Name: cryo-electron microscopy specimen preparation by means of a focused ion beam
Uploaded: 2014-07-26T15:00:00
Duration: 10 min 54 s
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इस शोध FP7 क्षमताओं कार्यक्रम (अनुदान सं इंफ्रा-2010-262163) के तहत यूरोपीय समुदाय रिसर्च इंफ्रास्ट्रक्चर्स द्वारा वित्त पोषण किया है जो QNano परियोजना http://www.qnano-ri.eu से समर्थन प्राप्त है. हम भी वित्तीय सहायता के लिए अनुसंधान परिषद Formas धन्यवाद.

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लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

इस प्रोटोकॉल आरटी पर भौतिक विज्ञान में प्रयोग किया जाता मानक मिथ्या / मंदिर नमूना तैयार करने के क्रायोजेनिक तापमान के एक नहीं बल्कि सीधा रूपांतरण है. नमूना सतह inhomogeneous है अगर Curtaining को हो सकती है, हालांकि विधि, यांत्रिक विरूपण और चाकू के निशान (microtomy के प्रमुख दोष) से ​​मुक्त मंदिर नमूने पैदा करता है. यह चिकनी और 13 कुरूप है जब तक यह ठीक एक कैपिंग परत (इस काम में पं. इस्तेमाल किया गया था), के क्रायो बयान के द्वारा कम किया जा सकता है. बहुत अलग कठोरता के घटकों के साथ नमूने वे तैयारी के दौरान तनाव में तोड़ना होगा कि जोखिम के बिना के रूप में अच्छी तरह से तैयार किया जा सकता है. आंतरिक तनाव अभी भी पतली लामेल्ला खंड का आकार कम किया जा सकता है, जो मामले में मोड़ या कर्ल कारण हो सकता है. अन्य विधि की तुलना में एक खामी की वजह से आयन बीम और नमूना में आयनों के संभावित आरोपण के लिए जोखिम के लिए जैविक संरचना को बदलने की संभावना है. ये कमियां भी नमूना prepar के लिए आरटी पर घटितविज्ञान सामग्री 15 में समझना. वे आयनों (500-1,000 वी) के लिए सबसे कम त्वरक वोल्टेज में एक अंतिम चमकाने कदम के साथ thinning पूरा करके कम किया जा सकता है. यह बहुत ही सौम्य चमकाने कदम लामेल्ला से क्षतिग्रस्त परत को हटा देगा. कारण क्रायो बयान (3.5, 3.10 और 3.13 कदम) की प्रकृति के कारण, नमूना के बड़े हिस्से जिससे मूल सतह से देखने में बाधा डालने, शामिल किया जाएगा. यह कदम 3.3 में सुझाव के रूप में कई चिह्नों उपयोग किया जाता है जब तक कि यह मुश्किल है, आरओआई का ट्रैक रखने के लिए कर सकते हैं. कदम हवा के संपर्क में आने 4.5 और 4.7 पतली लामेल्ला जोखिम के दौरान. यह यह संभवतः महत्वपूर्ण सुविधाओं obscuring के मुद्दे पर, नमूना की सतह पर बर्फ क्रिस्टल फार्म हवा में नमी के कारण होता है के रूप में बचा जाना पड़ता है. उन कदमों के रूप में जल्दी संभव के रूप में किया जाना चाहिए, लेकिन एक ही समय में स्थानांतरण के दौरान एक mishandling नमूना के नुकसान में परिणाम की संभावना है यहस्व. यह उपयोगकर्ता एक असली नमूना पर एक प्रयास किया है पहले खाली मंदिर ग्रिड का उपयोग करके उन कदमों प्रथाओं की सिफारिश की है. सामग्री विज्ञान में, मिथ्या साधन इसके व्यावसायीकरण की एक दशक के भीतर मंदिर नमूना तैयार की प्रमुख तरीका बन गया है. यह लगभग किसी भी नमूना पर इस्तेमाल किया जा सकता है, यह नमूना के प्रकार के लिए तैयारी तकनीक से तैयार करने की जरूरत को हटाता है. हम दृढ़ता से एक ही है, क्रायोजेनिक तापमान पर यहाँ विस्तृत प्रक्रिया को धन्यवाद भी हो सकता है. बड़े नमूनों के लिए अपने आवेदन अभी भी क्रायो बनाए रखने के एक vitrified राज्य में उन्हें करने की क्षमता के अधीन है, लेकिन 3,5 ठंड ऐसे डुबकी ठंड या उच्च दबाव के रूप में तकनीक इस समस्या के लिए इष्टतम समाधान साबित हो सकता है.

इस प्रोटोकॉल में एक cryo-FIB/SEM पहले SEM विश्लेषण द्वारा उच्च परिशुद्धता के साथ पहचान के नमूने के एक विशिष्ट क्षेत्र से मंदिर के नमूनों का उत्पादन किया जाता है. जैविक नमूने के इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (स्कैनिंग या संचरण) विश्लेषण अनुसंधान और नैदानिक ​​के लिए प्रयोग किया जाता है एक नियमित तकनीक है. SEM बल्कि तेजी से और रोजगार और व्याख्या करने के लिए आसान है, लेकिन जानकारी ही नमूना सतह से और 1.5 एनएम रेंज में एक संकल्प के साथ प्राप्त की है. मंदिर में एक उच्च संकल्प है, लेकिन लागू करने के लिए और अधिक कठिन है, छवि विश्लेषण कम सीधा है और थोक में जानकारी प्राप्त की है, जबकि नमूने (लगभग 500 एनएम मोटी से कम) पारदर्शिता इलेक्ट्रॉन को पतला होना है. एक अतिरिक्त समस्या उन उपकरणों का वैक्यूम आवश्यकताओं को शायद ही कभी पानी युक्त नमूनों से बर्दाश्त कर रहे हैं. ज्यादातर मामलों में, जैविक नमूने रासायनिक (पॉलिमर, उदाहरण के लिए, के साथ पानी प्रतिस्थापन) निर्धारित या सूख जाना या तो है. करने के लिए दोनों ही मामलों में महत्वपूर्ण परिवर्तननमूना की आकृति विज्ञान और संरचना होने की संभावना है. हाइड्रेटेड नमूनों की क्रायो मंदिर तैयारी कम से कम रासायनिक परिवर्तन लाती है और यह बर्फ के कांच में रूपांतर 1-6 प्राप्त किया जाता है, खासकर अगर उनके मूल राज्य के लिए संभव के रूप में नमूने के रूप में करीब पैदा करता है. मिथ्या व्यापक रूप से इसके कई फायदे 7 के लिए मंदिर के नमूने तैयार करने के लिए प्रयोग किया जाता है. कुछ नाम हैं: लगभग सामान्य घटना पर उच्च ऊर्जा आयनों के उपयोग की सामग्री से संबंधित अंतर मिलिंग दर के प्रभाव को कम करता है; थोक नमूना से निकाले क्षेत्र एक उप माइक्रोन परिशुद्धता के साथ चुना जा सकता है; सामग्री की एक बहुत छोटी राशि निकाली गई है. कुछ हाल ही में तकनीकी विकास क्रायोजेनिक तापमान 2,8-10 पर मंदिर नमूना तैयार करने के लिए भी मिथ्या का उपयोग संभव बना दिया है. इस तरह कटा हुआ लामेल्ला के यांत्रिक विरूपण की कमी के रूप में मुलायम मामले के नमूने, के लिए मुख्य रूप से इस्तेमाल क्रायो microtomy 11,12 की पारंपरिक विधि तैयारी पर कई फायदे हैंकठिन / नरम इंटरफेस या घटकों के साथ मिश्रित नमूने तैयार करने के लिए चाकू के निशान और संभावना का अभाव.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="573">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Strata DB 235&#160;</td>
			<td style="width:71px;">FEI</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">FIB/SEM</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Omniprobe 100&#160;</td>
			<td colspan="2">Oxford Instruments&#160;</td>
			<td>nanomanipulator</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Alto 2500</td>
			<td style="width:71px;">Gatan</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>cryo preparation chamber</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">cryo-holder model 626</td>
			<td style="width:71px;">Gatan</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>cryo transfer TEM holder</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Tecnai F30</td>
			<td style="width:71px;">FEI</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>TEM</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cryo-electron microscopy specimen preparation by means of a focused ion beam

यहाँ हम Aspergillus नाइजर बीजाणुओं की क्रायो मंदिर नमूने तैयार करने के लिए इस्तेमाल एक प्रोटोकॉल मौजूद है, लेकिन आसानी से सूक्ष्मजीवों या समाधान के किसी भी संख्या के लिए अनुकूलित किया जा सकता है. हम एक कस्टम बनाया क्रायो हस्तांतरण स्टेशन और एक संशोधित क्रायो SEM तैयारी कक्ष 2 का इस्तेमाल करते हैं. बीजाणुओं एक तरल नाइट्रोजन कीचड़ में डुबकी से जमे हुए और ब्याज की एक क्षेत्र का चयन करने के लिए क्रायो SEM में मनाया, एक संस्कृति से ले रहे हैं. एक पतली लामेल्ला तो एक मंदिर ग्रिड से जुड़े और बाद में पारदर्शिता इलेक्ट्रॉन को पतला, मिथ्या का उपयोग कर निकाला जाता है. ग्रिड एक क्रायो मंदिर धारक के लिए और उच्च संकल्प के अध्ययन के लिए एक मंदिर में स्थानांतरित किया है. एक ठंडा nanomanipulator टिप और एक क्रायो हस्तांतरण स्टेशन की शुरुआत करने के लिए धन्यवाद, इस प्रोटोकॉल मंदिर नमूनों की नियमित रूप से इस्तेमाल मिथ्या तैयारी के क्रायोजेनिक तापमान के लिए एक सीधा रूपांतरण है. ऐसे में यह मौजूदा उपकरणों, setups और प्रक्रियाओं के लिए संशोधन की एक छोटी राशि की आवश्यकता के फायदे हैं; यह मैंलागू करने के लिए आसान है; यह सिद्धांत क्रायो मंदिर नमूना तैयार करने के लिए उसी के रूप में, आवेदन की एक व्यापक रेंज है. एक सीमा है कि यह संदूषण से बचने या कम करने के लिए महत्वपूर्ण कदम पर नमूनों के कुशल से निपटने की आवश्यकता है.

इस काम में हम का इस्तेमाल किया: एक nanomanipulator और एक क्रायो तैयारी कक्ष से लैस एक दोहरी बीम FIB / SEM; एक क्रायो हस्तांतरण धारक के साथ एक मंदिर; एक प्रोटोटाइप क्रायो हस्तांतरण स्टेशन. anticontaminator (एसी) क्रायो तैयारी चैंबर के ब्लेड और nanomanipulator (समुद्री मील) की नोक Gatan द्वारा संशोधित किया गया है. एक मानक क्रायो तैयारी चैम्बर के लिए सम्मान के साथ, एसी ब्लेड समुद्री मील दूर टिप के लिए अधिक से अधिक गर्मी सिंक प्रदान करने के लिए बड़े होते हैं. इसके अलावा, एसी समुद्री मील दूर टिप के साथ गर्मी विनिमय के लिए घन braids जोड़ने के लिए clamps के साथ लगाया जाता है. मिथ्या / SEM की Pneumatics समुद्री मील दूर होने की अनुमति संशोधित किया गया है और नमूना कक्ष निकाल रहा था, तब भी जब डाला रहते हैं. यह इस काम में इस्तेमाल मापदंडों सबसे अच्छा ऊपर सूचीबद्ध उपकरणों के लिए अनुकूल हैं कि ध्यान दिया जाना चाहिए; उन मानकों उपकरणों के अन्य प्रकार के साथ कार्य करते समय समायोजित करने की जरूरत हो सकती है. इस प्रोटोकॉल के साथ काम करने के लिए, cryogenics से निपटने के लिए सामान्य सावधानियों, तरल नाइट्रोजन और वैक्यूम सिस्टम होना चाहिएपीछा किया. विधि समाधान या नैनोकणों युक्त बहुलक matrices से, नेमाटोड के लिए एक कोशिकीय जीव से लेकर, अच्छे परिणामों के साथ नमूने के विभिन्न प्रकारों पर परीक्षण किया गया है. प्रक्रिया के विभिन्न चरणों के उदाहरण ए पर आंकड़े 1-12 में सचित्र हैं नाइजर बीजाणुओं आज़मियम tetroxide और पोटेशियम परमैंगनेट के साथ दाग. बीजाणुओं पहले निकासी के लिए साइट की पहचान करने के लिए (चित्रा 1) SEM ने उतारी जाती है. इस मामले में, किसी भी बीजाणु के एक क्रॉस सेक्शन पर्याप्त था, लेकिन यह करने के लिए उप सुक्ष्ममापी परिशुद्धता के साथ निकासी के लिए लागत पर लाभ की स्थिति उदाहरण के लिए, कोशिका झिल्ली से एक विशिष्ट दूरी पर एक विशेष सेल टुकड़ा करने के लिए संभव है. ब्याज की सुविधा पहचान हो जाने के बाद, क्रायो पं. बयान की दिशा में पहला कदम आयन मिलिंग से किरण नुकसान से नमूना की रक्षा के लिए, चित्रा (2) लागू किया गया है. नमूना पहला कदम ओ के साथ आगे बढ़ने के लिए 52 डिग्री तक झुका हुआ हैच मिलिंग (चित्रा 3): लामेल्ला के दोनों किनारों पर दो खाइयों के sputtering. नमूना फिर वापस झुका हुआ है और आगे थोक को जोड़ने केवल दो छोटे पुलों (चित्रा 4) छोड़ने के लिए milled है. ठंडा nanomanipulator लामेल्ला के साथ संपर्क (चित्रा 5) और पीटी के एक और क्रायो बयान उन्हें एक साथ solders (चित्रा 6) में लाया जाता है. छोटे जोड़ने पुलों तो दूर milled और समुद्री मील दूर मंदिर ग्रिड की कुर्की क्षेत्र यह पंडित के अंतिम क्रायो बयान चित्रा (8) के साथ soldered है जहां चित्रा (7), निकट लामेल्ला कदम हैं. समुद्री मील दूर तो आयन बीम के साथ पारदर्शिता (चित्रा 10 और 11) इलेक्ट्रॉन के लिए नीचे पतला है जो लामेल्ला (9 चित्रा) से अलग है. लामेल्ला अंत में मंदिर (12 चित्रा) को सौंप दिया है, जहां उच्च संकल्प इमेजिंग, स्पेक्ट्रोस्कोपी, टोमोग्राफी और अन्य तकनीकों can नियोजित किया. <img alt="चित्रा 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51463/51463fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51463/51463fig1.jpg" /> चित्रा 1. ए के बीजाणुओं की क्रायो SEM छवि पं. बयान से पहले नाइजर,. <img alt="चित्रा 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51463/51463fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51463/51463fig2.jpg" /> चित्रा 2. पं. बयान के बाद चित्रा 1 में, लेकिन इलाज से पहले ही क्षेत्र. <img alt="चित्रा 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51463/51463fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51463/51463fig3.jpg" /> चित्रा 2 में एक ही क्षेत्र के चित्रा 3. क्रायो SEM छवि, खाई मिलिंग के साथ, पं. बयान और इलाज के बाद, 52 डिग्री झुका चल(3.7 कदम देखें). <img alt="चित्रा 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51463/51463fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51463/51463fig4.jpg" /> लिफ्ट से बाहर के लिए तैयार चित्रा 4. लामेल्ला,. <img alt="चित्रा 5" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51463/51463fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51463/51463fig5.jpg" /> चित्रा 5. ठंड nanomanipulator टिप लामेल्ला के साथ संपर्क में आता है. <img alt="चित्रा 6" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51463/51463fig6highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51463/51463fig6.jpg" /> चित्रा 6. एक दूसरे पं. क्रायो बयान nanomanipulator और लामेल्ला एक साथ मिलाप के लिए प्रयोग किया जाता है. <isrc = &quot;/ files/ftp_upload/51463/51463fig7highres.jpg&quot; src = &quot;/ files/ftp_upload/51463/51463fig7.jpg&quot; /&gt;: के लिए सामग्री चौड़ाई = &quot;5in&quot;: के लिए मिलीग्राम alt = &quot;7 चित्रा&quot; चित्रा 7. ठंड nanomanipulator मंदिर ग्रिड की कुर्की क्षेत्र को लामेल्ला स्थानांतरित करने के लिए प्रयोग किया जाता है. <img alt="8 चित्रा" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51463/51463fig8highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51463/51463fig8.jpg" /> चित्रा 8. क्रायो बयान मंदिर ग्रिड को लामेल्ला संलग्न करने के लिए एक बार और अधिक प्रयोग किया जाता है. <img alt="9 चित्रा" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51463/51463fig9highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51463/51463fig9.jpg" /> चित्रा 9. लामेल्ला nanomanipulator से मुक्त कटौती और यह अब भंडारण या पारदर्शिता इलेक्ट्रॉन को thinning या तो के लिए तैयार है. <p class="jove_content" fo:keep-together.भीतर पृष्ठ = &quot;हमेशा&quot;&gt; <img alt="चित्रा 10" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51463/51463fig10highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51463/51463fig10.jpg" /> 10 चित्रा. Thinning के एक मध्यवर्ती कदम, क्रॉस सेक्शन में दिखाई कुछ बीजाणुओं के साथ. <img alt="11 चित्रा" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51463/51463fig11highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51463/51463fig11.jpg" /> . अंतिम thinning के बाद नमूना के 11 क्रायो SEM छवि आंकड़ा; अन्य बीजाणुओं की सबसे लामेल्ला कर्ल करना शुरू कर दिया था क्योंकि दूर milled किया जा सकता था. <img alt="चित्रा 12" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51463/51463fig12highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51463/51463fig12.jpg" /> 12 चित्रा. लामेल्ला का एक समग्र क्रायो मंदिर तस्वीर. अल ठूंठ का हिस्सा शामिल किया गया हैलामेल्ला (काला तीर) में.

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Cryo-electron Microscopy Specimen Preparation By Means Of a Focused Ion Beam

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Due to recent technological progress, cryo-electron microscopy (cryo-EM) is rapidly becoming a standard method for the structural analysis of protein ...

Biological Sample Preparation by High-pressure Freezing, Microwave-assisted Contrast Enhancement, and Minimal Resin Embedding for Volume Imaging

उच्च दबाव ठंड, माइक्रोवेव की सहायता के विपरीत वृद्धि, और मात्रा इमेजिंग के लिए ंयूनतम राल Embedding द्वारा जैविक नमूना तैयारी

The described sample preparation technique is designed to combine the best quality of ultrastructural preservation with the most suitable contrast for the ...