Name: a method for generating pulmonary neutrophilia using aerosolized lipopolysaccharide
Uploaded: 2014-12-15T13:00:00
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Wir möchten Kerstin Thim (Astrazeneca, Lund, Schweden), Benita Dahlberg und Dr. Anders Eklund (Karolinska Institutet, Stockholm, Schweden) sowie Dr. Martin Stampfli (McMaster University, Hamilton, ON, Kanada) für geschickte Unterstützung danken und kompetente Beratung.

Die tierexperimentellen Studien wurden von der Nord Stockholm Tierschutz Ethikkommission genehmigt. Die experimentellen Verfahren wurden in Übereinstimmung mit schwedischen Rechts durchgeführt. 1. Erstellen eines LPS Aerosol <ol><li> Man löst 0,5 g gereinigtes P. aeruginosa LPS in 50 ml steriler Kochsalzlösung unter leichtem Schütteln und überprüfen Sie die Auflösung. Gebrauchslösung: 1 ml LPS gelöst in 9 ml steriler Salzlösung bis zu einer Endkonzentration von 1 mg / m...

<ol>
	<li>King, J. D., Kocincova, D., Westman, E. L., Lam, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review:+Lipopolysaccharide+biosynthesis+in+Pseudomonas+aeruginosa.">Review: Lipopolysaccharide biosynthesis in Pseudomonas aeruginosa.</a> Innate Immun. 15, 261-312 (2009).</li><li>Grommes, J., Soehnlein, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contribution+of+neutrophils+to+acute+lung+injury.">Contribution of neutrophils to acute lung injury.</a> Mol Med. 17, 293-307 (2011).</li><li>Pesci, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammatory+cells+and+mediators+in+bronchial+lavage+of+patients+with+chronic+obstructive+pulmonary+disease.">Inflammatory cells and mediators in bronchial lavage of patients with chronic obstructive pulmonary disease.</a> Eur Respir J. 12, 380-386 (1998).</li><li>Hoogerwerf, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lung+Inflammation+Induced+by+Lipoteichoic+Acid+or+Lipopolysaccharide+in+Humans.">Lung Inflammation Induced by Lipoteichoic Acid or Lipopolysaccharide in Humans.</a> Am. J. Respir. Crit. Care Med. 178, 34-41 (2008).</li><li>Scheuchenzuber, W. J., Eskew, M. 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Concomitant evaluation of inflammatory cells and haemorrhagic lung damage.</a> Pulm Pharmacol Ther. 13, 61-69 (2000).</li><li>Brand, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Total+deposition+of+therapeutic+particles+during+spontaneous+and+controlled+inhalations.">Total deposition of therapeutic particles during spontaneous and controlled inhalations.</a> Journal of pharmaceutical sciences. 89, 724-731 (2000).</li><li>Liu, F., Li, W., Pauluhn, J., Trubel, H., Wang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipopolysaccharide-induced+acute+lung+injury+in+rats:+comparative+assessment+of+intratracheal+instillation+and+aerosol+inhalation.">Lipopolysaccharide-induced acute lung injury in rats: comparative assessment of intratracheal instillation and aerosol inhalation.</a> Toxicology. 304, 158-166 (2013).</li><li>Skerrett, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+the+type+1+TNF+receptor+in+lung+inflammation+after+inhalation+of+endotoxin+or+Pseudomonas+aeruginosa.">Role of the type 1 TNF receptor in lung inflammation after inhalation of endotoxin or Pseudomonas aeruginosa.</a> American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiology. 276, L715-L727 (1999).</li><li>Roos, A. 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F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteinase-Activated+Receptor-1,+CCL2+and+CCL7+Regulate+Acute+Neutrophilic+Lung+Inflammation.">Proteinase-Activated Receptor-1, CCL2 and CCL7 Regulate Acute Neutrophilic Lung Inflammation.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. , (2013).</li><li>Korkmaz, B., Horwitz, M. S., Jenne, D. E., Gauthier, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Neutrophil Elastase, Proteinase 3, and Cathepsin G as Therapeutic Targets in Human Diseases. Pharmacological Reviews. 62, 726-759 (2010).</li><li>Bafadhel, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+Exacerbations+of+COPD:+Identification+of+Biological+Clusters+and+Their+Biomarkers.">Acute Exacerbations of COPD: Identification of Biological Clusters and Their Biomarkers.</a> Am. J. Respir. Crit. Care Med. , 201104-200597 (2011).</li><li>Hurst, J. R., Perera, W. R., Wilkinson, T. M. A., Donaldson, G. C., Donaldson, G. C., Wedzicha, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemic+and+Upper+and+Lower+Airway+Inflammation+at+Exacerbation+of+Chronic+Obstructive+Pulmonary.">Systemic and Upper and Lower Airway Inflammation at Exacerbation of Chronic Obstructive Pulmonary.</a> Am. J. Respir. Crit. Care Med. 173, 71-78 (2006).</li><li>Rabe, K. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+Strategy+for+the+Diagnosis,+Management,+and+Prevention+of+Chronic+Obstructive+Pulmonary+Disease:+GOLD+Executive+Summary.">Global Strategy for the Diagnosis, Management, and Prevention of Chronic Obstructive Pulmonary Disease: GOLD Executive Summary.</a> Am. J. Respir. Crit. Care Med. 176, 532-555 (2007).</li></ol>

Aerosolierte LPS erzeugt eine Entzündungsreaktion in den Atemwegen von Neutrophilen im epithelialen submucosa gekennzeichnet, umgebenden Räumen die leitenden Atemwege, sowie die Alveolen. Dies ist zusammen mit der erhöhten Gesamtproteingehalt in BALF anzeigt Plasmaleckage, repräsentativ für die Pathologie von akuter Lungenverletzung. LPS induziert eine sterile Entzündung ist die Reaktion unabhängig von der adaptiven Immunantwort, und es gibt Grenzen für die Relevanz für bakterielle Infektionen. Die Technik kann...

Lipopolysaccharid (LPS) ist ein Zellwandkomponente von Gram-negativen Bakterien 1. Herausforderung LPS ist ein gut dokumentiertes Modell des akuten Lungenversagens, ein Syndrom, das durch eine akute neutrophile Entzündung und Ödem 2. Zusätzlich ist Lungen Neutrophilie auch ein Markenzeichen von chronisch obstruktiver Lungenerkrankung (COPD) 3 und LPS bei Menschen verwendet wurde, um COPDExazerbationen 4 modellieren. So sind experimentellen Modellen der LPS Exposition klinisch relevante und wertvolle Werkzeuge für die menschliche Pathologie zu verstehen. Das Ziel der pulmonalen Verabreichung von hier beschriebenen aerosolized LPS ist es, eine neutrophile Entzündungsreaktion in den leitenden und den Atemwegen, ohne systemische Beteiligung erzeugen. Verschiedene Techniken von LPS wurden bereits beschrieben. Intravenöse Injektion von LPS ist die am häufigsten verwendete Art der Verabreichung. Obwohl diese Technik ist leicht zugänglich, ter Primärschaden ist an das Endothel, mit sekundären Zerstörung der Lungenepithel folgenden neutrophilen Migration in die Lunge. Intravenöse Verabreichung induziert auch systemische Entzündung 2, die das klinische Bild in Tiermodellen erschweren kann. Systemische Entzündung ist hingegen nicht durch intratracheale Verabreichung beobachtet. Diese Technik ist jedoch arbeitsintensiv und erfordert Anästhetika sowie erhebliche Trainings 5, 6. Darüber hinaus ist Lung dieses Verabreichungsweg abhängig von Atem 7. Somit wird Lungenablagerung durch die Narkosetiefe für die intra tracheale Verabreichung und variable Abscheidung in den Atemwegen beobachtet werden benötigt betroffen. Im Gegensatz dazu pulmonalen Verabreichung mit aerosoli LPS erfordert minimales Training, und kann leicht zu einer großen Anzahl von Tieren, die mit wenig oder gar keine Variation zwischen Individuen 5, 8 durchgeführt werden.Eine aktuelle Studie bestätigt, dass die Aerosolabgabe ist besser als die intratracheal im Hinblick auf die Abscheidung und relevanter Dosen von LPS induziert neutrophilen Entzündung mit diesem Modell 8. Frühere Studien haben gezeigt, dass diese Herausforderung vernebelt Pseudomonas aeruginosa LPS erzeugt eine deutliche Entzündungsreaktion in den Atemwegen Lumen und Lungenparenchym, einschließlich der Alveolarräumen 9, 10. Die Entzündung wird durch ein Vorherrschen der Neutrophilen und die Anwesenheit von Lungenödem gekennzeichnet und können daher verwendet werden, um die Pathogenese von akuter Lungenverletzung Adresse weiter und gewinnt die Kenntnis der Mechanismen Beitrag zur Krankheitspathologie.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:931px;" width="929">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:307px;">Name of the material/equipment&#160;</td>
			<td style="width:244px;">Company</td>
			<td style="width:145px;">Catalog number</td>
			<td style="width:235px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:307px;">Purified Pseudomonas aeruginosa LPS&#160;</td>
			<td style="width:244px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td style="width:235px;">Harmful. Recomended purification. LPS purified from other bactria may be used.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Pari LC sprint star nebulizer</td>
			<td style="width:244px;">PARI Respiratory Equipment Inc.&#160;</td>
			<td style="width:145px;">023G1250</td>
			<td style="width:235px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:307px;">TSI mass flowmeter 4040</td>
			<td style="width:244px;">TSI</td>
			<td style="width:145px;">4040</td>
			<td style="width:235px;">Alternative product from supplier may be used.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Saint-Gobain 15.9 mm Tygon tube</td>
			<td style="width:244px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:145px;">Z685704</td>
			<td style="width:235px;">Recomended brand.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:307px;">Plexiglas boxes with removable lids</td>
			<td style="width:244px;">Custom built</td>
			<td style="width:145px;">N/A</td>
			<td style="width:235px;">150 x 163 x 205 mm (a 2 mm hole on the side).&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">3M Half Facepiece Reusable Respirator</td>
			<td style="width:244px;">3M</td>
			<td style="width:145px;">7503</td>
			<td style="width:235px;">Recomended brand.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">3M Advanced Particulate Filters (P100)&#160;</td>
			<td style="width:244px;">3M</td>
			<td style="width:145px;">2291</td>
			<td style="width:235px;">Recomended brand.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Sissors</td>
			<td style="width:244px;">VWR</td>
			<td style="width:145px;">233-1104</td>
			<td style="width:235px;">Preferred scissors may be used.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Forceps&#160;</td>
			<td style="width:244px;">VWR</td>
			<td style="width:145px;">232-1313</td>
			<td style="width:235px;">Preferred forceps may be used.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Intramedic PE50 polyethylene tube</td>
			<td style="width:244px;">BD</td>
			<td style="width:145px;">427411</td>
			<td style="width:235px;">Recomended brand.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Ethicon 2-0 Perma-hand silk tread&#160;</td>
			<td style="width:244px;">VWR</td>
			<td style="width:145px;">95056-992</td>
			<td style="width:235px;">Recomended brand.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">26 &#189;&#160; gage needle&#160;</td>
			<td style="width:244px;"></td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td style="width:235px;">Alternative suppliers exist.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">1 mL BD slip-tip syringe, non-sterile</td>
			<td style="width:244px;">BD</td>
			<td style="width:145px;"><a href="http://catalog.bd.com/bdCat/viewProduct.doCustomer?productNumber=301025">301025</a></td>
			<td style="width:235px;">Alternative suppliers exist.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:307px;">60 mL BD Luer-Lok syringe, non-sterile, polypropolene&#160;</td>
			<td style="width:244px;">BD</td>
			<td style="width:145px;">301035</td>
			<td style="width:235px;">Alternative suppliers exist.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Fluka Hematoxylin-Eosin</td>
			<td style="width:244px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:145px;">3972</td>
			<td style="width:235px;">Alternative suppliers exist.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">T&#252;rk&#39;s solution</td>
			<td style="width:244px;">Merck Millipore</td>
			<td style="width:145px;">109277</td>
			<td style="width:235px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Table top centrifuge</td>
			<td style="width:244px;"></td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td style="width:235px;">Alternative manufacturers exist.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Cytospin 4 cytocentrifuge</td>
			<td style="width:244px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:145px;">A78300003</td>
			<td style="width:235px;">Alternative centrifuge can be used.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">HEMA-3 stat pack</td>
			<td style="width:244px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:145px;">23-123-869</td>
			<td style="width:235px;">Alternative staining kits exists.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:307px;">Formalin solution, neutral buffered, 10%</td>
			<td style="width:244px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:145px;">HT501128&#160;</td>
			<td style="width:235px;">Alternative suppliers exist.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a method for generating pulmonary neutrophilia using aerosolized lipopolysaccharide

Akutem Lungenversagen (ALI) ist eine schwere Erkrankung, die alveoläre Neutrophilie, mit begrenzten Behandlungsmöglichkeiten und eine hohe Sterblichkeit. Experimentelle Modelle der ALI sind der Schlüssel bei der Verbesserung unseres Verständnisses der Pathogenese der Erkrankung. Lipopolysaccharid (LPS) aus grampositiven Bakterien stammt induziert neutrophile Entzündung in den Atemwegen und Lungenparenchym von Mäusen. Efficient pulmonalen Verabreichung von Verbindungen, wie LPS ist jedoch schwierig zu erreichen. In der hier beschriebenen Vorgehensweise wird pulmonalen Verabreichung bei Mäusen durch Herausforderung aerosolized Pseudomonas aeruginosa LPS erreicht. Gelöst LPS wurde durch einen Zerstäuber mit Druckluft angeschlossen vernebelt. Die Mäuse wurden in einen kontinuierlichen Strom von LPS Aerosol in einer Plexiglas-Box 10 Minuten lang ausgesetzt, gefolgt von 2 min Konditionierung nach dem Aerosol wurde abgebrochen. Intubation und anschließende Bronchiallavage, gefolgt von Formalin Perfusion wurde als nächstes durchgeführt, die für die Charakterisierung des sterilen p ermöglichtulmonary Entzündung. Aerosolized LPS erzeugt eine Lungenentzündung gekennzeichnet durch alveoläre Neutrophilie, in Bronchiallavage und durch histologische Begutachtung festgestellt. Diese Technik kann gegen eine geringe Gebühr mit wenigen Geräten eingestellt werden, und erfordert nur minimale Schulung und Know-how. Das Belichtungssystem durch eine Routinejeder Labor durchgeführt werden, mit dem Potential, das Verständnis der Lungenpathologie verbessern.

Herausforderung aerosolized P. aeruginosa LPS ergibt in der Regel eine starke entzündliche Reaktion in den Atemwegslumen und Alveolarraum, gekennzeichnet durch ein Vorherrschen der Neutrophilen an beiden frühen und späten Zeitpunkten. Aerosolized LPS induziert Lungen Neutrophilie C57BL / 6by und BALB / c-Mäuse wurden einem Aerosol ausgesetzt P. aeruginosa LPS oder Vehikel und Neutrophile wurden in BALF aufgezählt. Die Gesamtzellzahl in der BAL...

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A Method for Generating Pulmonary Neutrophilia Using Aerosolized Lipopolysaccharide

Verfahren zur Erzeugung von Lungen Neutrophilie Mit aerosolisiertes Lipopolysaccharide

Wir beschreiben ein Verfahren zur Induktion von neutrophilen Lungenentzündung durch Herausforderung aerosolized Lipopolysaccharid durch Vernebelung, akuter Lungenschädigung-Modell. Darüber hinaus werden grundlegende chirurgische Techniken für Lungen Isolation, Intubation und Bronchiallavage ebenfalls beschrieben.

Acute lung injury (ALI) is a severe disease characterized by alveolar neutrophilia, with limited treatment options and high mortality. Experimental models ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

A Method for Labeling Vasculature in Embryonic Mice

Ein Verfahren zur Markierung Gefäßsystem in embryonalen Mäuse

The establishment of a functional blood vessel network is an essential part of organogenesis, and is required for optimal organ function. For example, in ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Diagnosing Pulmonary Tuberculosis with the Xpert MTB/RIF Test

Diagnose Lungentuberkulose mit dem Xpert MTB / RIF-Test

Tuberculosis (TB) due to Mycobacterium tuberculosis (MTB) remains a major public health issue: the infection affects up to one third of the world ...

Peptide:MHC Tetramer-based Enrichment of Epitope-specific T cells

Peptid: MHC-Tetramer-basierte Anreicherung von Epitop-spezifischer T-Zellen

A  basic necessity for researchers studying adaptive immunity with in vivo experimental models is an  ability to identify T cells based on their T cell ...

Cecal Ligation and Puncture-induced Sepsis as a Model To Study Autophagy in Mice

Blinddarm-Ligation und Punktion-induzierten Sepsis als Modell zur Autophagie in Mäusen untersucht

Experimental sepsis can be induced in mice using the cecal ligation and puncture (CLP) method, which causes polymicrobial sepsis. Here, a protocol is ...

Selective Harvesting of Marginating-pulmonary Leukocytes

Selektive Ernte von Marginating-Lungen-Leukozyten

Marginating-pulmonary (MP) leukocytes are leukocytes that adhere to the inner endothelium of the lung capillaries. MP-leukocytes were shown to exhibit ...

Two-photon Intravital Imaging of Leukocytes During the Immune Response in Lipopolysaccharide-treated Mouse Liver

Zwei-Photon intravitalen Bildgebung der Leukozyten im Rahmen der Immunantwort in Lipopolysaccharid behandelt Maus Leber

Sepsis is a type of severe infection that can cause organ failure and tissue damage. Although the mortality and morbidity rates associated with sepsis are ...

Generating Recombinant Avian Herpesvirus Vectors with CRISPR/Cas9 Gene Editing

Generierung von rekombinanten aviären Herpesvirus Vektoren mit CRISPR/Cas9 gen bearbeiten

Herpesvirus of turkeys (HVT) is an ideal viral vector for the generation of recombinant vaccines against a number of avian diseases, such as avian ...

Co-immunoprecipitation Assay for Studying Functional Interactions Between Receptors and Enzymes

Co-Immunopräzipitation Test zur Untersuchung funktionalen Wechselwirkungen zwischen Rezeptoren und Enzymen

Receptor-associated enzymes are the major mediators of cellular activation. These enzymes are regulated, at least in part, by physical interactions with ...

Novel Protocol for Generating Physiologic Immunogenic Dendritic Cells

Neuartiges Protokoll zur Generierung physiologischer immunogener Dendritischer Zellen

Extracorporeal photochemotherapy (ECP) is a widely used cancer immunotherapy for cutaneous T cell lymphoma (CTCL), operative in over 350 university ...