификации изменений в переводе на генома масштабе. Хотя были обсуждены теоретические основы алгоритма anota подробно ранее 21,23,26, здесь акцент делается на том, как применять ее на практике. ve_content &quot;&gt; В дополнение к изучению изменений в переводческой деятельности мРНК в клетке, это рибосома протокол фракционирования может быть использован для выделения и биохимически и функционально охарактеризовать рибосомы и полисом связанных белковых комплексов. Такой подход был успешно развернут в прошлом, чтобы определить комплексы, которые регулируют стабильность вновь синтезированных полипептидов 27 и / или участвующих в фосфорилирования компонентов аппарата трансляции. Это применение метода полисом фракционирования также будут кратко рассмотрены.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="694">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">HEPES</td>
			<td style="width:84px;">Biobasic</td>
			<td style="width:119px;">HB0264</td>
			<td style="width:223px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">MgCl 2</td>
			<td style="width:84px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">KCl</td>
			<td style="width:84px;">VWR</td>
			<td>CABDH4532</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td style="width:84px;">Biobasic</td>
			<td style="width:119px;">DB0058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Tris</td>
			<td style="width:84px;">Biobasic</td>
			<td style="width:119px;">TB0196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Glycoblue</td>
			<td style="width:84px;">Ambion</td>
			<td style="width:119px;">AM9515</td>
			<td>RNA precipitation carrier</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Sodium Deoxycholate&#160;</td>
			<td style="width:84px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">D6750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:84px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Cycloheximide</td>
			<td style="width:84px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">C1988</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Protease inhibitor cocktail&#160;</td>
			<td style="width:84px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">04693132001</td>
			<td>Tablets (EDTA-free)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">RNase inhibitor&#160;</td>
			<td style="width:84px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">N2515</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">0.45 &#181;m Filter System 150 ml</td>
			<td style="width:84px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">431155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Sucrose</td>
			<td style="width:84px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">S0389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">RNeasy MinElute Cleanup kit&#160;</td>
			<td style="width:84px;">Qiagen</td>
			<td style="width:119px;">74204</td>
			<td>RNA cleanup kit</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">Thin wall polyallomer ultracentrifuge tubes&#160;</td>
			<td style="width:84px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:119px;">331372</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Equipments</td>
			<td style="width:84px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">SW41Ti Rotor Package with accessories</td>
			<td style="width:84px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:119px;">331336</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">Optima L100 XP ultra centrifuge</td>
			<td style="width:84px;">Beckman Coulter</td>
			<td>DS-9340A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">ISCO fraction collector&#160;</td>
			<td style="width:84px;">Brandel</td>
			<td style="width:119px;">FC-176-R1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Type II Detector with Chart Recorder</td>
			<td style="width:84px;">Brandel</td>
			<td style="width:119px;">UA-6</td>
			<td>UV detector</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">Tube Piercer w/Flow Cell and Syringe Pump</td>
			<td style="width:84px;">Brandel</td>
			<td style="width:119px;">BR-A86-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">UA-6 Detector Cable</td>
			<td style="width:84px;">Brandel</td>
			<td style="width:119px;">60-1020-211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">FC-176 Communication Cable</td>
			<td style="width:84px;">Brandel</td>
			<td style="width:119px;">FCC-176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Gradient Master Base Unit</td>
			<td style="width:84px;">Biocomp</td>
			<td style="width:119px;">108-1</td>
			<td>Gradient Maker</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Gradient Forming Attachments</td>
			<td style="width:84px;">Biocomp</td>
			<td style="width:119px;">105-914A-1R</td>
			<td>Gradient Maker attachment</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">Measurement Computing 8-channel 50kHz Data Acquisition Device</td>
			<td style="width:84px;">MicroDAQ</td>
			<td style="width:119px;">USB-1208FS</td>
			<td>Analysis software attachment</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">Measurement Computing Data Acquisition Software</td>
			<td style="width:84px;">MicroDAQ</td>
			<td style="width:119px;">TracerDAQ Pro</td>
			<td>Analysis software (Download only)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;"></td>
			<td style="width:84px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Buffers</td>
			<td style="width:84px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">10X buffer for sucrose gradients:</td>
			<td style="width:84px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">200 mM HEPES (pH7.6)</td>
			<td style="width:84px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1 M KCl</td>
			<td style="width:84px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">50 mM MgCl2</td>
			<td style="width:84px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">100 &#181;g/ml cycloheximide</td>
			<td style="width:84px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1x protease inhibitor cocktail (EDTA-free)</td>
			<td style="width:84px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">100 units/ml RNase inhibitor</td>
			<td style="width:84px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;"></td>
			<td style="width:84px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Lysis buffer</td>
			<td style="width:84px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">5 mM Tris-HCl (pH7.5)</td>
			<td style="width:84px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">2.5 mM MgCl2</td>
			<td style="width:84px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1.5 mM KCl&#160;</td>
			<td style="width:84px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1x protease inhibitor cocktail (EDTA-free)]</td>
			<td style="width:84px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:269px;">Then add cycloheximide (CHX), DTT, RNAse inhibitor, Triton and Sodium Deoxycholate as indicated in the main text</td>
			<td style="width:84px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

polysome fractionation and analysis of mammalian translatomes on a genome-wide scale

перевод мРНК играет центральную роль в регуляции экспрессии генов и представляет собой наиболее процесс потребления энергии в клетках млекопитающих. Соответственно, нарушение регуляции трансляции мРНК считается играют важную роль в различных патологических состояний, включая рак. Рибосомы также проведет сопровождающих, которые облегчают укладку растущими полипептидами, тем самым модулировать функцию и стабильность вновь синтезированных полипептидов. Кроме того, развивающиеся данные показывают, что рибосомы служить платформой для репертуара сигнальных молекул, которые причастны к различным пост-трансляционных модификаций вновь синтезированных полипептидов, как они выходят из рибосомы, и / или компонентов аппарата трансляции. При этом, устоявшихся метод рибосомы фракционирования с использованием градиент плотности сахарозы центрифугирования описывается. В сочетании с развитой &quot;anota&quot; алгоритма в доме этот метод позволяет прямое определение Differential перевод отдельных мРНК на генома масштабе. Более того, этот универсальный протокол может быть использован для различных биохимических исследований, направленных на рассекают функцию рибосом-ассоциированный белковых комплексов, в том числе те, которые играют центральную роль в складывании и деградации вновь синтезированных полипептидов.

МРМ является одним из основных узлов сотовой сети, которая координирует глобальные цены синтез белка с наличия питательных веществ 19. перевод мРНК регулируется в основном на ограничение скорости инициирования шаге 6. Доля рибосом, занимающихся полисом положительно коррелирует с инициации трансляции ставок 28. Примером применения метода полисом фракционирования исследовать роль MTOR сигнализации в посредничестве эффектов инсулина на трансляции мРНК представлена. С этой целью MCF7 рака молочной железы человека клетки поддерживали в низкой сыворотки и затем стимулировали в отдельности или в комбинации с активно-сайта MTOR ингибитора Torin1 инсулина. Non-стимулированные клетки, которые непрерывно держали в низкой сыворотки, служили в качестве контроля. mRNPs, monosome (80S) и полисом фракции разделении методом полисом фракционирования. По сравнению с контрольными клетками, инсулин вызвало увеличение оптической плотности в градиентных фракций, соответствующихчтобы полисом, сопровождается сопутствующим снижением поглощения в monosome фракции (рис. 1). Эти данные показывают, что доля рибосом, участвующих в полисом увеличивается в обработанной инсулина по сравнению с контрольными клетками, поэтому о том, что, как и ожидалось, инсулин стимулирует глобальные цены инициации трансляции. Torin1 вспять эффекты инсулина на профили поглощения (рис. 1), тем самым подтверждая выводы, что передача сигналов МРМ играет важную роль в обеспечении эффектов инсулина на перевод машин 19. На основе принцип, что несоответствия в градиентной подготовки нельзя избежать, вопросы были подняты в отношении воспроизводимости полученных с помощью метода 22 полисом фракционирования данных. Чтобы эмпирически проверить эту потенциально вредное вопрос, цитозольные и тяжелой полисом связанных РНК (мРНК, связанные с 4 и более рибосом) были изолированы<html> от MCF7 клетках, обработанных только инсулина или инсулина в сочетании с Torin1 от 4-х независимых биологических повторяет (рис. 2). Эффекты инсулина и Torin1 о составе цитозольной и тяжелой полисом связанных мРНК в каждой повторности определяли на генома масштабе с использованием микрочипов подход. Для определения воспроизводимости метода полисом фракционирования метод главных компонент (PCA) был применен. Такой анализ показал, что образцы, принадлежащие к каждого условия были плотно расположены внутри двух первых компонентов в то время как различные условия были хорошо разделены (рис. 2). Эти данные показывают, что метод полисом фракционирование, как описано здесь очень воспроизводимые и, следовательно, необходимости изучать количественные и качественные изменения в переводе на генома уровне. ad/51455/51455fig1highres.jpg &quot;Первоначально&quot; / files/ftp_upload/51455/51455fig1.jpg &quot;/&gt; Рисунок 1. Полисомной профили, показывающие влияние сывороточного голодания, инсулина и МРМ сигнализации по глобальной перевода в MCF7 клетки. MCF7 клетки были лишены питательных веществ (поддерживается в 0,1% FBS) в течение 16 часов и обрабатывают 5 нМ инсулина (INS) один или в сочетании с 250 нМ Torin1 (Ins + Torin1) в течение 4 часов. Необработанные клетки, которые непрерывно лишенные питательных веществ (0,1% FBS) были использованы в качестве контроля. Соответствующие цитозольных экстракты осаждают центрифугированием на 5-50% градиенте сахарозы. Бесплатные рибосомные субъединицы (40S и 60S), monosomes (80S) и количество рибосом в полисом фракций указаны. <img alt="Рисунок 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51455/51455fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51455/51455fig2.jpg" /> Рисунок 2. Генома данные, полученные с помощью рolysome профилирование высокой воспроизводимостью. MCF7 клетки обрабатывали, как на рисунке 1. цитозольного и полисом-ассоциированной РНК (&gt; 3 рибосомы) была извлечена из 4-х независимых биологических повторяет и их генома уровней мРНК были определены с использованием GeneTitan массивы (Affymetrix). СПС была использована для оценки воспроизводимости полученных данных. Показаны первые два компонента PCA для всех процедур (Т1 = Торин 1; Ctrl = контроль; Ins = инсулин), происхождение РНК (C = цитозольного; Р = полисом связанных) и повторяет. Образцы из тех же условиях и РНК происхождения тесно расположены указанием высокую воспроизводимость.

Watch this Scientific Journal Video about Polysome Fractionation and Analysis of Mammalian Translatomes on a Genome-wide Scale at JoVE.com

Polysome Fractionation and Analysis of Mammalian Translatomes on a Genome-wide Scale

Рибосомы играют центральную роль в синтезе белка. Polyribosome (полисом) фракционирование в градиенте плотности сахарозы центрифугирования позволяет непосредственно определить эффективность перевода отдельных мРНК на генома масштабе. Кроме того, этот метод может быть использован для биохимического анализа рибосом и полисом-ассоциированных факторов, таких как шаперонов и сигнальных молекул.

Полисом фракционирования и анализ млекопитающих Translatomes на генома масштабе

mRNA translation plays a central role in the regulation of gene expression and represents the most energy consuming process in mammalian cells. ...

Research

JoVE Journal

Biology

Intranuclear Microinjection of DNA into Dissociated Adult Mammalian Neurons

Внутриядерных микроинъекции ДНК в диссоциированных взрослых млекопитающих Нейроны

Primary neuronal cell cultures are valuable tools to study protein function since they represent a more biologically relevant system compared to ...

In situ Subcellular Fractionation of Adherent and Non-adherent Mammalian Cells

In situ Subcellular Fractionation of Adherent and Non-adherent Mammalian Cells

В месте субклеточных Фракционирование Приверженец и не соблюдают клетках млекопитающих

Protein function is intimately coupled to protein localization. Although some proteins are restricted to a specific location or subcellular compartment, ...

Genome-wide Analysis of Aminoacylation (Charging) Levels of tRNA Using Microarrays

Genome-wide Analysis of Aminoacylation Charging Levels of tRNA Using Microarrays

Генома Анализ аминоацилирования (зарядка) уровни тРНК Использование Microarrays

tRNA aminoacylation, or charging, levels can rapidly change within a cell in response to the environment[1]. Changes in tRNA charging levels in both ...

Genome-wide Analysis using ChIP to Identify Isoform-specific Gene Targets

Генома анализа с использованием чип-изоформы Определить конкретные цели Гена

Recruitment of transcriptional and epigenetic factors to their targets is a key step in their regulation. Prominently featured in recruitment are the ...

Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells

Мутагенеза и функционального анализа ионных каналов Heterologously Выраженный в клетках млекопитающих

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying ...

Scale-Up of Mammalian Cell Culture using a New Multilayered Flask

Расширение масштабов культуры клеток млекопитающих использованием новых многослойных Колба

A growing number of cell-based applications require large numbers of cells. Usage of single layer T-flasks, that are adequate during small-scale ...

Analysis of Cell Cycle Position in Mammalian Cells

Анализ сотового Позиция цикла в клетках млекопитающих

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of ...

A Novel Bayesian Change-point Algorithm for Genome-wide Analysis of Diverse ChIPseq Data Types

Роман байесовского Изменение точки Алгоритм всему геному анализ различных типов данных ChIPseq

ChIPseq is a widely used technique for investigating protein-DNA interactions. Read density profiles are generated by using next-sequencing of ...

Genome-wide Gene Deletions in Streptococcus sanguinis by High Throughput PCR

Genome-wide Gene Deletions in Streptococcus sanguinis by High Throughput PCR

По всему геному Гена удаления в<em&gt; Streptococcus sanguinis</em&gt; По высокая пропускная способность ПЦР

Transposon  mutagenesis and single-gene deletion are two methods applied in genome-wide  gene knockout in bacteria 1,2. Although transposon mutagenesis is ...

Analysis of Translation Initiation During Stress Conditions by Polysome Profiling

Анализ инициации трансляции во время стресса кондиций полисом профилирования

Precise control of mRNA translation is fundamental for eukaryotic cell homeostasis, particularly in response to physiological and pathological stress. ...