Name: in vitro method to observe e-selectin-mediated interactions between prostate circulating tumor cells derived from patients and human endothelial cells
Uploaded: 2014-05-15T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In vitro Method to Observe E-selectin-mediated Interactions Between Prostate Circulating Tumor Cells Derived From Patients and Human Endothelial Cells at JoVE

Este trabalho foi apoiado por financiamento do Departamento de Defesa, da próstata Cancer Research Program (W81XWH-12-1-0124), U54CA143876 do Instituto Nacional do Câncer, ea McCooey geniturinário Fundo de Investigação Oncológica Robert. Gostaríamos de agradecer ao Dr. Annarita Lorenzo (Departamento de Patologia) para a prestação de anticorpos VE-caderina, e Dr. Marco Seandel (Departamento de Cirurgia) para a prestação de HUVECs.

1. Cultivar HUVECs em Microslides para Interações Observing CTC-endoteliais <ol><li> Sob a capa de cultura de tecidos, primeiro lave o MicroSlide, a largura do canal de 1 mm com PBS. Suavemente revestimento a microlâmina com 200 mL de 50 ug / ml de fibronectina (dissolvida em PBS) utilizando uma seringa de 1 ml de bloqueio Luer. </li><li> Cobrir a microlâmina com a tampa e mantê-lo dentro do capuz de cultura de tecidos durante 30 min. Distribuição lenta do líquido na microlâmina impede a formação de bolhas ...

<ol>
	<li>Dimitroff, C. J., Lechpammer, M., Long-Woodward, D., Kutok, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rolling+of+human+bone-metastatic+prostate+tumor+cells+on+human+bone+marrow+endothelium+under+shear+flow+is+mediated+by+E-selectin.">Rolling of human bone-metastatic prostate tumor cells on human bone marrow endothelium under shear flow is mediated by E-selectin.</a> Cancer Res. 64, 5261-5269 (2004).</li><li>Barthel, S. R., Gavino, J. D., Descheny, L., Dimitroff, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+selectins+and+selectin+ligands+in+inflammation+and+cancer.">Targeting selectins and selectin ligands in inflammation and cancer.</a> Expert Opin. Ther. Targets. 11, 1473-1491 (2007).</li><li>Konstantopoulos, K., Thomas, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+cells+in+transit:+the+vascular+interactions+of+tumor+cells.">Cancer cells in transit: the vascular interactions of tumor cells.</a> Annu. Rev. Biomed. Eng. 11, 177-202 (2009).</li><li>Nagrath, S., Sequist, L. V., Maheswaran, S., Bell, D. W., Irimia, D., Ulkus, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+rare+circulating+tumour+cells+in+cancer+patients+by+microchip+technology.">Isolation of rare circulating tumour cells in cancer patients by microchip technology.</a> Nature. 450 (7173), 1235-1239 (2007).</li><li>Mannweiler, S., Amersdorfer, P., Trajanoski, S., Terrett, J. A., King, D., Mehes, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+of+prostate-specific+membrane+antigen+(PSMA)+expression+in+prostate+carcinoma+with+distant+metastasis.">Heterogeneity of prostate-specific membrane antigen (PSMA) expression in prostate carcinoma with distant metastasis.</a> Pathol. Oncol. Res. 15 (2), 167-172 (2009).</li><li>Tagawa, S. T., Milowsky, M. I., Morris, M. J., Vallabhajosula, S., Christos, P. J., Akhtar, N. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phase+II+study+of+lutetium-177+labeled+anti-prostate-specific+membrane+antigen+(PSMA)+monoclonal+antibody+J591+for+metastatic+castration-resistant+prostate+cancer.">Phase II study of lutetium-177 labeled anti-prostate-specific membrane antigen (PSMA) monoclonal antibody J591 for metastatic castration-resistant prostate cancer.</a> Cancer Res. , (2013).</li><li>Ganguly, A., Zhang, H., Sharma, R., Parsons, S., Patel, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+human+umbilical+vein+endothelial+cells+and+their+use+in+the+study+of+neutrophil+transmigration+under+flow+conditions.">Isolation of human umbilical vein endothelial cells and their use in the study of neutrophil transmigration under flow conditions.</a> J. Vis. Exp. (66), 10-3791 (2012).</li><li>Moss, M. A., Zimmer, S., Anderson, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+metastatic+potential+in+the+adhesion+of+human+breast+cancer+cells+to+endothelial+monolayers.">Role of metastatic potential in the adhesion of human breast cancer cells to endothelial monolayers.</a> Anticancer Res. 20, 1425-1433 (2000).</li><li>Wiese, G., Barthel, S. R., Dimitroff, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+physiologic+E-selectin-mediated+leukocyte+rolling+on+microvascular+endothelium.">Analysis of physiologic E-selectin-mediated leukocyte rolling on microvascular endothelium.</a> J Vis Exp. 24, (2009).</li><li>Gebauer, F., Wicklein, D., Stubke, K., Nehmann, N., Schmidt, A., Salamon, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selectin+binding+is+essential+for+peritoneal+carcinomatosis+in+a+xenograft+model+of+human+pancreatic+adenocarcinoma+in+pfp--/rag2--+mice.">Selectin binding is essential for peritoneal carcinomatosis in a xenograft model of human pancreatic adenocarcinoma in pfp--/rag2-- mice.</a> Gut. 62 (5), 741-750 (2013).</li><li>Giavazzi, R., Foppolo, M., Dossi, R., Remuzzi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rolling+and+adhesion+of+human+tumor+cells+on+vascular+endothelium+under+physiological+flow+conditions.">Rolling and adhesion of human tumor cells on vascular endothelium under physiological flow conditions.</a> J. Clin. Invest. 92 (6), 3038-3044 (1993).</li><li>Remuzzi, A., Giavazzi, R., Dejana, E., Corada, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adhesion+of+tumor+cells+under+flow.">Adhesion of tumor cells under flow.</a> Adhesion Protein Protocols. 96, 153-157 (1999).</li><li>Liu, H., Moy, P., Kim, S., Xia, Y., Rajasekaran, A., Navarro, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monoclonal+antibodies+to+the+extracellular+domain+of+prostate-specific+membrane+antigen+also+react+with+tumor+vascular+endothelium.">Monoclonal antibodies to the extracellular domain of prostate-specific membrane antigen also react with tumor vascular endothelium.</a> Cancer Res. 57 (17), 3629-3634 (1997).</li><li>Jung, B., Obinata, H., Galvani, S., Mendelson, K., Ding, B. S., Skoura, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow-regulated+endothelial+S1P+receptor-1+signaling+sustains+vascular+development.">Flow-regulated endothelial S1P receptor-1 signaling sustains vascular development.</a> Dev. Cell. 23 (3), 600-610 (2012).</li><li>Yin, X., Rana, K., Ponmudi, V., King, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Knockdown+of+fucosyltransferase+III+disrupts+the+adhesion+of+circulating+cancer+cells+to+E-selectin+without+affecting+hematopoietic+cell+adhesion.">Knockdown of fucosyltransferase III disrupts the adhesion of circulating cancer cells to E-selectin without affecting hematopoietic cell adhesion.</a> Carbohydr. Res. 345 (16), 2334-2342 (2010).</li><li>Carman, C. V., Springer, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transmigratory+cup+in+leukocyte+diapedesis+both+through+individual+vascular+endothelial+cells+and+between+them.">A transmigratory cup in leukocyte diapedesis both through individual vascular endothelial cells and between them.</a> J Cell Bio. 167 (2), 377-388 (2004).</li></ol>

Devido ao baixo número de CTCs entre as células do sangue, é difícil isolar CTCs como uma população pura de células. Para estudar interações CTC / CE, a população rara e impura de CTCs coloca dois desafios principais: a) Identificação de CTCs entre as células do sangue; b) Observação de interações CTC / CE. Para superar a primeira limitação de identificar CTCs próstata entre as células do sangue, aproveitamos o fato de que praticamente todas ...

A metástase é um processo multi-passo complexo que permanece pouco compreendido. O eixo ligando E-selectin/selectin tem mostrado desempenhar um papel importante na metástase de tumores através da promoção de interacções adesivas primárias entre o endotélio vascular e nas células cancerosas 1,2. Endotelial (E)-selectina é uma proteína transmembranar expressa por células endoteliais activadas, enquanto ligando diferente (s) de E-selectina é expressa por células de tumor 3. Numerosas abordagens in vitro têm sido utilizados com sucesso para modelar as interacções ligando E-selectin/selectin entre células tumorais e células endoteliais (ECs) 1. Para estudar essas interações, diferentes sistemas de câmara de fluxo estão sendo empregados para simular sistema vascular sanguíneo. Entre os conjuntos de câmara de fluxo, o fluxo de placas paralelas câmara (PPFC) em conjunto com ECs é rotineiramente utilizado como um modelo in vitro simulando em condições de estresse de cisalhamento in vivo. Nestemétodo, ECs são cultivadas numa placa de 35 mm e depois de atingir uma monocamada, ECs estão ligados ao PPFC e experiências baseadas tensão de cisalhamento são executados. No entanto, PPFC e outros sistemas actuais apresentam muitas limitações para estudar as interacções adesivas entre as células tumorais (CTCs) derivadas de doentes e CEs, circula principalmente, porque CTC são uma população rara de células, verter a partir do tumor primário, que circula entre os milhões de células sanguíneas (1 CTC 10 9 por células do sangue) 4. Assim, ao contrário de oferta ilimitada de linhas de células cultivadas, baixa contagem CTC levar para muito poucos e raros interações CTC / CE, requerendo a largura do canal fluxo adequado para gravar as interações para análise de reprodução. Além disso, uma vez que pacientes CTC derivados são uma população impuro, portanto, um marcador de identificação é necessária para controlar CTC em específico. Para resolver este problema, foi desenvolvido um novo método para identificar o câncer de próstata (CaP) CTCs tirando partido do facto de que praticamente todos estes CTC expressam antigénio de membrana específico da próstata (PSMA) na sua superfície celular 5,6. Neste relatório, foi utilizada a linha de células de câncer de próstata, MDA PCa2b (MDA), para demonstrar a utilidade potencial do nosso novo sistema para estudar as interações de próstata CTC com ECs, eventualmente, para entender o mecanismo de metástases. Nossa metodologia pode ser aplicada para vários experimentos de corte com base em simulação de sistema vivo vascular 7-9. Além de examinar as interações PCa CTC / CE, o atual sistema de câmara de fluxo pode ser facilmente adaptado para a análise de células mononucleares do sangue periférico ou células tumorais interações &#39;com ECs. A facilidade de desmontagem e remontagem da câmara de fluxo, um MicroSlide III (0,1) (doravante referida como MicroSlide), permite a cultura ECs sob perfusão e estimulando ECs com diferentes citocinas para induzir protein expressão. Além disso, em cultura células endoteliais, as proteínas recombinantes, tais como a L-e P-selectina podem ser revestidos na microlâmina e interacções com as células tumorais podem ser observados sob condições de escoamento laminar 10.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="744">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Microslide</td>
			<td style="width:192px;">Ibidi</td>
			<td style="width:119px;">80331</td>
			<td style="width:189px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Fibronectin</td>
			<td style="width:192px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">FC010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Plastic tubing</td>
			<td style="width:192px;">Tygon</td>
			<td style="width:119px;">AAQ04103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Male luer adapter</td>
			<td style="width:192px;">GlycoTech</td>
			<td style="width:119px;">31-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Female luer adapter</td>
			<td style="width:192px;">GlycoTech</td>
			<td style="width:119px;">31-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Syringe pump</td>
			<td style="width:192px;">Chemyx Inc</td>
			<td style="width:119px;">Fusion 100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Luer-lock syringe</td>
			<td style="width:192px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">309628</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">M199 medium</td>
			<td style="width:192px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">M7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Endothelial Mitogen</td>
			<td style="width:192px;">Biomedical Technologies</td>
			<td style="width:119px;">BT-203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">HBSS</td>
			<td style="width:192px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">H9269</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="44">
			<td height="44" style="height:44px;width:244px;">Anti-PSMA J591-488</td>
			<td style="width:192px;">Weill Cornell Medical College-Lab of Urologic Oncology</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Interleukin-1 beta</td>
			<td style="width:192px;">Peprotech</td>
			<td style="width:119px;">200-01B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Trypsin</td>
			<td style="width:192px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">SM-2002-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Heparin</td>
			<td style="width:192px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">H-3149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="44">
			<td height="44" style="height:44px;width:244px;">HUVECs</td>
			<td style="width:192px;">Weill Cornell Medical College-Department of Surgery</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>provided by Marco Seandel</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">VE-Cadherin</td>
			<td style="width:192px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:119px;">sc-5648</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">10x objective</td>
			<td style="width:192px;">Zeiss Plan Neofluar</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:244px;">Enzyme free cell dissociation reagent</td>
			<td style="width:192px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">S-004-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">RPMI-1640</td>
			<td style="width:192px;">Lonza</td>
			<td style="width:119px;">12-702-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Ficoll-paque plus</td>
			<td style="width:192px;">GE healthcare</td>
			<td style="width:119px;">17-1440-02</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro method to observe e-selectin-mediated interactions between prostate circulating tumor cells derived from patients and human endothelial cells

A metástase é um processo em que as células tumorais derramado a partir do tumor primário intravasate vascular arterial e do sistema linfático, assim, ganhar acesso ao extravasamento e formar um nicho secundário. A extravasão de células de tumor a partir do sistema vascular de sangue podem ser estudados utilizando células endoteliais (ECs) e as células tumorais obtidas a partir de diferentes linhas celulares. Os estudos iniciais foram realizados usando condições estáticas, mas tem sido bem documentado que os CEs se comportar de forma diferente sob condições de fluxo fisiológico. Portanto, diferentes conjuntos de câmara de fluxo estão sendo usados ​​para estudar as interações de células de câncer com ECs. Montagens atuais câmara de fluxo oferecem resultados reproduzíveis, seja através de diferentes linhagens celulares ou fluidos em diferentes condições de estresse de cisalhamento. No entanto, para observar e estudar as interações com células raras, tais como células tumorais (CTCs) circulando, algumas alterações são necessárias a serem feitas para a montagem de câmara de fluxo convencional. CTCssão uma população de células raras entre os milhões de células sanguíneas. Por conseguinte, é difícil a obtenção de uma população pura do CTC. Contaminação de CTCs com diferentes tipos de células normalmente encontradas na circulação é inevitável o uso presente enriquecimento ou técnicas de depleção. No presente relatório, nós descrevemos um método único para rótulo circulando células cancerosas da próstata fluorescente e estudar as suas interacções com os ECs em um sistema de câmara de fluxo auto-montados. Esta técnica pode ser aplicada ainda para observar as interações entre CTCs próstata e qualquer proteína de interesse.

A Figura 1 mostra uma cultura D / N de uma monocamada de células endoteliais na microlâmina. Os extrapolação da Figura 1A mostra que 100% da microlâmina é visível usando objectivo 5X, enquanto 70% é visível usando uma objectiva de 10X (Figura 1B). Para o E-selectina interacções mediadas, as células que rolam nas bordas não são considerados o que torna mais do que 70% da microlâmina disponível para gravação de vídeo e análise de reprodução. Em nossa...

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In vitro Method to Observe E-selectin-mediated Interactions Between Prostate Circulating Tumor Cells Derived From Patients and Human Endothelial Cells

Método in vitro para observar interações E-selectina mediadas entre próstata células tumorais circulantes derivadas de pacientes e células endoteliais humanas

O nosso relatório descreve um método único para visualizar e analisar as interações CTC / CE no câncer de próstata em condições de fluxo fisiológicos.

Metastasis is a process in which tumor cells shed from the primary tumor intravasate blood vascular and lymphatic system, thereby, gaining access to ...

Research

JoVE Journal

Medicine

In vitro Method to Observe E-selectin-mediated Interactions Between Prostate Circulating Tumor Cells Derived From Patients and Human Endothelial Cells

Isolation, Characterization and Comparative Differentiation of Human Dental Pulp Stem Cells Derived from Permanent Teeth by Using Two Different Methods

Isolamento, caracterização e comparativa Diferenciação de células-tronco da polpa dentária Derivado de dentes permanentes usando dois métodos diferentes

Developing wisdom teeth are easy-accessible source of stem cells during the adulthood which could be obtained by routine orthodontic treatments. Human ...

Medicina

Patient Derived Cell Culture and Isolation of CD133+ Putative Cancer Stem Cells from Melanoma

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Cultura de Células e Isolamento paciente Derivado de CD133<sup&gt; +</sup&gt; Células-tronco de câncer putativos Melanoma

Despite improved treatments options for melanoma available today, patients with advanced malignant melanoma still have a poor prognosis for ...

Isolation of Cancer Stem Cells From Human Prostate Cancer Samples

Isolamento de células-tronco cancerosas em amostras de câncer de próstata humano

The cancer stem cell (CSC) model has been considerably revisited over the last two decades. During this time CSCs have been identified and directly ...

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Muscular Dystrophy Patients: Efficient Integration-free Reprogramming of Urine Derived Cells

Geração de pluripotentes induzidas células-tronco de distrofia muscular pacientes: Reprogramação livre de integração eficiente de urina células derivadas

Dystrophic cardiomyopathy is a poorly understood consequence of muscular dystrophy. Generating induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) from patients with ...

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Studying Pancreatic Cancer Stem Cell Characteristics for Developing New Treatment Strategies

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Isolamento e Cultura de Expansão de células endoteliais específicos de tumores

Freshly isolated tumor-specific endothelial cells (TEC) can be used to explore molecular mechanisms of tumor angiogenesis and serve as an in vitro model ...

Generation of Prostate Cancer Patient Derived Xenograft Models from Circulating Tumor Cells

Geração de paciente com câncer de próstata Derivado modelos de xenotransplante de células tumorais circulantes

Patient derived xenograft (PDX) models are gaining popularity in cancer research and are used for preclinical drug evaluation, biomarker identification, ...

Depletion of Mouse Cells from Human Tumor Xenografts Significantly Improves Downstream Analysis of Target Cells

Depleção de células do rato de xenoenxertos de tumor humano Melhora Significativamente Análise Downstream de células alvo

The use of in vitro cell line models for cancer research has been a useful tool. However, it has been shown that these models fail to reliably mimic ...