Name: cryo-electron microscopy specimen preparation by means of a focused ion beam
Uploaded: 2014-07-26T15:00:00
Duration: 10 min 54 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Cryo-electron Microscopy Specimen Preparation By Means Of a Focused Ion Beam at JoVE.com

Forskningen fick stöd från QNano Project http://www.qnano-ri.eu som finansieras av Europeiska gemenskapens forskningsinfrastruktur inom ramen för FP7 programmet Kapacitet (Grant No INFRA-2010 till 262.163). Vi tackar också forskningsrådet Formas för ekonomiskt stöd.

OBS: alla parametrar som anges i detta protokoll gäller för de instrument och modeller som anges här. Några av dessa parametrar (markerade med * i texten) kan skilja sig om en annan tillverkare eller modell används. 1. Uppstart av FIB / SEM <ol><li> Montera specialbyggd kall nanomanipulator (NM) spets utan att fästa Cu-flätor till anticontaminator (AC). Istället ser till flätor är anslutna till resten av NM ovanför isoleringspunkten för att förhindra laddning upp under skärpningssteget (1.2). <ol><li> Stäng SEM kammare, pumpar till högvakuum och bild på NM spetsen. </li><li> Om spetsen är trubbig, böjda eller förorenade av tidigare användning, skärpa den med hjälp av jonstrålen: välj polygonala hålbilder längs sidorna av spetsen, så att efter fräsning, kommer spetsen avsmalnar nedåt till en um eller mindre. </li><li> När sidorna hos spetsen har frästs bort, rotera genom 90 manuellt ° hela NM stångenutanför SEM kammare. </li><li> Justera polygonal fräsmönster för att anpassa sig till den roterade spetsen och upprepa fräsning från en annan vinkel. </li></ol></li><li> När spetsen har skärpts för att vara mindre än 1 mikrometer, dra tillbaka NM och för in nålen i Gas Injection (GIS); flytta nålen att vara på ca 1 mm ovanför arbetsavstånd (i stället för de vanliga 175 nm). </li><li> Om du använder en Pt gångare, ändra sin arbetstemperatur på 24-26 ° C (i stället för de vanliga 40 ° C). Dessa steg är nödvändiga för kryo-avsättning 13 av Pt. </li><li> Öppna SEM kammaren och förbereda FIB / SEM för kryo-läge genom att montera Cryo provstadiet och AC. </li><li> Växla NM till den insatta läge och anslut dess Cu-flätor till AC. Se till att inte oavsiktligt röra NM spetsen. Systemet kyls med NM in för att se till att förlusten av flexibilitet av Cu fläta vid låga temperaturer inte kommer att hämma NM flyttament. </li><li> Purge rören för kylning med torr kvävgas under ett par minuter. </li><li> Pumpa Cryo förberedelse kammaren och huvudprovkammaren till högvakuum. </li><li> Lägg flytande kväve till Dewars svalna båda kamrarna. Vänta tills den önskade temperaturen är nådd. </li></ol> 2. Prov Frysning <ol><li><ol><li> Montera två TEM galler för FIB prover på SEM överföringshållaren. Fäst dem genom att dra åt de motsvarande skruvarna med en skruvmejsel. </li><li> Montera en prov stöta lämpligt för provet och tillsätt en del av provet. Beroende på vilken typ av prov, kan provet fixeras med kryogen lim eller med en klämma. Använda mängder så små som möjligt för att säkerställa optimal infrysning. </li><li> Montera SEM överföringshållaren på vakuumöverföringsanordningen (VTD). </li></ol></li><li><ol><li> Lägg flytande kväve i slamningsstationen och pumpa ner för att få kväve slask. </li><li> Öppna slushing station och dopp-frysa SEM överföringshållaren. Pumpa ner igen tills kokning är klar och slask uppnås igen. Det bör noteras att en etan eller propån snöslask eller högtrycks frysning är bättre lämpade tekniker för att erhålla förglasning av provet. </li></ol></li><li><ol><li> Dra tillbaka SEM överföringshållaren i vakuumkammaren i VTD och försegla den. </li><li> Lufta slamningsstationen och Cryo förberedelse kammarluftsluss. </li><li> Matcha VTD tätning med luftslussen för Cryo förberedelse kammaren och pump. </li><li> När en god vakuumnivån uppnås, engagera luftslussen pin för att öppna sigill VTD och yttre luftslussen; sätt i SEM överföringshållaren. Det finns markeringar på glidkontakter i beredningskammare som anger provposition för sputtring och sprickbildning. </li></ol></li><li> Vid behov kan provet: bröt med den kalla kniven; sublimeras genom att ställa in en högre temperatur (vanligen -1006, C); belagd med Au / Pd eller Pt medelst kall sputterer (300 V, 10 mA, 60 sek efter en 2-3 nm Au / Pd cap) *. Sublimering bör inte användas för förglasat prov för att undvika deras omkristallisation. </li><li><ol><li> Använd den kalla kniven för att öppna de skyddande locken på TEM rutnät platser. </li><li> Ta den kalla steget i provkammaren till mottagningshöjd (16 mm *). </li><li> Stäng av HT på FIB / SEM och öppna det inre luftslussen. </li><li> Använd VTD att överföra SEM hållaren i provkammaren. Ljusreglering belysningen i rummet kan hjälpa i det här steget. </li><li> När SEM innehavaren i den kalla scenen, koppla ur VTD genom att trycka och vrida. </li><li> Dra tillbaka VTD staven hela vägen in i VTD vakuumkammaren och stänga den inre luftslussen, det yttre luftslussen och VTD sigill. Den yttre luftslussen kan nu ventileras för att avlägsna VTD tätning. Det sista steget är inte nödvändigt, men det rekommenderas som VTD stången kan lätt rubbas av misstag, vilket kan orsaka skadortill VTD eller luftslussen. </li></ol></li></ol> 3. Jonfräsning <ol><li> Slå på den höga spänningen på båda kolumnerna och ställ in lämplig bildparametrar (accelerationsspänning: 10 kV för elektronstrålen, 30 kV för jonstråle, spot storlek 3, arbetsavstånd: 5 mm, jonström: 10-100 pA för avbildning, 1-3 nA för fräsning) *. </li><li> Använd elektronstråle för att hitta en funktion av intresse och för att få bilder för att dokumentera statusen för provet före extraktionen av lamellen. </li><li> En gång har identifierat en region av intresse (ROI) för utvinning, markera den med jonstråle mönstring, om topografin av provet i sig möjliggör en enkel identifiering av ROI även efter Pt nedfall. För ökad precision, använd den metod som beskrivs av Pettersson et al. 14 Markeringarna ska vara djup, bred och tillräckligt långt för att vara fortfarande synliga efter att omfattas av Cryo-Pt deponering (som är icke-selektiva och kommer att omfatta flera mm 2 av provytan). </li><li> Värm upp den prekursorn gas till 24-26 ° C och för in GIS nålen till en höjd av ca 1 mm ovanför provets yta (se även steg 1,3). </li><li> Medan avbildning med elektronstråle, öppna gasventilen under några sekunder. Graden av kryo-Pt nedfall är 100-500 nm / sek eller mer, beroende på avståndet till GIS nål, prov strävhet och användarens system. Det är tillrådligt att köra några test nedfall att bestämma de optimala parametrar. </li><li> Rå Cryo-Pt nedfallet är mycket grov och inhomogena. Bota depositionen över ROI med hjälp av en 1000 pA jonstråle vid låg förstoring (t.ex. 2.000 X). Till skillnad från Cryo nedfall, är denna härdning webbplats selektiv och bör utföras på endast ROI. Syftet med denna första kryo-nedfallet är att skydda ytan av provet från jonstrålar skador och minska curtaining under jon gallring 13. </li><li> Vippa provet till52 °, så att ytan är vinkelrät mot jonstrålen. Mill bort två terrasse diken på vardera sidan av ROI. Typiska dimensioner för dikena är 20 till 30 um i den riktning (X) parallell med den lamell som skall extraheras, från 10 till 15 ^ m i den vinkelräta riktningen (Y) och med en variabel, sluttande djup (Z), med den djupaste punkten Nära till ROI. Lutningen bör vara 45-55 °. I vissa instrument kan terrasse diken endast malas med den djupaste punkten på toppen. I sådana fall, kvarn en under ROI, vrid sedan bilden 180 ° och kvarn den andra på den andra sidan. Djupet för fräsning kan väljas om sputter hastigheten för materialet är känd. För de flesta frysta hydratiserade provet kan sputter hastigheten is användas 7. </li><li> Luta provet tillbaka till 0 ° och använda jonstråle att skära bort sidorna och undersidan av lamellen, och se till att skära märken gå igenom hela lameller (de bör lämna fräsmärken på terrasserade sluttningar kvarnened i föregående steg). Lämna bara två små broar som förbinder lamellen till resten av provet. </li><li> Sätt i GIS nål (detta kan lätt flytta provet). Manöver NM tills dess spets är i fysisk kontakt med lamellen, helst på sidan. Se till NM inte hindrar jonstrålen tanke på de två små förbindningsbryggorna. </li><li><ol><li> Öppna GIS ventilen under ett par sekunder och övervaka kryo avsättning genom kontinuerlig avbildning med elektronstrålen. </li><li> När ytterligare 1-2 um skikt av Pt har Cryo-deponerats, stänga ventilen. </li><li> Cure Pt (se steg 2.6) endast i de få um runt den punkt där NM är i kontakt med lamellen. </li><li> Använd en hög jonstråleström att klippa lamellen gratis. De två anslutningsbroar ska fräsas bort, liksom varje överskott av Pt som kan ha bildats nya kontaktpunkter mellan lamell och resten av provet. Inte dra GIS ålen ännu. </li></ol></li&gt; <li> Försiktigt manövrera NM att extrahera lamell från dikena och flytta den åtminstone 500 um ovanför provets yta. Först efter att detta steg dras GIS nålen. </li><li> Sänk provet scenen några mm och flytta den till dess en av de TEM gallren är i sikte. Flytta fästarea på gallret in i arbetsläge och för in GIS nålen. </li><li><ol><li> Försiktigt manövrera NM att bringa den bifogade lamell i fysisk kontakt med fästområdet på TEM-rutnät. Det bör inte finnas något tryck eller spänning mellan lamellen, TEM galler och NM. </li><li> Öppna gasventilen för några sekunder och Cryo-insättning ytterligare 1-2 um skikt av Pt. </li><li> Cure Pt (se steg 2.6) endast i de få um runt kontaktpunkten mellan lamellen och TEM-rutnät. </li></ol></li><li> Använd ett högt jonström att skära lamellerna fritt från NM. Detta kan åstadkommas genom att mala bort antingen NM spetsen eller den sida av provet. I than första fallet kommer spetsen måste slipas igen innan nästa användning, såsom beskrivs i steg 1,2. </li><li> EXTRA: i detta skede är det möjligt att använda VTD att ta SEM överföringshållaren och förvara det O / N i en Dewar fylld med flytande kväve. Denna överföring och O / N lagring kan orsaka isbildning på ytan av lamellen om iskristaller redan finns och / eller om det flytande kvävet utsätts för fuktig luft; men sådana föroreningar kommer att tas bort av nästa steg i en relativt kort tid. Som de tidigare stegen kan ha tagit flera timmar att slutföra, kan det vara lämpligt att göra det, eftersom efter följande steg sådan lagring O / N rekommenderas inte, eftersom det inte skulle finnas något sätt att ta bort föroreningar isen utom genom sublimering (som kan inte utföras om förglasning av provet skall upprätthållas). </li><li> Luta provet till 52 ° och använder jonstrålen till tunna det till elektron öppenhet 7. Det rekommenderas att börja med högre, Roughennes jonstrålen för att ta bort huvuddelen och fortsätt att bötfälla polera ytan med lägre jonstrålen, så småningom också minska accelerationsspänning. Den slutliga tjockleken på lamellerna skall vara från 100 till 200 nm eller mindre för ultrastruktur analys i ett 100-200 kV TEM eller upp till 500 nm för tomografi i en 300 kV TEM, beroende på provets sammansättning. Under gallring, kan de inre spänningarna i provet orsakar lamellen att krypa eller böja. I ett sådant fall bör den region förtunnad begränsas. Detta hände till exempel i figurerna 11 och 12. </li></ol> 4. Cryo Transfer till TEM <ol><li><ol><li> Spola Cryo-överföringsstationen med torr kvävgas under ett par minuter. </li><li> Lägg flytande kväve till Dewar av TEM AC och Cryo-överföringsstationen. </li><li> Sätt i Cryo-överförings TEM hållare i den plats i kryo-överföringsstationen och fyller sin Dewar också. Vänta tills varje component har nått den önskade temperaturen (ca 15 min). Om möjligt, bör den registeransvarige av Cryo-överförings TEM hållare anslutas för att övervaka temperaturen under överföringen. Det är viktigt att inse att spetsen på TEM hållaren (där temperatursensorn är belägen) kommer att vara i kontakt med det kryo-överföringsstationen och därför kommer att kyla ner mycket snabbare än resten av TEM-hållaren. Det rekommenderas därför att den tid som behövs för hela kryo-transfer TEM hållare svalna mäts i förväg, och att systemet tillåts thermalize under åtminstone den tid. </li><li> Fyll en kryogen kopp med flytande kväve och fördjupa sig i det: TEM provklämverktyg, en skruvmejsel och pincett, för att kyla ner sina tips till önskad temperatur. Alla verktyg ska vara väl isolerade på den andra änden för att inte förorsaka köldskador till operatörens hand. </li></ol></li><li> Passa VTD till den yttre luftsluss. Ta det kallt stage till överföringshöjden (16 mm *). Stäng av den höga spänningen. </li><li><ol><li> Öppna VTD sigill, den yttre luftslussen och den inre luftslussen. </li><li> Använd VTD staven för att låsa in i SEM överföringshållaren genom att trycka och vrida medurs. </li><li> Dra tillbaka SEM överföringshållaren i kryo förberedelse kammaren. </li><li> Använd den kalla kniven för att stänga de skyddande locken på TEM galler. Detta är nödvändigt för att minska eventuella föroreningar is under överföringen. </li><li> Använd VTD staven för att flytta provet i vakuumkammaren för VTD. </li><li> Stäng luftslussar och sigill. </li></ol></li><li> Lufta den yttre luftslussen och ta loss VTD. Matcha VTD till SEM-porten på Cryo-överföringsstationen. Medan spolning med torr kvävgas, använd stiftet på stationen för att öppna sigill VTD och skjut SEM överföringshållaren i Dewar av Cryo-överföringsstationen. </li><li><ol><li> Lägg tillräckligt med flytande kväve så att nivån i Cryo-överföringsstationen är tillräckligt högatt bara doppa provet. </li><li> Använd tidigare kyld skruvmejsel för att öppna ett av locken och lossa motsvarande skruven som håller TEM rutnät på plats. </li><li> Använd de tidigare kylda pincett för att plocka TEM galler och placera den i TEM hållaren. </li><li> Använd den kylda hexring att fästa TEM rutnät på TEM hållaren. </li><li> Stäng slutaren av Cryo-överförings TEM hållare. Provet överförings steg är avgörande och kan hämmas av kvävgas att minska synligheten av den lilla TEM provet. </li><li> Koppla bort Cryo-överföringsstation från pumpsystemet och transportera den i närheten av TEM, tillsammans med uppvarmningsstyrenheten av Cryo-överförings TEM hållare. </li><li> Starta turbomolekyl pump av TEM för att pumpa det bärande linje till TEM luftsluss. </li><li> Ställ TEM provstadiet till en lutning * på -70 °. </li><li> Ställ kortast pumpningstiden för luftslussen (30-60 sek), med endast en cykel av spolning med torr kvävgas. </li&gt; </ol></li><li> Se till att skyddskåpan över kryo-överförings TEM hållaren är avslutad. Ta TEM hållaren från kryo-överföringsstationen och sätt in den i lutande goniometer (flytande kväve läcker ut TEM hållaren Dewar). Den pumpcykel kommer att starta. När cykeln är klar, ställ in goniometer att luta tillbaka till 0 ° och, samtidigt, håll TEM hållaren så att den inte roterar med vinkelmätare. Sätt den helt inne i TEM. Under detta steg bör den kryo-överföring TEM hållaren vara ansluten till dess uppvärmningsstyrenheten för att övervaka temperaturen. Proceduren för att sätta in provhållaren i TEM kan variera mellan olika TEM. Det rekommenderas därför att kontakta TEM tillverkaren för att få relevanta förfarandet. </li><li> Fyll på Cryo-överförings TEM hållare Dewar. Vänta på vakuumet i TEM för att nå en acceptabel nivå. </li></ol>

<ol>
	<li>Echlin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Low Temperature Microscopy and Analysis. , (1992).</li><li>Rubino, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+site-specific+focused-ion-beam+lift-out+method+for+cryo+Transmission+Electron+Microscopy.">A site-specific focused-ion-beam lift-out method for cryo Transmission Electron Microscopy.</a> J. Struct. Biol. 180, 572 (2012).</li><li>Studer, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+approach+for+cryofixation+by+high-pressure+freezing.">A new approach for cryofixation by high-pressure freezing.</a> J. Microsc. 203, 285 (2001).</li><li>Umrath, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cooling+bath+for+rapid+freezing+in+electron+microscopy.">Cooling bath for rapid freezing in electron microscopy.</a> J. Microsc. 101, 103 (1974).</li><li>Walther, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+progress+in+freeze-fracturing+of+high-pressure+frozen+samples.">Recent progress in freeze-fracturing of high-pressure frozen samples.</a> J. Microsc. 212, 34 (2003).</li><li>Elder, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Focused+ion+beam+micromachining+of+eukaryotic+cells+for+cryoelectron+tomography.">Focused ion beam micromachining of eukaryotic cells for cryoelectron tomography.</a> Cryo fixation. Techniques in Immunocytochemistry. , (1989).</li><li>Giannuzzi, L. A., Stevie, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Introduction to Focused Ion Beams. , (2005).</li><li>Marko, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Focused-ion-beam+thinning+of+frozen-hydrated+biological+specimens+for+cryoelectron+microscopy.">Focused-ion-beam thinning of frozen-hydrated biological specimens for cryoelectron microscopy.</a> Nat. Methods. 4, 215 (2007).</li><li>Hayles, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+making+of+frozen-hydrated,+vitreous+lamellas+from+cells+for+cryo-electron+microscopy.">The making of frozen-hydrated, vitreous lamellas from cells for cryo-electron microscopy.</a> J. Struct. Biol. 172, 180 (2010).</li><li>Rigort, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Focused+ion+beam+micromachining+of+eukaryotic+cells+for+cryoelectron+tomography.">Focused ion beam micromachining of eukaryotic cells for cryoelectron tomography.</a> J. Struct. Biol. 109, 4449-44 (2012).</li><li>Hsieh, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+high-resolution+three-dimensional+imaging+of+native+mammalian+tissue:+electron+tomography+of+frozen-hydrated+rat+liver+sections.">Towards high-resolution three-dimensional imaging of native mammalian tissue: electron tomography of frozen-hydrated rat liver sections.</a> J. Struct. Biol. 153, 1 (2006).</li><li>McDowall, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+microscopy+of+frozen+hydrated+sections+of+vitreous+ice+and+vitrified+biological+samples.">Electron microscopy of frozen hydrated sections of vitreous ice and vitrified biological samples.</a> J. Microsc. 131, 1 (1983).</li><li>Hayles, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+technique+for+improved+focused+ion+beam+milling+of+cryo-prepared+life+science+specimens.">A technique for improved focused ion beam milling of cryo-prepared life science specimens.</a> J. Microsc. 226, 263 (2007).</li><li>Pettersson, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+producing+site-specific+TEM+specimens+from+low+contrast+materials+with+nanometer+precision.">A method for producing site-specific TEM specimens from low contrast materials with nanometer precision.</a> Microsc. Microanal. 19 (1), 73 (2013).</li><li>W&#228;tjen, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cu+out-diffusion+in+kesterites—A+transmission+electron+microscopy+specimen+preparation+artifact.">Cu out-diffusion in kesterites—A transmission electron microscopy specimen preparation artifact.</a> Appl. Phys. Lett. Appl. Phys. Lett, 051902 (2013).</li></ol>

Författarna har ingenting att lämna ut.

Detta protokoll är en ganska enkel anpassning till låga temperaturer i standarden FIB / TEM provberedning som används i materialvetenskap vid RT. Metoden ger TEM prov fritt från mekanisk deformation och knivmärken (den största nackdelen med mikrotomi), även om curtaining kan uppstå om provytan är inhomogent. Detta kan reduceras genom kryo-avsättning av ett täckande skikt (i detta arbete Pt användes), härdades, tills den är slät och formlös 13. Prover med komponenterna av mycket olika hårdhet kan framställas samt utan risk för att de skulle gå sönder under stress under beredningen. Inre spänningar kan fortfarande orsaka den tunna lamellen att böja eller rulla ihop sig, i vilket fall storleken av sektionen måste reduceras. En nackdel jämfört med andra metoden är möjligheten att ändra den biologiska strukturen till följd av exponering för jonstrålen och möjlig implantering av joner i provet. Dessa nackdelar förekommer även vid RT under prov förberederation i materialvetenskap 15. De kan reduceras genom att fylla i gallring med en slutlig poleringssteg på den lägsta accelerationsspänning för de joner (500-1,000 V). Detta mycket milda poleringssteg kommer att avlägsna det skadade skiktet från lamellen. På grund av karaktären av Cryo-deponering (steg 3.5, 3.10 och 3.13), kommer stora delar av provet täckas, och därmed förs bild av den ursprungliga ytan. Detta kan göra det svårt att hålla reda på ROI, om inte flera markeringar används som föreslås i steg 3.3. Under steg 4.5 och 4.7 de tunna lamellpaket risker som kommer i kontakt med luft. Detta måste undvikas eftersom det skulle leda till att fukten i luften bildar iskristaller på ytan av provet, eventuellt till den grad att skymmer viktiga funktioner. Dessa åtgärder bör genomföras så snabbt som möjligt, men samtidigt en misskötsel under överföringen sannolikt kommer att resultera i förlust av provet densjälv. Det rekommenderas att användaren övar dessa steg genom att använda tomma TEM galler innan ett försök på ett riktigt prov görs. I materialvetenskap, har FIB instrumentet blivit den främsta metoden för TEM provberedning inom ett årtionde av dess kommersialisering. Eftersom det kan användas på praktiskt taget varje exemplar, den tar bort behovet av att anpassa framställningsteknik till den typ av prov. Vi tror starkt på samma skulle kunna hända vid låga temperaturer, tack vare det förfarande som beskrivs här. Dess tillämpning på större prover är fortfarande föremål för möjligheten att Cryo-bevara dem i ett förglasat tillstånd, men tekniker som dopp-frysning eller högtrycks frysning 3,5 kan visa sig vara den optimala lösningen på detta problem.

I detta protokoll ett cryo-FIB/SEM används för att producera TEM prov från en viss region av provet, som tidigare identifierats med hög precision med SEM-analys. Elektronmikroskop (skanning eller överföring) analys av biologiska prover är en rutin teknik som används för forskning och diagnostik. SEM är ganska snabb och enkel att använda och tolka, men information erhålls endast från provytan och med en upplösning på 1,5 nm. TEM har en högre upplösning, men är svårare att genomföra, är bildanalysen mindre okomplicerat och medan bulk information erhålls, prover måste förtunnas till elektron transparens (mindre än cirka 500 nm tjockt). Ett ytterligare problem är att vakuum kraven i dessa instrument är sällan tolereras av vatteninnehållande prover. I de flesta fall biologiska prover måste antingen kemiskt fäst (genom att ersätta vattnet med, till exempel, polymerer) eller torkades. I båda fallen, betydande förändringar avmorfologi och struktur av provet kan förekomma. Cryo TEM förberedelse av hydratiserade prover inducerar minimala kemiska förändringar och den producerar prover så nära som möjligt till sitt naturliga tillstånd, särskilt om förglasning av is erhålls 1-6. FIB är allmänt används för att förbereda TEM-prover för dess många fördelar 7. För att nämna några: användning av högenergetiska joner vid nära-normal infalls minimerar effekten av materialrelaterad differentialfrässatser; regionen utvinns ur samlingsprovet kan väljas med en sub-micron precision; en mycket liten mängd material som extraheras. Några nya tekniska utvecklingen har möjliggjorts med hjälp av FIB även för TEM provberedning vid låga temperaturer 2,8-10. Det finns flera fördelar jämfört med den traditionella framställningsmetoden för kryo-mikrotomi 11,12 används främst för mjuk materia prover, till exempel bristen på mekanisk deformation av skivade lamellen,frånvaron av knivmärken och möjlighet att förbereda sammansatta prover med hårda / mjuka gränssnitt eller komponenter.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="573">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Strata DB 235&#160;</td>
			<td style="width:71px;">FEI</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">FIB/SEM</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Omniprobe 100&#160;</td>
			<td colspan="2">Oxford Instruments&#160;</td>
			<td>nanomanipulator</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Alto 2500</td>
			<td style="width:71px;">Gatan</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>cryo preparation chamber</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">cryo-holder model 626</td>
			<td style="width:71px;">Gatan</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>cryo transfer TEM holder</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Tecnai F30</td>
			<td style="width:71px;">FEI</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>TEM</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cryo-electron microscopy specimen preparation by means of a focused ion beam

Här presenterar vi ett protokoll som används för att framställa kryo-TEM-prover av Aspergillus niger-sporer, men som lätt kan anpassas för ett obegränsat antal mikroorganismer eller lösningar. Vi använder oss av en specialbyggd kryo-överföringsstation och en modifierad kryo-SEM förberedelse kammare 2. Sporerna är tagna från en kultur, plunge-frystes i ett flytande kväve snömodd och observeras i Cryo-SEM för att välja en region av intresse. En tunn lamell heras sedan med användning av FIB, fäst till en TEM-galler och därefter förtunnas till elektron transparens. Gallret överförs till ett kryo-TEM hållaren och in i en TEM för högupplösta studier. Tack vare införandet av en kyld nanomanipulator spets och ett kryo-omlastningsstation, är detta protokoll en enkel anpassning till kryogen temperatur av rutinmässigt använda FIB beredning av TEM-prover. Som sådan har fördelarna med att kräva en liten mängd ändringar av befintliga instrument, uppställningar och procedurer; det jags lätt att genomföra; den har ett brett användningsområde, i princip samma som för kryo-TEM provberedning. En begränsning är att det kräver skickliga hantering av proverna vid kritiska steg för att undvika eller minimera föroreningar.

I detta arbete gjorde vi användning av: en dubbel balk FIB / SEM utrustad med en nanomanipulator och ett kryo-preparat kammare; en TEM med en Cryo-överföringshållaren; en prototyp Cryo-överföringsstationen. Den anticontaminator (AC) blad av Cryo-förberedelse kammare och spets nanomanipulator (NM) modifierades genom Gatan. När det gäller en vanlig kryo-förberedelse kammare, AC bladen är större för att ge en större kylfläns för NM spetsen. Dessutom är AC försedd med klämmor för anslutning av Cu-flätor för värmeväxling med NM spets. De pneumatik i FIB / SEM ändrades för att göra det möjligt för NM för att vara och förbli insatt även när provkammaren ventilerades. Det bör noteras att de parametrar som används i detta arbete är bäst lämpade för den utrustning som anges ovan; dessa parametrar kan behövas justeras när man arbetar med andra typer av utrustning. För att arbeta med detta protokoll, de vanliga försiktighetsåtgärder för hantering av kryoteknik, flytande kväve och vakuumsystem börföljas. Metoden har testats på olika typer av prover med goda resultat, från lösningar eller polymermatriser innehållande nanopartiklar, till encelliga organism till nematoder. Exempel på de olika stegen i det förfarande som illustreras i figurerna 1 till 12 på A. niger-sporerna färgades med osmiumtetroxid och kaliumpermanganat. Sporerna är först avbildas av SEM (figur 1) för att identifiera platsen för utvinning. I detta fall är en tvärsektion av varje spor var tillräcklig, men det är möjligt att placera ROI för extraktion med sub-mikrometerprecision till, till exempel, skära en specifik cell på ett visst avstånd från cellmembranet. En gång har identifierats funktionen av intresse, är det första steget i kryo-Pt nedfall förs (figur 2), för att skydda provet från strålen skador från jon fräsning. Provet lutar till 52 ° för att gå vidare med de första stegen of fräs (Figur 3): sputtring av två diken på båda sidorna av lamellen. Provet sedan lutas bakåt och ytterligare slipat lämna bara två små broar som förbinder den till största delen (Figur 4). Den kylda nanomanipulator bringas i kontakt med lamellen (Figur 5) och en annan Cryo-avsättning av Pt lödpunkter dem tillsammans (Figur 6). De små förbindningsbryggorna därefter mals bort och NM förflyttar lamell nära fastsättningsområdet av TEM-galler (figur 7), där den är lödd med en slutlig Cryo-avsättning av Pt (fig 8). Den NM separeras sedan från lamellen (Figur 9), vilket tunnas ner till elektron öppenhet med jonstråle (figur 10 och 11). Lamellerna är äntligen över till TEM (Figur 12) där högupplösande avbildning, spektroskopi, tomografi och andra tekniker can användas. <img alt="Figur 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51463/51463fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51463/51463fig1.jpg" /> Figur 1. Cryo-SEM-bild av sporer av A. niger, innan Pt nedfall. <img alt="Figur 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51463/51463fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51463/51463fig2.jpg" /> Figur 2. Samma område i figur 1 efter Pt nedfall men före härdning. <img alt="Figur 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51463/51463fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51463/51463fig3.jpg" /> Figur 3. Cryo-SEM-bild av samma område i figur 2, lutas 52 °, efter Pt avsättning och härdning, med dike fräsning underway(Se steg 3.7). <img alt="Figur 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51463/51463fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51463/51463fig4.jpg" /> Figur 4. Lamellerna, redo för lyft-out. <img alt="Figur 5" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51463/51463fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51463/51463fig5.jpg" /> Figur 5. Kylan nanomanipulator spetsen kommer i kontakt med lamellen. <img alt="Figur 6" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51463/51463fig6highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51463/51463fig6.jpg" /> Figur 6. En andra Pt Cryo-deposition används för att löda ihop nanomanipulator och lamellen. <img alt = &quot;Bild 7&quot; fo: innehåll-width = &quot;5in&quot; fo: src = &quot;/ files/ftp_upload/51463/51463fig7highres.jpg&quot; src = &quot;/ files/ftp_upload/51463/51463fig7.jpg&quot; /&gt; Figur 7. Det kalla nanomanipulator används för att överföra den lamell vid fästområdet av TEM-rutnät. <img alt="Figur 8" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51463/51463fig8highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51463/51463fig8.jpg" /> Figur 8. Cryo-avlagring används en gång till för att fästa lamellerna till TEM-rutnät. <img alt="Figur 9" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51463/51463fig9highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51463/51463fig9.jpg" /> Figur 9. Lamellerna skärs loss från nanomanipulator och det är nu redo för antingen lagring eller gallring till elektron transparens. <p class="jove_content" fo:keep-together.inom-page = &quot;alltid&quot;&gt; <img alt="Figur 10" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51463/51463fig10highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51463/51463fig10.jpg" /> Figur 10. Ett mellansteg för gallring, med några sporer synligt i tvärsnitt. <img alt="Figur 11" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51463/51463fig11highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51463/51463fig11.jpg" /> Figur 11 Cryo-SEM-bild av provet efter sista gallring.; de flesta av de andra sporerna måste fräsas bort eftersom lamellen hade börjat krypa. <img alt="Figur 12" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51463/51463fig12highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51463/51463fig12.jpg" /> Figur 12. En sammansatt kryo-TEM bild av lamellen. En del av Al stubben har inkluderatsi lameller (svart pil).

Watch this Scientific Journal Video about Cryo-electron Microscopy Specimen Preparation By Means Of a Focused Ion Beam at JoVE.com

Cryo-electron Microscopy Specimen Preparation By Means Of a Focused Ion Beam

Cryo-elektronmikroskopi Provberedning genom en fokuserad jonstråle

Cryo elektronmikroskop, antingen Skanning (SEM) eller Transmission (TEM), används ofta för karakterisering av biologiska prover eller annat material med en hög vattenhalt 1. En SEM / Focused Ion Beam (FIB) används för att identifiera funktioner av intresse i prover och extrahera en tunn, elektron-transparent lameller för överföring till ett kryo-TEM.

Here we present a protocol used to prepare cryo-TEM samples of Aspergillus niger spores, but which can easily be adapted for any number of microorganisms ...

Research

JoVE Journal

Biology

MALDI Sample Preparation: the Ultra Thin Layer Method

MALDI Provberedning: Ultra tunt lager Metod

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption ...

Cell Block Preparation from Cytology Specimen with Predominance of Individually Scattered Cells

Cell Block Beredning av Cytologi Prov med en övervikt av individuellt Spridda celler

This video demonstrates Shidham's method for preparation of cell blocks from liquid based cervicovaginal cytology specimens containing individually ...

Examination of Drosophila Larval Tracheal Terminal Cells by Light Microscopy

Examination of Drosophila Larval Tracheal Terminal Cells by Light Microscopy

Undersökning av<em&gt; Drosophila</em&gt; Larvernas Trakealtuber Terminal Celler med ljusmikroskop

Cell shape is critical for cell function. However, despite the importance of cell morphology, little is known about how individual cells generate specific ...

Sample Preparation for Single Virion Atomic Force Microscopy and Super-resolution Fluorescence Imaging

Provberedning för single virion atomic force mikroskopi och superupplösning fluorescensavbildning

Immobilization of virions to glass surfaces is a critical step in single virion imaging. Here we present a technique&#160;adopted from single molecule ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-Dimensional Spårning av Hematopoietic Stem och stamceller i vuxen mus calvarial Benmärg

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Do's and Don'ts of Cryo-electron Microscopy: A Primer on Sample Preparation and High Quality Data Collection for Macromolecular 3D Reconstruction

Göra och inte göra av Cryo-elektronmikroskopi: en primer på Provberedning och High Quality Data Collection för Macro 3D återuppbyggnad

Cryo-electron microscopy (cryoEM) entails flash-freezing a thin layer of sample on a support, and then visualizing the sample in its frozen hydrated state ...

Sample Preparation and Imaging of Exosomes by Transmission Electron Microscopy

Provberedning och avbildning av Exosomes av transmissionselektronmikroskopi

Exosomes are nano-sized extracellular vesicles secreted by body fluids and are known to represent the characteristics of cells that secrete them. The ...

Visualization of DNA Compaction in Cyanobacteria by High-voltage Cryo-electron Tomography

Visualisering av DNA packning i cyanobakterier av högspännings-Cryo-elektron tomografi

This protocol describes how to visualize the transient DNA compaction in cyanobacteria. DNA compaction is a dramatic cytoplasmic event recently found to ...

Miniaturized Sample Preparation for Transmission Electron Microscopy

Miniatyriserade provberedning för transmissionselektronmikroskopi

Due to recent technological progress, cryo-electron microscopy (cryo-EM) is rapidly becoming a standard method for the structural analysis of protein ...

Biological Sample Preparation by High-pressure Freezing, Microwave-assisted Contrast Enhancement, and Minimal Resin Embedding for Volume Imaging

Biologiska provberedning genom högtrycks frysning, mikrovågsugn-assisted kontrastförbättring, och Minimal harts inbäddning för volym Imaging

The described sample preparation technique is designed to combine the best quality of ultrastructural preservation with the most suitable contrast for the ...