Name: super-resolution imaging of the cytokinetic z ring in live bacteria using fast 3d-structured illumination microscopy (f3d-sim)
Uploaded: 2014-09-29T14:00:00
Duration: 12 min 44 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Super-resolution Imaging of the Cytokinetic Z Ring in Live Bacteria Using Fast 3D-Structured Illumination Microscopy f3D-SIM at JoVE.com

The authors thank P. Levin, S. Moriya, S. Foster, and M. Pinho for the gift of strains and antibodies. They also thank L. Ferrand, P. Goodwin, J. Cooper, and B. Dougherty for expert technical assistance. CBW is supported by an Australian National Health and Medical Research Council Senior Research Fellowship (571905). LT was supported by a UTS Chancellors Postdoctoral Fellowship. MPS and ATFL were supported by Australian Postgraduate Awards. This work was supported by an Australian Research Council Discovery Project Grant (DP120102010) to EJH.

<ol>
	<li>Harry, E., Monahan, L., Thompson, L., Kwang, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+Cell+Division+The+Mechanism+and+Its+Precison.">Bacterial Cell Division The Mechanism and Its Precison.</a> Int Rev Cytol. 253, 27-94 (2006).</li><li>Schermelleh, L., Heintzmann, R., Leonhardt, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+super-resolution+fluorescence+microscopy.">A guide to super-resolution fluorescence microscopy.</a> J Cell Biol. 190, 165-175 (2010).</li><li>Hell, S. W., Wichmann, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breaking+the+diffraction+resolution+limit+by+stimulated+emission+stimulated-emission-depletion+fluorescence+microscopy.">Breaking the diffraction resolution limit by stimulated emission stimulated-emission-depletion fluorescence microscopy.</a> Opt Lett. 19, 780-782 (1994).</li><li>Betzig, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+intracellular+fluorescent+proteins+at+nanometer+resolution.">Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution.</a> Science. 313, 1642-1645 (2006).</li><li>Hess, S. T., Girirajan, T. P. K., Mason, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultra-High+Resolution+Imaging+by+Fluorescence+Photoactivation+Localization+Microscopy.">Ultra-High Resolution Imaging by Fluorescence Photoactivation Localization Microscopy.</a> Biophys j. 91, 4258-4272 (2006).</li><li>Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sub-diffraction-limit+imaging+by+stochastic+optical+reconstruction+microscopy+(STORM).">Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM).</a> Nat Meth. 3, 793-796 (2006).</li><li>Heilemann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subdiffraction-resolution+fluorescence+imaging+with+conventional+fluorescent+probes.">Subdiffraction-resolution fluorescence imaging with conventional fluorescent probes.</a> Angew Chem Int Ed (English). 47, 6172-6176 (2008).</li><li>Bretschneider, S., Eggeling, C., Hell, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breaking+the+Diffraction+Barrier+in+Fluorescence+Microscopy+by+Optical+Shelving.">Breaking the Diffraction Barrier in Fluorescence Microscopy by Optical Shelving.</a> Phys Rev Lett. 98, 218103 (2007).</li><li>Gustafsson, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surpassing+the+lateral+resolution+limit+by+a+factor+of+two+using+structured+illumination+microscopy.">Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy.</a> J. Microsc. 198, 82-87 (2000).</li><li>Gustafsson, M. G. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-Dimensional+Resolution+Doubling+in+Wide-Field+Fluorescence+Microscopy+by+Structured+Illumination.">Three-Dimensional Resolution Doubling in Wide-Field Fluorescence Microscopy by Structured Illumination.</a> Biophys J. 94, 4957-4970 (2008).</li><li>Schermelleh, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subdiffraction+multicolor+imaging+of+the+nuclear+periphery+with+3D+structured+illumination+microscopy.">Subdiffraction multicolor imaging of the nuclear periphery with 3D structured illumination microscopy.</a> Science. 320, 1332-1336 (2008).</li><li>Heintzmann, R., Cremer, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lateral+modulated+excitation+microscopy:+Improvement+of+resolution+by+using+a+diffraction+grating.">Lateral modulated excitation microscopy: Improvement of resolution by using a diffraction grating.</a> Proc SPIE 3568. , 185-195 (1999).</li><li>Gould, T. J., Burke, D., Bewersdorf, J., Booth, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptive+optics+enables+3D+STED+microscopy+in+aberrating+specimens.">Adaptive optics enables 3D STED microscopy in aberrating specimens.</a> Opt Express. 20, 20998-21009 (2012).</li><li>Urban, N. i. c. o. l. a. i. . T., Willig, K. a. t. r. i. n., Hell, S. t. e. f. a. n. . W., N&#228;gerl, U. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STED+Nanoscopy+of+Actin+Dynamics+in+Synapses+Deep+Inside+Living+Brain+Slices.">STED Nanoscopy of Actin Dynamics in Synapses Deep Inside Living Brain Slices.</a> Biophys J. 101, 1277-1284 (2011).</li><li>Galbraith, C. G., Galbraith, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+microscopy+at+a+glance.">Super-resolution microscopy at a glance.</a> J Cell Sci. 124, 1607-1611 (2011).</li><li>Strauss, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D-SIM+Super+Resolution+Microscopy+Reveals+a+Bead-Like+Arrangement+for+FtsZ+and+the+Division+Machinery+Implications+for+Triggering+Cytokinesis.">3D-SIM Super Resolution Microscopy Reveals a Bead-Like Arrangement for FtsZ and the Division Machinery Implications for Triggering Cytokinesis.</a> PLoS biol. 10, e1001389 (2012).</li><li>Adams, D. W., Errington, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+cell+division+assembly,+maintenance+and+disassembly+of+the+Z+ring.">Bacterial cell division assembly, maintenance and disassembly of the Z ring.</a> Nature Rev Microbiol. 7, 642-653 (2009).</li><li>Boer, P. A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+understanding+E+coli+cell+fission.">Advances in understanding E coli cell fission.</a> Curr Opin Microbiol. 13, 730-737 (2010).</li><li>Erickson, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+the+physics+of+FtsZ+assembly+and+force+generation.">Modeling the physics of FtsZ assembly and force generation.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 106, 9238-9243 (2009).</li><li>Erickson, H. P., Anderson, D. E., Osawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FtsZ+in+Bacterial+Cytokinesis+Cytoskeleton+and+Force+Generator+All+in+One.">FtsZ in Bacterial Cytokinesis Cytoskeleton and Force Generator All in One.</a> Microbiol Mol Biol Rev. 74, 504-528 (2010).</li><li>Lan, G., Wolgemuth, C. W., Sun, S. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Z-ring+force+and+cell+shape+during+division+in+rod-like+bacteria.">Z-ring force and cell shape during division in rod-like bacteria.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 104, 16110-16115 (2007).</li><li>Osawa, M., Anderson, D. E., Erickson, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+Contractile+FtsZ+Rings+in+Liposomes.">Reconstitution of Contractile FtsZ Rings in Liposomes.</a> Science. 320, 792-794 (2008).</li><li>Osawa, M., Erickson, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liposome+division+by+a+simple+bacterial+division+machinery.">Liposome division by a simple bacterial division machinery.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 110, 11000-11004 (2013).</li><li>Murphy, G. E., Jensen, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+cryotomography.">Electron cryotomography.</a> BioTechniques. 43, 413-415 (2007).</li><li>Liew, A. T. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+plasmid-based+system+that+allows+rapid+generation+of+tightly+controlled+gene+expression+in+Staphylococcus+aureus.">A simple plasmid-based system that allows rapid generation of tightly controlled gene expression in Staphylococcus aureus.</a> Microbiology. 157, 666-676 (2011).</li><li>Riglar, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-Resolution+Dissection+of+Coordinated+Events+during+Malaria+Parasite+Invasion+of+the+Human+Erythrocyte.">Super-Resolution Dissection of Coordinated Events during Malaria Parasite Invasion of the Human Erythrocyte.</a> Cell Hos., &amp; Microbe. 9, 9-20 (2011).</li><li>Li, Z., Trimble, M. J., Brun, Y. V., Jensen, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+of+FtsZ+filaments+in+vivo+suggests+a+force-generating+role+in+cell+division.">The structure of FtsZ filaments in vivo suggests a force-generating role in cell division.</a> EMBO J. 26, 4694-4708 (2007).</li></ol>

This publication is sponsored by GE Healthcare.

הדמיה לחיות תאי ניאון היא כלי רב עוצמה המאפשר תצפית של שינויים דינמיים בתוך תאים לאורך זמן. ההדמיה חיה של ביולוגיה של תא חיידקים הייתה מאתגרת בגלל גודל התא הקטן ומקטינה את היכולת של תאי חיידקיים לעמוד חשיפה חוזרת ונשנית לאור העירור. f3D-SIM הרחיב את הכלים העומדים לרשות לחקור את כל הביולוגיה של התא, אך יש צורך לבצע בזהירות בטכניקה זו כפי שניתן הציגו ממצאים אם ייושמו בצורה גרועה. ישנם מספר שיקולים החשובים לשימוש המוצלח של טכניקה זו. כפי שהוא שיטת דימות פלואורסצנטי רחב בתחום שמסתמכת על השימוש בפונקצית נקודת ההתפשטות של אור הנפלט, חוסר התאמת מקדם שבירה וסטייה כדורית של האור הנפלט יש להימנע כדי לאפשר שחזור תמונה מדויק. השימוש בcoverslips של 0.17 מ&quot;מ עובי של באיכות גבוהה, כדי למנוע וריאציה של עוצמת אות בשל השתנות עובי זכוכית בכיסוייםשפה מומלצת מאוד. זה חשוב באופן קריטי על מנת להעריך בזהירות את האברציה הכדורית של האור הנפלט בשלבים הראשונים של כל הניסויים ולהתאים את מקדם שבירת שמן טבילה לפי צורך. זה עשוי להשתנות מיום ליום כפי שהוא תלוי בשני הטמפרטורה ומדיה / מצע ההרכבה של המדגם. השימוש בשמן לא נכון יגרום לשחזור נחותים של התמונות עם חפצים כגון הילות ואותות הד. בסופו של תהליך שחזור התמונה, לכל שלב ניתן לקבל מדד לאיכות של השיקום על ידי &quot;ההתאמה הטובה ביותר עבור זווית Ko&quot; לכל שלב / זווית של התאורה. אם ערך זה הוא מתחת ל -1 לכל זווית, ולאחר מכן את האיכות של משוחזר תהיה ככל הנראה להיות גבוהה. אם ערך זה הוא מעל 6, שזה סביר להניח כי התמונה המשוחזרת תכיל חפצים. חפצים נפוצים כוללים אני) את המראה של פסים בתמונה שמתאימהלאחד מהזוויות של הרשת. זה יכול לנבוע מאות נמוכה יותר מזווית הרשת ש; ii) אפף סביב מבנים. זה יכול לנבוע מרמות מאוד לא אחידות של אות ממבנים בהירים בהשוואה למבנים שמסביב, חוסר התאמה של מקדם שבירה של הנפט והמדגם או יכול להיות בגלל המבנים בתמונה להיות אמורפי מדי ולא מכיל &quot;מבנה&quot; מספיק כדי להיות מוכר על ידי האלגוריתם; iii) &quot;כוורות&quot; שנובעת מאות נמוכה יחס רעש בתמונה, בדרך כלל עקב אות רקע גבוהה; iv) מבנים שנמתחים / מוארכים בXY שיכולים להיות בגלל חוסר ההתאמה מקדם שבירה של שמן ומדגם. חפץ זה קשה להבחין למשתמש לא מנוסה. מומלץ כי משתמשים חדשים להתייעץ חוקר SIM מנוסה לקבלת ייעוץ על פרשנות תמונה וניתוח כאשר מתחילים להשתמש בטכניקה זו. כמו בכל ניסויי ההדמיה לחיות תאי הניאון, זה יבואנמלה לאזן בזהירות את קלט אנרגיית עירור על מנת למזער את מידת photobleaching וphototoxicity של התאים עם אות פליטה מספיק צריכה לשחזר תמונות עם חפץ מינימאלי. photobleaching מוגזם (יותר מ 30% על פני רכישת z-ערימה אחת) יוביל לדפוס פיזור בתמונה המשוחזרת. עם השימוש במצלמות sCMOS, תמונות ברזולוציה סופר ניתן לשחזר בהצלחה מתמונות גולמית עם אות פליטה נמוכה כמו 1,000 ספירות מעל רקע. זה יכול לאפשר לזמני חשיפה קצרים מאוד ובכך להפחית photobleaching ומאפשרים לכידה מהירה לכל מסגרת. זה גם מגדיל את כמות הזמן בין מסגרות לתאים להתאושש מהשקעת אנרגית עירור. בנוסף, ככל שזמן הלכידה לכל מסגרת בודדת יכול להיות קצר מאוד, התואר של חפץ שהוצג על ידי &#39;תנועה לטשטש&#39; במהלך לכידת פרט מצטמצם עם השימוש בשיטה זו. זה Variני של 3D-SIM מציע מספר יתרונות אחרים על פני טכנולוגיות סופר זמין והדמיה ברזולוציה גבוהה אחרות הדמיה חיה על ידי ביולוגים תא חיידק. העלייה של 2 הקיפול ברזולוציה בכל 3 הממדים ויכולת תמונה עד 30 מיקרומטר למדגם מאפשרים הדמיה של תאי חיידקים (ויונקים) שלמים במהלך ניסוי. טכניקות כגון לוקליזציה מולקולה בודדת המבוצעות בדרך כלל בגל החולף לא יכולות להשיג את עומק החדירה לתוך מדגם ולא מציעות מידע על כל תאים. התקדמות שחל באחרונה, המאפשרות עומקי דגימה גבוהים יותר לטכניקה זו עלולה לגרום לרזולוציה צירית טובה יותר של תאים שלמים. בנוסף, טכניקות לוקליזציה מולקולה בודדת שדורשות אלפי תמונות גולמיים שתירכשנה גם הם מוגבלים במסגרת השיעור שניתן ללכוד ועשויה לדרוש פשרה בין מסגרת שיעור לכידה והרזולוציה מרחבית השיגה האולטימטיבית, כרזולוציה מרחבית תלויה ב מספר ערבNTS נרשם בתוך מרחב מוגדר. הפחתת מספר המסגרות שנתפסו תגרום לרזולוציה מרחבית נמוכה יותר אבל עשוי להיות מספיק כדי להשיג את הרזולוציה של הזמן דרוש לתהליך הביולוגי של עניין. זמן התאוששות בין המסגרות עשוי גם צריך להיות מוגבר על מנת למזער phototoxicity בתאים חיים וכך להגביל את המשך ותדירות שבה ניתן להשיג בזמן סדרה. טכניקות ברזולוציה גבוהה כגון מיקרוסקופיה אלקטרונית (EM) או אלקטרונים cryotomography (ECT) הצעה עלו ברזולוציה מעל 3D-SIM (ושיטות מיקרוסקופיה אחרות ברזולוציה הסופר אופטיות) אך חייבת להתבצע על דגימות קבועות. התיקון והעיבוד עשוי להציג את הממצאים וחוסר התיוג עלול להפוך פרשנות קשה. יש ECT ללא תווית ניגוד עני ויכול להשיג מעמקי חדירת מדגם של כ 500-200 ננומטר 24, כך שגם אם החלבון של עניין ניתן לזהות, את המבנה של החלבון בתא חיידק שלם לא יכול להיות שנצפה.גם כאשר תיוג יכול לשמש בEM, כגון עם immunogold, ההדמיה מתבצעת רק ב2D. 3D הוא בר השגה רק עם חתך דק ושחזור ממוחשב של החתכים. חתך הדק דורש טכנאי מנוסה אבל יכול להיות בעייתי ולגרום לחפץ. עם תאי חיים או קבועים, 3D-SIM אינו צריך להיות מוטבע באופן ספציפי ותאים יכולים להיות מוכנים במהירות להדמיה במצב טבעי קרוב. שיטה זו היא קלה יחסית ליישום על ידי חוקרים בעלי ניסיון מינימאלי במיקרוסקופ פלואורסצנטי. ניתן לבצע ניסויים בתקשורת שתומכות בתפקוד תא בריא, כל עוד זה לא לזרוח או ליצור אות רקע שלא לצורך. לתאי חיידקים, זה יכול לאפשר את השימוש בסוגים רבים של מורכבות ותקשורת מינימאלית או השימוש בתקשורת מוצקה או חצי מוצק לשלוט תנועתיות תא חיידק. ביולוגים רבים שכבר מהונדס חלבון פלואורסצנטי (FP) איחודים ובדק את הפונקציונליות שלשילובים אלה יכולים לקחת עד טכנולוגיה זו במהירות ללא הנדסה ואימות עם שילובי FP photoactivatable חדשים נוספות. מצאנו, כהתבוננות כללית, שס aureus היה רגיש יותר לphotobleaching במהלך הדמיה עם שילובי FP מאשר ב &#39; subtilis. תוך שימוש בשיטות שלנו המקוריות 3D-SIM, שבו דפוס הרשת נוצר על ידי צורם פיזי, לא הצליחו לבצע הדמיה תא חי עם מספר של ס &#39; שילובי aureus FP. עם זאת, עם שיטת f3D-SIM מתקדם זה, היינו יכול תמונת איחודי FP אלה ולבצע סדרת זמן קצרה כדי ללכוד את הדינמיקה של חלבונים המתויגים אלה. זוהי ככל הנראה בשל זמני חשיפה המופחתת דרושים להדמיה והגדילו זמן בין מסגרות להתאוששות תא. OMX Blaze 3D-SIM הוא טכנולוגיה זמינה מסחרי שיכול להיות יחסית קלה ליישום במעבדה בודדת או מתקן הדמיה ליבה. יש להקפיד לבצע את הטכניקה כדי למנוע Artiעובדות בשל הכנת מדגם עניה או לכידת תמונה ירודה. ברגע שהטכניקה היא שולטת, מחקרים של מבנה חלבון ודינמיקה באורגניזמים קטנים כגון חיידקים יכולים להתבצע בקרינה בודדת או מרובי צבעים.

מספר טכנולוגיות הדמיה שונות שימש במשך השנים ללמוד חיידקים כוללים אלקטרונים שונים וטכניקות מיקרוסקופיה אופטיות. בעוד במיקרוסקופ אלקטרונים מציע רזולוציה גבוהה ביותר, עד לננומטר, את הצורך בואקום ושימוש בחומרי ניגוד מוגבל בטכניקה זו כדי דגימות קבועות ומוטבעות. יכולים גם להיות הציגו חפצים בשל הכנת מדגם ארוכה ויש צורך ברופא מיומן כדי להכין את הדגימות, וכדי לנתח ולפרש את התמונות וכתוצאה מכך. מיקרוסקופיה אופטית מציעה את היתרונות של הכנת מדגם פשוט והיישום של תוויות מרובות בקלות יחסית בהשוואה למיקרוסקופ אלקטרונים. שימוש בחלבוני ניאון וconjugates צבע, היכולת ללמוד תאי חיים עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי הוא גם אפשרי. עם שיפורים ביציבות בfluorophore וגודל / מבנה חלבון פלואורסצנטי המוביל לירידה ברעילות תאים, כמו גם התקדמות בtechn זיהוי מצלמהology, מיקרוסקופ פלואורסצנטי באמצעות שדה רחב ומערכות הדמיה confocal הרחיב באופן משמעותי את ההבנה של הדינמיקה המרחבית של תאים שלנו. שימוש בשיטות אלה, הידע שלנו על תא חיידק -20 השנים האחרונות התקדם מאוד להשקפה הרבה יותר מפורטת שמגלה רמה גבוהה של ארגון מבני וחלבונים בתוך תא חיידק 1. עם זאת, בשיטות מקובלות של מיקרוסקופיה אופטית הן עקיפה מוגבל, מה שאומר שהרזולוציה הטבועה היא כמחצית מאורך הגל של אור העירור משמש. כתוצאה מכך, אפילו עם מערכת מיקרוסקופיה אופטית הקונבנציונלית האופטימלית ביותר, ברזולוציה הרוחב הטובה ביותר הוא על 220-250 ננומטר והרזולוציה הצירית היא כ -500 ננומטר (לסקירה ראה Schermelleh et al. 2). לביולוגים של תא חיידקים בפרט, זה עדיין מגביל את ההבנה של הארגון המרחבי של תאים הזעירים אלה שלנו; להיות 1-2 מיקרומטר רק בקוטרeter ו1-10 מיקרומטר באורך. יש גם צורך בטכניקות ברזולוציה גבוהה יותר שניתן לבצע על תאי חיים שבו התנהגות מרחבית דינמית של חלבון יכולה להיות מנותחת על מנת להשלים בנתונים חוץ גופית. במהלך העשור האחרון, מספר טכניקות דימות פלואורסצנטי ברזולוציה הסופר פותחו. מיקרוסקופיה ברזולוציה סופר מתארת ​​טכניקות הדמיה שכפולות לפחות הרזולוציה לרוחב השגה עם מיקרוסקופ אור הקונבנציונלית, ובכך להתגבר על המחסום העקיפה. טכניקות אלו לתפעל את התאורה ו / או ניתוח של האור הנפלט כדי ליצור עליות ריאליות ברזולוציה הנראית לעין. כרגע יש שלושה סוגים עיקריים של טכניקות ברזולוציה סופר - i) מגורה מיקרוסקופיה דלדול פליטה 3 (STED); ii) מיקרוסקופיה לוקליזציה מולקולה בודדת, כולל טכניקות כגון מיקרוסקופיה לוקליזציה photoactivation 4,5 (PALM), מיקרוסקופיה שיקום האופטית סטוכסטיים <sדלדול מדינה עד&gt; 6 (STORM), STORM הישיר 7 (dSTORM), והקרקע עם תשואת מולקולה בודדת 8 (GDSIM); וiii) מיקרוסקופיה תאורה מובנה 9-12 (SIM). טכניקות לוקליזציה מולקולה בודדת להציע העליות הגדולות ביותר ברזולוציה לרוחב, עד שבין 10-40 ננומטר בדגימות ביולוגיות. ביישומים רבים של מיקרוסקופיה לוקליזציה מולקולה בודדת, עומק הדגימה מוגבל לגל החולף וההטמעות הראשוניות של STED גם היו מוגבלים בעומק הדגימה. שיפורים עם זאת, ההתקדמות האחרונה כגון שימוש באופטיקה מסתגלת, ניצול של אסטיגמציה בפונקצית נקודת התפשטות במוקדים שונים, זיהוי רב מטוס ושימוש בשתי מטרות להסיק העמדה הצירית של האור הנפלט ראו בשני הצירי מעמקי רזולוציה ודגימה בשני לוקליזציה מולקולת STED ואחת 13,14. שיעורי רכישת נתונים לSTED וטכניקות לוקליזציה מולקולה בודדתגם איטיים יחסית בשל המספר הגדול של תמונות שצריכות להיות שנרכשו עבור רזולוציה מקסימלי (עד 50,000 לטכניקות לוקליזציה). רכישת נתונים איטית זה לא להשאיל את עצמה להדמיה של דגימות חיות בלי שינויים מותאמים אישית, כי הם לעתים קרובות יקרים למדי. שתי טכניקות אלה כיום בצורה אופטימלית מתאימות לדגימות קבועות (לסקירה ראה 2,15), לעומת זאת, הרבה עבודה נעשית כדי לטפל במגבלה זו. שלוש מיקרוסקופיה תאורה המובנה ממדית (3D-SIM) היא טכניקת שדה רחב המשפרת את שניהם ברזולוציה לרוחב וצירית וכתוצאה מכך החלטות של כ 110 ו280 ננומטר, בהתאמה. עומק של דגימה הוא עד 30 מיקרומטר מcoverslip, המאפשר הדמיה של כל תאים. הווריאציה של 3D-SIM שפותחה על ידי Sedat, Agard, וGustaffsson על הפלטפורמה אופטית מיקרוסקופ הניסיוני (OMX) כרוכה מאירה את המדגם עם דפוס רשת ידוע אשר עבר ל15 שוניםעמדות בכל מטוס z 9-11. השוליים בדפוסי moire וכתוצאה מכך שנוצרים בחלל תדר מחוץ לאזור הנצפה נמדדים. המידע משטח התדירות הוא המחשוב משוחזר כדי ליצור תמונה ברזולוציה סופר גלויה 10,11. המהירות היחסית שבה ניתן לרכוש התמונות גולמי באמצעות טכניקה זו מאפשרת הדמיה של תאי חיים. עם זאת, חשוב לשים לב כי לתהליכים ביולוגיים המתרחשים בזמן בקנה מידה של שניות, שיעור הרכישה של התמונות הגולמיים הוא עדיין איטי מדי כדי ללכוד שינויים דינמיים. זמן סדרה עם קצב לכידה של שניות ל, רכישה החוזרת ונשנית ללא זמן התאוששות מספיק יכולה להוביל לphototoxicity וphotobleaching, במיוחד במהלך ההדמיה חיה של תאי חיידקים קטנים. כדי להתגבר על בעיות אלה, ההתקדמות האחרונה ל3D-SIM המהיר (f3D-SIM) פותחו. כאן אנו מתארים אחד הידוע בשם OMX Blaze 16 שהיה אניntroduced בסוף 2011. טכנולוגיה זו יוצרת תאורה בדוגמת ללא שימוש ברשת פיזית כפי שמשמש במערכות קודמות. השימוש בהתערבות קרן אור וטכנולוגיה תריס חדש מאפשר יצירה של האור בדוגמת על המדגם באופן מהיר מאוד. המהירות של רכישת תמונה הייתה עוד יותר משופרת עם ההקדמה של מוליכים למחצה תחמוצת מתכת משלימים מדעי מצלמות (sCMOS), במיוחד בהשוואה למצלמות הקיימות EMCCD. שינויים אלה הביאו לשיעור רכישת תמונה אפשרי של מסגרת אחת לשנייה לעומק דגימה של 1 מיקרומטר (512 x 512 פיקסלים, 9 z-פרוסות), המאפשר ניטור של שינויים דינמיים בתוך תאים המתרחשים בתוך שניות 16. הירידה בפעמים לכאורה חשיפה (עירור) לחיות תאי שימוש בשיטה זו מאפשרת גם סדרה מורחבת זמן להיות בשבי או עלייה בשיעור הלכידה. כאן אנו מתארים את היישום של מיקרוסקופיה f3D-SIM לexaminדואר המבנה ותנועה דינמית של טבעת cytokinetic Z בתאים של שני מיני חיידקים: subtilis Bacillus אורגניזם מודל בצורת המוט והפתוגן האנושי coccoid Staphylococcus aureus. FtsZ הוא חלבון cytoskeletal כמו טובולין-שממלא תפקיד מרכזי בחלוקת תא בחיידקים 17,18. זה localizes לאתר החטיבה לגייס לפחות 20 חלבוני חטיבה אחרים, ויצר מנגנון חלוקת 17,18, והוא האמין כדי לספק הכוח לתא התכווצות 19-23. שיטה זו מגלה כי FtsZ מופץ הטרוגני סביב טבעת Z בשני אורגניזמים בהסדר כמו חרוז; פתרון השאלה האם טבעת Z היא החגורה אחידה רציפה סביב התא, כמו דמיין ידי מיקרוסקופ הקונבנציונלי רחב בתחום הקרינה, או מבנה רציף כפי שהוצע על ידי cryo-טומוגרפיה של אלקטרון (ECT) 24 הארוכה שנערך. אנו מראים כיצד היכולת של 3D-SIM בהרבה יכולה לשפר את הבחינה המרחבית של זעיר (1קוטר מיקרומטר) תאים עגולים כמו ס &#39; aureus שמחלק בשלושה מישורים ברציפות בניצב (x, y, z). מחקרי זמן לשגות תוך שימוש בטכניקות אלה מראים כי המבנה של טבעת Z הוא דינמי, עם ברוטו ארגון שינויים בתוך הטבעת, ולא מולקולות FtsZ נעו פנימה וחוצה של פיגום קבוע 24.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="663">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:161px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:216px;">Agarose I (Biotecnology grade)</td>
			<td style="width:161px;">AMRESCO</td>
			<td style="width:119px;">0710-500G</td>
			<td style="width:167px;">Used for constructing 2% agarose pads. Use microwave to dissolve agarose in growth media</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">N-(3-Triethylammoniumpropyl)-4-(6-(4-(Diethylamino) Phenyl) Hexatrienyl) Pyridinium Dibromide (FM 4-64)</td>
			<td style="width:161px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">T-13320</td>
			<td style="width:167px;">Lipophylic dye used for staining cell membranes.</td>
		</tr>
		<tr height="140">
			<td height="140" style="height:140px;width:216px;">1.5 ml microtube, graduated Natural</td>
			<td>Scientific specialties Inc.</td>
			<td style="width:119px;">1210-00</td>
			<td style="width:167px;">Made from Homopolymer polypropylene, Used to harvest bacterial cells prior to being placed on agarose pads for visualization</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:216px;">Luria broth base, Miller&#160;</td>
			<td style="width:161px;">BD</td>
			<td style="width:119px;">241420</td>
			<td style="width:167px;">Prepared according to manufacturer&#39;s instructions. Add 2%?? after autoclaving&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:216px;">BBL Antibiotic assay broth, Antibiotic medium 3</td>
			<td style="width:161px;">BD</td>
			<td style="width:119px;">210932</td>
			<td style="width:167px;">Prepared according to manufacturer&#39;s instructions.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="100">
			<td height="100" style="height:100px;width:216px;">Adhesive frame</td>
			<td style="width:161px;">Thermo-Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">ABGAB-0577</td>
			<td style="width:167px;">&#160;Known as Gene Frame with this company. Used to prepare 2% agarose pads (Dimensions: 15x16mm)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Microscope cover glass</td>
			<td style="width:161px;">Thermo-Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">111512-9</td>
			<td style="width:167px;">22x22 No 1 Thickness</td>
		</tr>
		<tr height="100">
			<td height="100" style="height:100px;width:216px;">35 mm diameter petri dish with a glass coverslip bottom</td>
			<td style="width:161px;">World precision instruments</td>
			<td style="width:119px;">FD35-100</td>
			<td style="width:167px;">Known as FluoroDish with this company. Dish: &#216;35mm, Glass: &#216; 23mm, Glass thickness: 0.17 mm, non pyrogenic</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Chloramphenicol</td>
			<td style="width:161px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">C0378-25G</td>
			<td style="width:167px;">Make a 10 mg/ml stock in 95% Ethanol</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Lincomycin hydrochloride&#160;</td>
			<td style="width:161px;">Sigma&#160;</td>
			<td style="width:119px;">L6004-5MU</td>
			<td style="width:167px;">Make a 25 mg/ml stock in 50% Ethanol</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Erythromycin&#160;</td>
			<td style="width:161px;">Boehringer Mannheim GmbH</td>
			<td style="width:119px;">12390120-14</td>
			<td style="width:167px;">Make a 10 mg/ml stock in 95% Ethanol</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Combined Orbital/Linear Shaking waterbath&#160;</td>
			<td style="width:161px;">Grant scientific Instruments</td>
			<td style="width:119px;">OLS-200</td>
			<td style="width:167px;">Shaking speed used for cultures: 215 rpm</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:216px;">UV visible Spectrophotometer</td>
			<td style="width:161px;">Shimadzu</td>
			<td style="width:119px;">UV-1601</td>
			<td style="width:167px;">600 nm wavelength was used for measuring Optical density of bacterial cultures</td>
		</tr>
		<tr height="120">
			<td height="120" style="height:120px;width:216px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:161px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">5415R</td>
			<td style="width:167px;">Pellets of bacterial culture were obtained by spidding down mid exponentially growing cultures at 8000 for 30 seconds&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Isopropyl &#946;-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)</td>
			<td style="width:161px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">15502-10G</td>
			<td style="width:167px;">Prepare 1M stock and filter sterilze prior to use</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">softWoRx software</td>
			<td style="width:161px;">Applied Precision Inc/A GE Healthcare Company</td>
			<td style="width:119px;">version 5.0</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Imaris data analysis software</td>
			<td style="width:161px;">Bitplane Scientific Software, Bitplane AG</td>
			<td style="width:119px;">version 7.0.0</td>
			<td style="width:167px;">Matlab XTensions included</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">DeltaVision OMX 3D-SIM imaging system fitted with a Blaze module.</td>
			<td style="width:161px;">Applied Precision Inc/A GE Healthcare Company</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">Blaze module fitted on OMX V3</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Upright fluorescence microscope</td>
			<td style="width:161px;">Zeiss Axioplan 2&#160;</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

super-resolution imaging of the cytokinetic z ring in live bacteria using fast 3d-structured illumination microscopy (f3d-sim)

הדמיה של דגימות ביולוגיות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי התקדמה באופן משמעותי בטכנולוגיות חדשות כדי להתגבר על מחסום הרזולוציה של דיפרקציה של אור המאפשר רזולוציה סופר של דגימות חיות. כרגע יש שלושה סוגים עיקריים של טכניקות ברזולוציה סופר - דלדול פליטה מאולץ (STED), מיקרוסקופיה מולקולה בודדת לוקליזציה (כולל טכניקות כגון PALM, STORM, וGDSIM), ומיקרוסקופיה המובנה תאורה (SIM). בעוד טכניקות לוקליזציה-מולקולה בודדת STED ולהראות העליות הגדולות ביותר ברזולוציה, הם היו איטיים יותר מה להציע מהירויות מוגברות של רכישת תמונה. SIM תלת ממדי (3D-SIM) הוא טכניקת מיקרוסקופ פלואורסצנטי שדה רחב שמציעה מספר היתרונות על פני שתי לוקליזציה מולקולה בודדת וSTED. רזולוציה משופרת, עם רזולוציות טיפוסיות לרוחב והצירי של 110 ו280 ננומטר, בהתאמה ובעומק של דגימה של עד 30 מיקרומטר מcoverslip, המאפשרתהדמיה של תאים שלמים. הפיתוחים אחרונים (מהיר 3D-SIM) בטכנולוגיה להגדיל את שיעור הלכידה של תמונות גולמיים מאפשרים לכידה מהירה של תהליכים ביולוגיים המתרחשים בשניות, תוך צמצום צילום רעילות וphotobleaching משמעותי. כאן אנו מתארים את השימוש בשיטה אחת כזו לתמונת תאי חיידקיים מחסה חלבון fluorescently שכותרת cytokinetic FtsZ להראות כיצד תאים מנותחים והסוג של מידע ייחודי שטכניקה זו יכולה לספק.

Watch this Scientific Journal Video about Super-resolution Imaging of the Cytokinetic Z Ring in Live Bacteria Using Fast 3D-Structured Illumination Microscopy f3D-SIM at JoVE.com

Super-resolution Imaging of the Cytokinetic Z Ring in Live Bacteria Using Fast 3D-Structured Illumination Microscopy f3D-SIM

Spatiotemporal information about dynamic proteins inside live cells is crucial for understanding biology. A type of super-resolution microscopy called fast 3D-structured illumination microscopy (f3D-SIM) reveals unique information about the cytokinetic Z ring in bacteria: both its bead-like appearance and the rapid dynamics of FtsZ within the ring.

הדמיה ברזולוציה סופר של Cytokinetic Z הטבעת בחיידקים חיים באמצעות-Structured 3D מהיר תאורה מיקרוסקופית (f3D-SIM)

Imaging of biological samples using fluorescence microscopy has advanced substantially with new technologies to overcome the resolution barrier of the ...

Research

JoVE Journal

Biology

Super-resolution Imaging of the Cytokinetic Z Ring in Live Bacteria Using Fast 3D-Structured Illumination Microscopy (f3D-SIM)

Visualizing Bacteria in Nematodes using Fluorescent Microscopy

Visualizing חיידקים בנמטודות באמצעות מיקרוסקופיה פלורסנט

 
Symbioses, the living together of two or more organisms, are widespread throughout all kingdoms of life. As two of the most ubiquitous organisms on ...

Super-resolution Imaging of the Bacterial Division Machinery

הדמית סופר רזולוציה של מכונות אגף קטריאלי

Bacterial cell division requires the coordinated  assembly of more than ten essential proteins at midcell1,2. Central  to this process is the formation of ...

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

חי הדמיה של חיסול תאים אפופטוטיים במהלך<em&gt; דרוזופילה</em&gt; עובר

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

Test Samples for Optimizing STORM Super-Resolution Microscopy

דוגמאות מבחן לייעול STORM סופר רזולוציה מיקרוסקופית

STORM is a recently developed super-resolution microscopy technique with up to 10 times better resolution than standard fluorescence microscopy ...

Sample Preparation for Single Virion Atomic Force Microscopy and Super-resolution Fluorescence Imaging

הכנה לדוגמה למיקרוסקופיה של כוח אטומי של Virion יחיד והדמיית פלואורסצנטיות ברזולוציה גבוהה במיוחד

Immobilization of virions to glass surfaces is a critical step in single virion imaging. Here we present a technique&#160;adopted from single molecule ...

Three-dimensional Super Resolution Microscopy of F-actin Filaments by Interferometric PhotoActivated Localization Microscopy (iPALM)

Three-dimensional Super Resolution Microscopy of F-actin Filaments by Interferometric PhotoActivated Localization Microscopy iPALM

תלת מימדי סופר רזולוציה מיקרוסקופית של סיבים F- אקטין ידי interferometric PhotoActivated לוקליזציה מיקרוסקופית (iPALM)

Fluorescence microscopy enables direct visualization of specific biomolecules within cells. However, for conventional fluorescence microscopy, the spatial ...

Open-source Single-particle Analysis for Super-resolution Microscopy with VirusMapper

ניתוח קוד פתוח Single-חלקיק למיקרוסקופיה סופר-רזולוציה עם VirusMapper

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm ...

Ground State Depletion Super-resolution Imaging in Mammalian Cells

הדמיה סופר-ברזולוציה המחסור בקרקע בתאים בתרבית

Advances in fluorescent microscopy and cell biology are intimately correlated, with the enhanced ability to visualize cellular events often leading to ...

Application of High-speed Super-resolution SPEED Microscopy in Live Primary Cilium

יישום של מיקרוסקופיית מהירות רזולוציה סופר מהיר ב ריסי העיקרי בשידור חי

The primary cilium is a microtubule-based protrusion on the surface of many eukaryotic cells and contains a unique complement of proteins that function ...

Specific Labeling of Mitochondrial Nucleoids for Time-lapse Structured Illumination Microscopy

תיוג ספציפי של נוקלאונואידים מיטוכונדריאידים לזמן-מיקרוסקופ תאורה מובנה לפקיעה

Mitochondrial nucleoids are compact particles formed by mitochondrial DNA molecules coated with proteins. Mitochondrial DNA encodes tRNAs, rRNAs, and ...