Name: scanlag: high-throughput quantification of colony growth and lag time
Uploaded: 2014-07-15T13:00:00
Duration: 7 min 47 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about ScanLag: High-throughput Quantification of Colony Growth and Lag Time at JoVE.com

We thank Eliq Oster for the images of the Bacillus subtillis. The work is supported by the European Research Council (# 260871) and the Israel Science Foundation (#592/10).

1.. Byg Setup <ol><li> Vælg en flatbed scanner med optisk opløsning: 4.800 dpi; Hardware opløsning: 4.800 x 9.600 dpi; farve bit dybde: 48 bit, der kan køre med de relevante temperatur og luftfugtighed. </li><li> Petriskåle har betydelig mængde, i modsætning til papir normalt bruges på kommercielle scannere. Kolonierne ligge oven på agaren lag, omkring 5 mm over scanneren overflade. Bemærk: For de fleste scannere kolonierne vil være i fokus. </li><li> Nogle scanner virksomheder ikke tillader tilslutning af mere end én forekomst af scanner af samme type til den samme computer. Sørg for, at mere end én scanner kan fastgøres og identificeres entydigt. </li><li> Forbered tilbehør som beskrevet nedenfor: <ol><li> Forbered stykker steril sort filt klud til at dække pladerne (figur 1, trin 2). </li><li> At holde petriskåle på plads, forberede hvid plade holdere (Materialer og metoder), der passer til de scannere, og som har 6 holes størrelse retter (figur 1, trin 3). </li></ol></li><li> Hvis det er nødvendigt for væksten af ​​mikroorganismen, satte scannere i et temperaturstyret miljø. Tilslut scannere til computeren. </li><li> Valgfrit: Tilslut relæet til computeren og omgå on / off knappen på scanneren til at overvinde temperaturgradient. BEMÆRK: Relæenheden er ekstremt temperaturfølsomme mikroorganismer. Det slukker scanneren så elektronikken ikke opvarme overfladen ujævnt. Brug af kun en del af scanneren overflade kan opnå lignende resultater. </li></ol> 2.. Installer Scanning manager <ol><li> Kopier alle &#39;Scanning udlejer&#39; programfiler ind i en udpeget mappe fra http://www.phys.huji.ac.il/bio_physics/nathalie/publications.html. </li><li> Konfiguration ScanningManager.exe.config fil i henhold til de scannere navne som de vises i Computer Management-&gt; Enhedshåndtering-&gt; Imaging Devices ( <strong&gt; Figur 2). </li><li> For fejlfinding af &quot;Scanning Manager&quot; ansøgning, se læse filen. </li><li> For yderligere dokumentation om »Scanning Manager&quot; ansøgning, se Documentation.html. </li></ol> 3.. Udfør et eksperiment <ol><li> Forbered petriskåle (figur 1): <ol><li> Fortyndes kulturen til ca 2.000 CFU / ml. Plate 0,1 ml kultur ensartet på pladens overflade. </li><li> For at opnå en god kontrast mellem kolonierne og skålen og til at absorbere fugt, dække pladen med et stykke sterilt sort filt klud. Sæt låg på pladen. </li></ol></li><li> Placer pladerne i holderne på scannere. </li><li> Start Scanning Manager (figur 3): Vælg de deltagende scannere fra listen over tilsluttede scannere. Vælg det antal billeder, der skal træffes (Gentagelser), tidsintervallet mellem efterfølgende billeder (Time hul), og den tid, før du starter tHan eksperimenterer (Start Efter). </li></ol> 4.. Analyse af billeder BEMÆRK: En skitse af beregningsmetoder er fastsat for at analysere billederne i Matlab ved hjælp af &quot;ScanLag&quot;, som er frit tilgængelig for ikke-kommerciel brug på http://www.phys.huji.ac.il/bio_physics/nathalie/publications. html. Yderligere tilgængelige funktioner er beskrevet i software manual, og et eksempel kode suppleres. <ol><li> Sortere billederne fra hver scanner i separate mapper. </li><li> Brug Matlab kommando vindue, skal du køre følgende procedurer. De parametre, der kræves for at køre disse procedurer er defineret i softwaren manual. <ol><li> Kør PreparePictures at udføre forbehandling: I forbehandling, er billeder fra en scanner justeret. Hver petriskål er beskåret fra hver sekvens af billeder. Det tidspunkt, hvor hvert billede blev opsamlet hentes fra tidsstemplet. </li><li> Kør TLAllPlates at udføre detektering og sporing I eACH petriskål separat, registreres og tildeles et identifikationsnummer kolonier. </li><li> Analyse af den ekstraherede data: Størrelsen af ​​hver detekteret koloni måles som en funktion af tiden. At udtrække udseende fordeling af kolonierne bruge følgende funktioner i Matlab kommando vindue (yderligere information er tilgængelig i softwaren manual): <ol><li> Kør ScanLagApp at vise analyse af en vis petriskål sammen med grafen for kolonierne size versus tid (figur 4). <ol><li> Brug skyderen til at ændre den aktuelle tid for pladen. Timingen vil også blive indikeret med en matchende lodret linie på grafen kolonier området. </li><li> Klik på en koloni for at se den tilhørende kurve, og omvendt, skal du klikke på en kurve for at finde dets tilhørende koloni. Efter at have identificeret kolonien, kan fænotype hentes ved at vælge de koloni fra den identificerede petriskål. </li><li> Filter fejl i den automatiske analyse af Choosynge en koloni og klikke på knappen udelukke. Når du klikker udelukke antallet af kolonien bliver gul. </li></ol></li><li> Efter at have gået gennem resultaterne af analysen af ​​hver plade, opsummere resultaterne: <ol><li> Kør AddHistograms at skabe et histogram af udseende tider. </li><li> Kør plotDeathCurve at skabe en overlevelse kurve repræsentation af distributionen. </li><li> Kør GetAppearanceTimes at få udseendet tid for alle kolonier i eksperimentet. </li></ol></li></ol></li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Bochner, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+phenotypic+characterization+of+bacteria.">Global phenotypic characterization of bacteria.</a> FEMS Microbiol Rev. 33, 191-205 (2009).</li><li>Monod, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+growth+of+bacterial+cultures.">The growth of bacterial cultures.</a> Annual Reviews in Microbiology. 3, 371-394 (1949).</li><li>Penfold, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+Nature+of+Bacterial+Lag.">On the Nature of Bacterial Lag.</a> J Hyg (Lond. 14, 215-241 (1914).</li><li>Powell, E. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+rate+and+generation+time+of+bacteria,+with+special+reference+to+continuous+culture.">Growth rate and generation time of bacteria, with special reference to continuous culture.</a> J Gen Microbiol. 15, 492-511 (1956).</li><li>Elfwing, A., LeMarc, Y., Baranyi, J., Ballagi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Observing+growth+and+division+of+large+numbers+of+individual+bacteria+by+image+analysis.">Observing growth and division of large numbers of individual bacteria by image analysis.</a> Applied and Environmental Microbiology. 70, 675-678 (2004).</li><li>Hertog, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simplified+automated+image+analysis+for+detection+and+phenotyping+of+Mycobacterium+tuberculosis+on+porous+supports+by+monitoring+growing+microcolonies.">Simplified automated image analysis for detection and phenotyping of Mycobacterium tuberculosis on porous supports by monitoring growing microcolonies.</a> PloS one. 5, (2010).</li><li>Levin-Reisman, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+imaging+with+ScanLag+reveals+previously+undetectable+bacterial+growth+phenotypes.">Automated imaging with ScanLag reveals previously undetectable bacterial growth phenotypes.</a> Nature Methods. 7, (2010).</li><li>Lewis, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persister+cells.">Persister cells.</a> Annual review of microbiology. 64, 357-372 (2010).</li><li>Metris, A., George, S. M., Baranyi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+optical+density+detection+times+to+assess+the+effect+of+acetic+acid+on+single-cell+kinetics.">Use of optical density detection times to assess the effect of acetic acid on single-cell kinetics.</a> Applied and Environmental Microbiology. 72, 6674-6679 (2006).</li><li>Niven, G. W., Fuks, T., Morton, J. S., Rua, S. A. C. G., Mackey, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+method+for+measuring+lag+times+in+division+of+individual+bacterial+cells+using+image+analysis.">A novel method for measuring lag times in division of individual bacterial cells using image analysis.</a> Journal of Microbiological Methods. 65, 311-317 (2006).</li><li>Niven, G. W., Morton, J. S., Fuks, T., Mackey, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+environmental+stress+on+distributions+of+times+to+first+division+in+Escherichia+coli+populations,+as+determined+by+digital-image+analysis+of+individual+cells.">Influence of environmental stress on distributions of times to first division in Escherichia coli populations, as determined by digital-image analysis of individual cells.</a> Applied and Environmental Microbiology. 74, 3757-3763 (2008).</li><li>Pin, C., Baranyi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+and+population+lag+times+as+a+function+of+cell+age.">Single-cell and population lag times as a function of cell age.</a> Applied and Environmental Microbiology. 74, 2534-2536 (2008).</li><li>Guillier, L., Pardon, P., Augustin, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+stress+on+individual+lag+time+distributions+of+Listeria+monocytogenes.">Influence of stress on individual lag time distributions of Listeria monocytogenes.</a> Applied and Environmental Microbiology. 71, 2940-2948 (2005).</li><li>Metris, A., George, S. M., Peck, M. W., Baranyi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution+of+turbidity+detection+times+produced+by+single+cell-generated+bacterial+populations.">Distribution of turbidity detection times produced by single cell-generated bacterial populations.</a> Journal of Microbiological Methods. 55, 821-827 (2003).</li><li>Balaban, N. Q., Merrin, J., Chait, R., Kowalik, L., Leibler, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+persistence+as+a+phenotypic+switch.">Bacterial persistence as a phenotypic switch.</a> Science. 305, 1622-1625 (2004).</li><li>Glaser, D. A., Wattenburg, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+automated+system+for+the+growth+and+analysis+of+large+numbers+of+bacterial+colonies+using+an+environmental+chamber+and+a+computer-controlled+flying-spot+scanner.">An automated system for the growth and analysis of large numbers of bacterial colonies using an environmental chamber and a computer-controlled flying-spot scanner.</a> Ann N Y Acad Sci. 139, 243-257 (1966).</li><li>Guillier, L., Pardon, P., Augustin, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+image+analysis+of+bacterial+colony+growth+as+a+tool+to+study+individual+lag+time+distributions+of+immobilized+cells.">Automated image analysis of bacterial colony growth as a tool to study individual lag time distributions of immobilized cells.</a> Journal of Microbiological Methods. 65, 324-334 (2006).</li><li>Michel, J. B., Yeh, P. J., Chait, R., Moellering, R. C., Kishony, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+interactions+modulate+the+potential+for+evolution+of+resistance.">Drug interactions modulate the potential for evolution of resistance.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 14918-14923 (2008).</li><li>Ernebjerg, M., Kishony, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+Growth+Strategies+of+Soil+Bacteria+as+Revealed+by+Large-Scale+Colony+Tracking.">Distinct Growth Strategies of Soil Bacteria as Revealed by Large-Scale Colony Tracking.</a> Applied and Environmental Microbiology. 78, 1345-1352 (2012).</li><li>Rotem, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+phenotypic+variability+by+a+threshold-based+mechanism+underlies+bacterial+persistence.">Regulation of phenotypic variability by a threshold-based mechanism underlies bacterial persistence.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 12541-12546 (2010).</li><li>Bigger, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+bactericidal+action+of+penicillin+on+staphylococcus+pyogenes.">The bactericidal action of penicillin on staphylococcus pyogenes.</a> Irish Journal of Medical Science. 19, 585-595 (1944).</li><li>Hofsteenge, N., van Nimwegen, E., Silander, O. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+persister+fractions+suggests+different+mechanisms+of+formation+among+environmental+isolates+of+E.+coli.">Quantitative analysis of persister fractions suggests different mechanisms of formation among environmental isolates of E. coli.</a> BMC Microbiol. 13, 25 (2013).</li><li>Moyed, H. S., Bertrand, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hipa+a+Newly+Recognized+Gene+of+Escherichia-Coli+K-12+That+Affects+Frequency+of+Persistence+after+Inhibition+of+Murein+Synthesis.">Hipa a Newly Recognized Gene of Escherichia-Coli K-12 That Affects Frequency of Persistence after Inhibition of Murein Synthesis.</a> Journal of Bacteriology. 155, 768-775 (1983).</li><li>Balaban, N. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persistence:+mechanisms+for+triggering+and+enhancing+phenotypic+variability.">Persistence: mechanisms for triggering and enhancing phenotypic variability.</a> Current Opinion in Genetics &amp; Development. 21, 768-775 (2011).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Mikroskopiske metoder baseret på direkte observation er ofte betragtes som den &quot;gyldne standard&quot; for at studere single-celle adfærd. ScanLag, som muliggør måling af fordelingen af ​​lag gange i bakterielle populationer indeholder data i god overensstemmelse med fordelingen fås fra encellede analyse og opnår meget højere statistik. Flere kritiske trin skal udføres for at denne metode fungerer godt: første, ikke på kompromis med scannerens opløsning, som bør være 4.800 x 9.600 for at få gode billeder. For det andet, være opmærksom på, at uden strømstyring modul (trin 1.6), kan temperaturgradient udvikle på flatbed overflade og påvirke væksten. Et andet vigtigt skridt er filtrering af fejl såsom støv, der kan have været fejlagtigt regnes som kolonier af softwaren. Den indbyggede baggrund fratrækning af software normalt overvinder disse mangler, men nogle gange &quot;falske&quot; kolonier nødt tilmanuelt filtreret. De vigtigste fejlfindingstrin kan løse inter-plade variation i opsætningen, på grund af flere årsager: (a) Vækstraten af ​​mikroorganismer påvirkes af temperaturen. Forskellige temperatur-og fugtighedsforhold kan opstå på grund af ujævn ventilation eller placering af skålen i inkubatoren. (B) elektronik scanneren kan opvarme op og forårsage en temperaturgradient hen over overfladen af scanneren 10 viser indflydelsen af en sådan rumlig varme gradient på Bacillus bakterier sammen med målinger af temperaturen på scannerens overflade før og. Figur efter gennemførelsen af ​​power management modul (trin 1.6). Bemærk, der måske ikke være nødvendigt for nyere scannere dette modul og hvis kun en del af scannerens overflade anvendes, kan strømstyring være unødvendig. (C) Plader med forskellig opacitet agar næringsstof kan føre til forskellige niveauer for afsløring. Figur 11 viser the tolerance over for forskellige mængder af næringsstof agar, der resulterer i forskellige opaciteter. Eksperimentelt ScanLag teknik er let at udføre og kræver kun til plade mikroorganismer på standard petriskåle, og at placere dem på scannerens overflade. Den software, der blev udviklet kontrollerer hele proceduren. Erhvervelse Billedet sker automatisk, og billedet analyse for koloni tracking er også automatisk. Desuden kan systemet skaleres op for at måle mange forskellige forhold på samme tid. Endelig har den metode bygger på kommercielle kontor scannere, og derfor er billig. Denne teknik kan udvides til studiet af mikroorganismer, som er forskellige fra E. coli K-12, men flere overvejelser skal foretages. Først indflydelse af tidlige optræder kolonier på de senere dem skal vurderes, som nærmere beskrevet i en tidligere publikation 7. For E. Coli K-12, denmaksimal tæthed af CFU per plade er 200. Andre stammer med forskellige størrelser af kolonier, og andre mulige krydstale mellem kolonier, kan kræve en anden tæthed. For det andet er analysen af ​​pladerne kalibreret til specifikke software-baserede tærskler, der måske skal ændres, afhængigt af kontrasten mellem det faste medium og kolonierne. Softwaren kan udvides til også at udvinde andre koloni egenskaber, ud over lag og vækstrate. Den software kode er åben og kan modificeres til at udtrække koloni form, lysstyrke, glathed og farve. Fordi målinger er foretaget på kolonier, der stammer fra enkelte celler, de data viser nye fænotyper, der ikke kan måles med målinger befolkning niveau. Betydningen af ​​latenstiden fordelingen er åbenbaret i tilstedeværelse af antibiotika. Mange antibiotika er kendt for at være effektiv kun mod voksende celler; derfor, så længe celler forbliver i lag-fase og ikke vokser, er de probeskyttet mod virkningerne af disse antibiotika 21. Når antallet af efterladte bakterier evalueres på tidsintervaller under antibiotikabehandling 15,22,23 er en delpopulation af bakterier, kaldet persisters ofte afsløret. I visse tilfælde, immunitet over for behandling med antibiotika stammer fra langvarig forsinkelse. Ved at bruge denne opsætning, er denne forsinkelse afsløret, og ofte har en ikke-triviel fordeling 24 (figur 6). Denne metode gør det muligt også at hente sjældne mutanter. For eksempel, efter udpladning en mutageniseret population, kan identificeres mutanter baseret på fænotype og isoleres direkte, uden selektion. Opsætningen kan også overvåge celle-celle-interaktioner ved at måle væksten af ​​kolonier som en funktion af densiteten af ​​nærliggende kolonier og kvantificere fænomener såsom quorum sensing eller spredning af sværme bakterier. Multidimensional oplysninger afsløret ved fremtidige eksperimenter ved hjælp af denne metode vil føre til en bedre karakterisering af mikrobielle populations og fremskridt inden for medicinsk og miljøforskning.

Bakterier har udviklet sig til at reagere på mange stressende forhold. Et generelt træk ved tilpasning til stress er en ændring i vækstdynamikker 1,2. Vækstdynamik er for det meste præget af to parametre: den eksponentielle vækst rate og latenstiden, nemlig den nødvendige tid til at tilpasse sig nye vilkår. At en stor del af high throughput metoder fokuserer på målinger af tilvækst, forsinkelse tid er ofte en overset parameter, selv om det er den afgørende parameter for karakterisering af tilpasning til nye forhold. Kvantificering af tilpasningen til ændrede vilkår har traditionelt været udført ved hjælp af besværlige manuelle metoder 3,4. For nylig er der blevet udviklet avancerede teknikker til analyse af enkeltceller 5,6. Men det er stadig svært at skelne mellem normal vækst efter en forsinkelse i vækst (nemlig en forsinkelse tid) 2,3 fra langsom vækst. En automatiseret metode blev bygget, ScanLag 7, tildiskriminere mellem disse to lignende fænotyper. Et slående eksempel på betydningen af ​​den undersøgelse af forsinkelse tid fordeling afsløres under behandling med antibiotika. Mange antibiotika og andre belastninger dræber kun aktivt voksende celler, og derfor celler, som &quot;halter&quot; er beskyttet 8. At overvåge forsinkelse tid, kan man observere enkelte celler under et mikroskop og overvåge tid til første division. En væsentlig ulempe ved denne fremgangsmåde er, at den dynamiske tid er begrænset; de celler, der vokser tidligt dække overfladen med en eksponentiel hastighed, effektivt at nedsætte væksten af ​​celler med længere tidsforsinkelse. Anvendelse af strømningskamre noget omgår denne 5, men af et begrænset antal celler kan spores og ikke kan observeres den fraktion af bakterier, der kommer ud af lag-fasen, efter at størstedelen af befolkningen er begyndt at vokse. Trods disse begrænsninger har flere undersøgelser evalueret indflydelse af niveauet af different understreger på halter tid fordeling anvendes enkelt celle mikroskopi 9-12. En anden måde at overvåge forsinkelse tid fordeling er gennem turbiditetsmålinger 13,14. Mange parallelle kulturer, hver startet fra en enkelt celle, dyrkes i en optisk densitet læser, der måler antallet af bakterier i kulturen over tid. Denne metode er begrænset af præcisionen af ​​ekstrapolation og antallet af brønde i en plade. En automatiseret metode blev udviklet, kaldet ScanLag, der gør det muligt lag gange og vækst tid distributioner, der skal vurderes, selv for den lille procentdel af bakterier i en befolkning, der har meget lange lag gange. Metoden er baseret på påvisning af kolonier på konventionelle næringsstoffer agarplader 15 (fig. 1). For at automatisere opdagelse 16,17 en vifte af kommercielle scannere 18, der er instrueret af i house software til periodisk erhverve billeder af pladerne blev manipuleret. Software vardesignet til automatisk at analysere billederne og udtrække kvantitative parametre 19,20, såsom tidspunktet for fremkomsten af hver koloni og vækst for hver koloni, som her er defineret som tiden til at vokse fra 20 pixels til 80 pixels. Her præsenterer vi metoden i detaljer, herunder opsætning af systemet og anvendelse af automatiseret billedanalyse-software, som er blevet forbedret med en bedre brugergrænseflade. Denne fremgangsmåde kan tilpasses til at måle andre karakteristika af kolonier, såsom morfologi og farve. Måling af disse typer af parametre vil give systemets anvendelse i flerdimensionale phenomics. Da metoden detekterer kolonier fra enkelte celler, kan systemet afsløre nye fænotyper, der ikke kan måles med målinger befolkning niveau. Teknikken gør det muligt at afsløre og genfinding af sjældne varianter, og letter screening for ønskede egenskaber.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="573">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Name of Material</td>
			<td style="width:71px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Bacto Agar</td>
			<td style="width:71px;">BD</td>
			<td align="right" style="width:119px;">214010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Difco LB broth</td>
			<td style="width:71px;">BD</td>
			<td align="right" style="width:119px;">240230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Petri dish 90mm</td>
			<td style="width:71px;">Miniplast</td>
			<td style="width:119px;">20090-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;"></td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Name of Equipment</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;width:216px;">Epson Perfection v37</td>
			<td style="width:71px;">Epson</td>
			<td style="width:119px;">B11B207201</td>
			<td style="width:167px;">Flatbed Scanner with Optical resolution: 4800 dpi, Hardware Resolution:&#160;4800 x 9600 dpi, color bit depth 48-bit.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Epson Perfection v200</td>
			<td style="width:71px;">Epson</td>
			<td style="width:119px;">B11B188011</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Epson Perfection 3490</td>
			<td style="width:71px;">Epson</td>
			<td style="width:119px;">B11B177011</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">ADU200 USB Relay</td>
			<td style="width:71px;">ONTRAK</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">pieces of sterile black felt cloth</td>
			<td style="width:71px;">custon made</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>approximatly 100 x100 mm</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">white plate holders</td>
			<td style="width:71px;">custon made</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>surface size, with 6 x 99mm diameter hole</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;">Delerin rings the size of the Petri dish</td>
			<td style="width:71px;">custon made</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">inner diameter: 72 mm 
			outer diameter: 86 mm 
			top outer diameter: 90 mm</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

scanlag: high-throughput quantification of colony growth and lag time

Growth dynamics are fundamental characteristics of microorganisms. Quantifying growth precisely is an important goal in microbiology. Growth dynamics are affected both by the doubling time of the microorganism and by any delay in growth upon transfer from one condition to another, the lag. The ScanLag method enables the characterization of these two independent properties at the level of colonies originating each from a single cell, generating a two-dimensional distribution of the lag time and of the growth time. In ScanLag, measurement of the time it takes for colonies on conventional nutrient agar plates to be detected is automated on an array of commercial scanners controlled by an in house application. Petri dishes are placed on the scanners, and the application acquires images periodically. Automated analysis of colony growth is then done by an application that returns the appearance time and growth rate of each colony. Other parameters, such as the shape, texture and color of the colony, can be extracted for multidimensional mapping of sub-populations of cells. Finally, the method enables the retrieval of rare variants with specific growth phenotypes for further characterization. The technique could be applied in bacteriology for the identification of long lag that can cause persistence to antibiotics, as well as a general low cost technique for phenotypic screens.

Som et eksempel på latenstid fordeling ekstraktion, Figur 5 viser evne ScanLag at identificere og spore hver koloni med specifikke egenskaber på en plade over tid, som det ville ske i et screeningsassay. Når kulturen af ​​mikroorganismen er heterogen, kan de forskellige subpopulationer afsløre sig selv i løbet af analysen. For eksempel viser figur 6 udseende kvantificering og viser således bimodale latenstid fordeling i en mutant stamme af E. coli. Væksten af ​​cellerne påvirker udseendet tidspunktet for kolonien. Når kolonier vokse i samme takt, kan den sene udseende tilskrives forsinkelse tid (figur 7). For at validere, at metoden rent faktisk måler forsinkelse tid af enkelte celler, vi sammenlignet ScanLag resultater med dem, der opnås ved hjælp af single-cell mikroskopi; denne validering er faldenderibed i detaljer i en tidligere publikation 7. Denne metode muliggør overvågning af mange flere celler end kan vurderes med mikroskopi. Fordelingerne opnået ved anvendelse af mikroskopi og opnået ved anvendelse ScanLag grad overlapper hinanden. Den ScanLag fordeling er lidt bredere; teoretiske analyser forudsige udvide til at være i størrelsesordenen standardafvigelsen af ​​divisionen tid. Hvis væksten tid er forskellig for hver stamme, skal oprindelsen af ​​forsinkelsen i udseende undersøges yderligere ved hjælp af andre metoder. Indflydelsen af ​​tidlige forekommende kolonier på udseendet af senere kolonier blev undersøgt. Kontrol eksperimenter 7 bekræftede, at senere udseende ikke blev påvirket, så længe det samlede antal kolonier per plade ikke overstige 200 (figur 8). En anden kontrol forsøg bekræftede, at placeringen af koloni på pladen ikke påvirker dens udseende tid 7. Analysen af ​​plates er kalibreret til specifikke tærskler, som måske har brug for modifikation afhængig af næringsstoffer i vækstmedium eller typen af ​​mikroorganisme. Alligevel kan analysen er ganske robust til en lang række tærskelværdier, som vist i figur 9. <img alt="Figur 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51456/51456fig1highres.jpg" width="500" /> Figur 1.. En skematisk diagram af de nødvendige skridt til at oprette en koloni udseende distribution. <img alt="Figur 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51456/51456fig2highres.jpg" width="500" /> Figur 2.. Et skærmbillede af Enhedshåndtering viser navnene på de vedhæftede scannere og på konfigurationsfilen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/5456/51456fig2highres.jpg" target="_blank">Klik her for at se et større</a>version af denne figur. <img alt="Figur 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51456/51456fig3highres.jpg" width="500" /> Figur 3.. Et skærmbillede af Scanning Manager. <img alt="Figur 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51456/51456fig4highres.jpg" width="500" /> Figur 4.. Et skærmbillede af ScanLagApp. Et billede af pladen er på venstre rude, og vækstkurver hver koloni er på rette rude, som beskrevet i manualen. Piggene i nogle af kolonierne området kurver opstår, når to eller flere kolonier fusionere. Når du fletter kolonier sker, er området af disse kolonier betragtes som det fælles område. <img alt="Figur 5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51456/51456fig5highres.jpg" width="500" /> Fig. 5. Et repræsentativt resultat af analysen af én plade. (A) Et billede af produktionen af ansøgningen detektion ved slutningen af eksperimentet. Hver koloni område er identificeret, farvet og tildeles med et unikt id-nummer. Pilene peger på repræsentative kolonier målt i B. Kolonien detekteres baseret på intensitet tærskel (For E. coli kolonier på LB-agar eller M9-agar denne tærskel er 0.03. For andre medier eller bakterier, denne grænse kan justeres i funktionen ProcessPictures ). Kun genstande over 10 pixels tælles (denne tærskel kan ændres i funktionen MatchColonies). Påvisning af en koloni starter ved ca 10 5 bakterier. (B) Plots af området i pixels versus tid af fire repræsentative kolonier i denne plade. Den &quot;udseende tid« i hver koloni er, når der registreres kolonien. Den &quot;vækst tid« i hver koloni er her defineret som den tid til at vokse tilbagem 20 pixel til 80 pixel (disse grænser er justerbare ved hjælp af funktionen getAppearanceGrowthByVec). Den software udelukker kolonier, der flettes før de når den øvre grænse. Identifikation af en bestemt koloni i henhold til dets karakteristika er nemt takket være identifikationsnummer og farven tildelt hver koloni. For eksempel kolonier nr. 1, 56, 77 og 124 er fremhævet i begge grafer. <img alt="Figur 6" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51456/51456fig6highres.jpg" width="500" /> Figur 6.. Udseende kvantificering kan afsløre bimodal forsinkelse tid distribution. Sammenligning af ScanLag analyse histogrammer udseende tider for to forskellige stammer. Blå linje: vildtypestamme eksponentielt voksende (Total: 1.320 kolonier); red line-høj persistens mutant beriget med halter bakterier (Total: 1.529 kolonier). (A) Normaliseret udseende histogrammer. Den maksimaleudseende af eksponentielt voksende celler er den typiske tid til at vokse til en påviselig koloni. Indsat: samme histogram mutantstammen efter subtraktion tidspunktet for toppen af ​​den eksponentielle kultur at få den faktiske tidsforsinkelse på log fordelte placeringer viser den bimodale latenstid distribution. (B) Overlevelse funktion af de samme data som i (A) på en logaritmisk skala. Denne repræsentation forbedrer den sene udseende halen af ​​mutantstammen. <img alt="Figur 7" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51456/51456fig7highres.jpg" width="500" /> Figur 7. Udseende fordeling og vækst tid distribution. (A) og (B) viser todimensionelle histogrammer for udseendet tid og vækst, da de to forskellige betingelser (Softwaren udelukker kolonier, der flettes før de når den øvre grænse). (C) Sammenligning af histogrammeraf de to stammer viser forskellen i udseende tid, mens væksten tidspunkter (D) er ens. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51456/51456fig7highres.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a> <img alt="Figur 8" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51456/51456fig8highres.jpg" width="500" /> Figur 8. Udseende første kolonier ikke interfererer med udseendet af senere kolonier. (A) latenstid fordeling af vildtypeceller udpladet alene. (B) halter tid fordeling af en kold følsom stamme alene, efter overførsel til tolerant temperatur. (C) halter tid fordeling af begge stammer belagt sammen under de samme betingelser. Den sorte linje repræsenterer den forventede fordeling baseret på data opnået ved måling hver stamme separat. En god enGreement mellem forventede og målte fordelinger opnås, så længe det samlede antal kolonier per plade er under 200. <img alt="Figur 9" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51456/51456fig9highres.jpg" width="500" /> .. Figur 9. detektionsgrænsen ikke påvirke formen af kolonien udseende fordeling Kolonien udseende fordeling blev analyseret for de samme datasæt ved hjælp af to forskellige tærskelværdier størrelser; (A) tærskel størrelse er 10 pixels; (B) tærskel størrelse er 50 pixels. Antallet af celler pr histogram: ca. 1.500. Den anden tærskel opdagelse resulterer kun i en forskydning af afsløring tid. <img alt="Figur 10" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51456/51456fig10highres.jpg" width="500" /> Figur 10.. Temperaturstabilitet målinger across scannerens overflade. (A) Billede af en plade med kolonier af Bacillus subtillis dyrkes på scanneren uden Power Management. Overfladen er varmere på bunden og derfor kolonierne at vokse hurtigere. Den gradvise linje ved siden af ​​pladen er en skematisk repræsentation af varmen gradient. (B) Stabiliteten temperatur blev målt med to termoelementer placeret over scannerens overflade. Scanneren varmer op under hver scanning, og over tid. (C) Med Power Management, temperaturen er ensartet og kolonierne vokser på lignende satser. (D) Samme som (B) med Power Management-modulet. Temperaturstabilitet på ± 0,2 ° C. <img alt="Figur 11" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51456/51456fig11highres.jpg" width="500" /> Fig. 11. Forskelle i udseendet fordeling kan skyldes differences i mængderne af fast medium. Den samme bakteriekultur blev udpladet på plader med forskellige mængder af LB-agar, hvilket resulterer i en forskellig højde af agaren. De forskellige højder ført til forskellig opacitet af pladerne og dermed en anden påvisning tid. Den inter plader Forskellen blev kontrolleret, og forskellen mellem de forskellige højde forhold. (A) Typiske forskelle mellem plader af lige store volumener af 30 ± 0,5 ml LB agar. (B) Forskel mellem forskellige højde betingelser: udseendet blev målt til tallerkener med mængder af 20 ± 0,5 ml (rød), på 30 ± 0,5 ml (grøn) og på 40 ± 0,5 ml (blå). Hver tilstand er gennemsnittet af 6 forskellige plader. Så længe mængden af ​​pladerne er inden for ± 5 ml rækkevidde, opaciteten er ens og fører til ens udseende tid distribution.

Watch this Scientific Journal Video about ScanLag: High-throughput Quantification of Colony Growth and Lag Time at JoVE.com

ScanLag: High-throughput Quantification of Colony Growth and Lag Time

ScanLag is a high-throughput method for measuring the delay in growth, namely lag time, as well as the growth rate of colonies for thousands of cells in parallel. Screening using ScanLag enables the discrimination between long lag-time and slow growth at the level of a single variant.

ScanLag: High-throughput Kvantificering af Colony vækst og Latenstid

Growth dynamics are fundamental characteristics of microorganisms. Quantifying growth precisely is an important goal in microbiology. Growth dynamics are ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

High-throughput Detection Method for Influenza Virus

High-throughput Detection Metode til Influenza Virus

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, ...

Quantitative High-throughput Single-cell Cytotoxicity Assay For T Cells

Kvantitativ Højkapacitetsforskning encellede cytotoksicitetsassay for T-celler

Cancer immunotherapy can harness the specificity of  immune response to target and eliminate tumors. Adoptive cell therapy (ACT)  based on the adoptive ...

A Microscopic Phenotypic Assay for the Quantification of Intracellular Mycobacteria Adapted for High-throughput/High-content Screening

En mikroskopisk fænotypisk analyse til kvantificering af intracellulære mycobakterier tilpasset til screening med højt gennemløb/højt indhold

Despite the availability of therapy and vaccine, tuberculosis (TB) remains one of the most deadly and widespread bacterial infections in the world. Since ...

High-throughput Screening for Broad-spectrum Chemical Inhibitors of RNA Viruses

High-throughput Screening for Bredspektret Chemical hæmmere af RNA virus

RNA viruses are responsible for major human diseases such as flu, bronchitis, dengue, Hepatitis C or measles. They also represent an emerging threat ...

High-throughput Quantitative Real-time RT-PCR Assay for Determining Expression Profiles of Types I and III Interferon Subtypes

High-throughput kvantitativ real-time RT-PCR assay til bestemmelse Expression Profiler af type I og III Interferon Undertyper

Described in this report is a qRT-PCR assay for the analysis of seventeen human IFN subtypes in a 384-well plate format that incorporates highly specific ...

High-throughput Gene Tagging in Trypanosoma brucei

High-throughput Gene Tagging in Trypanosoma brucei

High-throughput Gene Tagging i<em&gt; Trypanosoma brucei</em

Improvements in mass spectrometry, sequencing and bioinformatics have generated large datasets of potentially interesting genes. Tagging these proteins ...

High Throughput, Real-time, Dual-readout Testing of Intracellular Antimicrobial Activity and Eukaryotic Cell Cytotoxicity

Højt gennemløb, realtid, Dual-udlæsning Test af Intracellulær antimikrobielle aktivitet og eukaryote celle cytotoksicitet

Traditional measures of intracellular antimicrobial activity and eukaryotic cell cytotoxicity rely on endpoint assays. Such endpoint assays require ...

A Fluorescence-based Lymphocyte Assay Suitable for High-throughput Screening of Small Molecules

En Fluorescens-baserede lymfocyt Assay Egnet til high-throughput screening af små molekyler

High-throughput screening (HTS) is currently the mainstay for the identification of chemical entities capable of modulating biochemical reactions or ...

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

En høj overførselshastighed Platform for Screening af Salmonella spp. /Shigella spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella ...

High-throughput Measurement of Plasma Membrane Resealing Efficiency in Mammalian Cells

Høj overførselshastighed måling af Plasma membran genforsegling effektivitet i pattedyrceller

In their physiological environment, mammalian cells are often subjected to mechanical and biochemical stresses that result in plasma membrane damage. In ...