Name: molecular profiling of the invasive tumor microenvironment in a 3-dimensional model of colorectal cancer cells and ex vivo fibroblasts
Uploaded: 2014-04-29T14:00:00
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MB wird durch Zuschüsse aus einem MRC-Stipendium unterstützt. KP und AHM werden durch Zuschüsse von Wessex Medical Research and Cancer Research UK / RCS (England) (C28503/A10013) unterstützt. Wir sind dankbar für die Unterstützung der Universität von Southampton Histochemistry Research Unit.

1. Gründung der Primär Fibroblasten-Kulturen von Darm Explantate <ol><li> Erhalten Proben von normalem menschlichen Darmschleimhaut Gewebe direkt von der chirurgischen Operationssaal und Aussetzung in 7-10 ml PBS, ergänzt mit 100 Einheiten / ml Penicillin, 100 ug / ml Streptomycin und 0,25 &amp;mgr; g / ml Fungizon. </li><li> Im Labor stellen die Probe in der Mitte einer 10-cm-Gewebekulturschale und 3 x waschen mit PBS / Pen-Strep / Fungizone. Nach dem letzten Waschen saugen nicht. </li><li> Mit einer sterilen Pinz...

<ol>
	<li>Nystrom, M. L., Thomas, G. J., Stone, M., Mackenzie, I. C., Hart, I. R., Marshall, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+quantitative+method+to+analyse+tumour+cell+invasion+in+organotypic+culture.">Development of a quantitative method to analyse tumour cell invasion in organotypic culture.</a> J Pathol. 205 (4), 468-475 (2005).</li><li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miR-153+supports+colorectal+cancer+progression+via+pleiotropic+effects+that+enhance+invasion+and+chemotherapeutic+resistance.">miR-153 supports colorectal cancer progression via pleiotropic effects that enhance invasion and chemotherapeutic resistance.</a> Cancer Res. , (2013).</li><li>Bullock, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pleiotropic+actions+of+miR-21+highlight+the+critical+role+of+deregulated+stromal+microRNAs+during+colorectal+cancer+progression.">Pleiotropic actions of miR-21 highlight the critical role of deregulated stromal microRNAs during colorectal cancer progression.</a> Cell Death Dis. 20 (4), (2013).</li><li>Jenei, V., Nystrom, M. L., Thomas, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+invasion+in+an+organotypic+model.">Measuring invasion in an organotypic model.</a> Methods Mol Biol. 769, 223-232 (2011).</li><li>De Wever, O., Demetter, P., Mareel, M., Bracke, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stromal+myofibroblasts+are+drivers+of+invasive+cancer+growth.">Stromal myofibroblasts are drivers of invasive cancer growth.</a> Int J Cancer. 123 (10), 2229-2238 (2008).</li><li>Fries, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+of+fibroblast+heterogeneity+and+the+role+of+fibroblast+subpopulations+in+fibrosis.">Evidence of fibroblast heterogeneity and the role of fibroblast subpopulations in fibrosis.</a> Clin Immunol Immunopathol. 72 (3), 283-292 (1994).</li><li>Moutasim, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Betel-derived+alkaloid+up-regulates+keratinocyte+alphavbeta6+integrin+expression+and+promotes+oral+submucous+fibrosis.">Betel-derived alkaloid up-regulates keratinocyte alphavbeta6 integrin expression and promotes oral submucous fibrosis.</a> J Pathol. 223 (3), 366-377 (2011).</li><li>Winter, J., Jung, S., Keller, S., Gregory, R. I., Diederichs, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Many+roads+to+maturity:+microRNA+biogenesis+pathways+and+their+regulation.">Many roads to maturity: microRNA biogenesis pathways and their regulation.</a> Nat Cell Biol. 11 (3), 228-234 (2009).</li><li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+miRNA+expression+patterns+using+total+RNA+extracted+from+matched+samples+of+formalin-fixed+paraffin-embedded+(FFPE)+cells+and+snap+frozen+cells.">Comparison of miRNA expression patterns using total RNA extracted from matched samples of formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) cells and snap frozen cells.</a> BMC Biotechnol. 7 (36), (2007).</li><li>Szafranska, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+molecular+characterization+of+formalin-fixed,+paraffin-embedded+tissues+by+microRNA+expression+profiling.">Accurate molecular characterization of formalin-fixed, paraffin-embedded tissues by microRNA expression profiling.</a> J Mol Diagn. 10 (5), 415-423 (2008).</li></ol>

Hier beschreiben wir ein Verfahren, um spezifisch zu isolieren und zu charakterisieren, Tumorzellen, die die Fähigkeit, den Krebs Stroma in den frühesten Stadien der metastatische Fortschreiten in einer 3-dimensionalen Co-Kultur-Konstrukt von epithelialen und stromalen Zellen eindringen erworben. Co-Kultur-Modelle der CRC-Epithelzellen mit einem synthetischen Stroma enthält ex vivo menschlichen Kolon-Fibroblasten nebeneinander bestehen wurden verwendet, um CRC-Invasion in 3-Dimen...

Organotypische Co-Kulturen sind Tissue-Engineering-Modelle, die Hilfe bei der Rekonstruktion der in vivo Tumor-Mikroumgebung in drei Dimensionen durch Nebeneinander malignen Epithelzellen und Stromazellen in einem Kollagen-Gel, die wesentliche Komponenten der extrazellulären Matrix 3.1. Hauptsächlich als ein Verfahren zur Messung der Tumorinvasion konzipiert, organotypics die Abhängigkeit von in vivo-Tiermodellen, und vermeiden die Nachteile der anderen in vitro-Techniken, wie Transwell-Assays, bei dem eindringenden Zellen künstlich in einem monodispersen Zustand 2-4 gedrückt. Die Einbeziehung von Stromazellen in diesen Modellen, wie Fibroblasten, spiegelt die wesentliche Rolle der Tumor-Mikroumgebung bei der Regulierung der Invasion und Metastasierung maligner 3-4, jedoch ist die phänotypische Heterogenität des Stroma ist derart, dass, um die physiologische Relevanz der organotypischen maximieren Modelle, organspezifische, anatomisch genaue ex vivoFibroblasten aufgenommen werden sollten, wo immer möglich 3,6. Organotypics sind eine vielseitige Plattform, um Interaktionen zwischen Tumor-und Stromazellen studieren und werden zunehmend in neue Wege, um die Auswirkungen auf die Tumor-Invasion von chemischen Inhibitoren und gezielten Genveränderungen 7,8 untersuchen eingesetzt. Das Studium der invasiven Tumorrand ist eine besonders aufregende Aussicht. In organotypischen Modellen etabliert Darmkrebs (CRC) Zelllinien in der Regel eine gut geschichtete Epithel, und im Querschnitt, Zellen, die die Fähigkeit, die extrazelluläre Matrix (ECM) eindringen erworben haben, sind leicht erkennbar. Angesichts der etablierten Mikro-topographische Heterogenität von Tumor-und Tumor-assoziierten Stroma-Zellen in vivo, Extrahieren, diese Zellen mit Laser-Mikrodissektion und studiert sie in Isolation, können wichtige biologische Erkenntnisse über die Entstehung von Darmkrebs Metastasen zeigen, und wie kann es effizienter sein richtet. Ichn die folgende Methode, alle Patienten, die Gewebeproben eine schriftliche Einverständniserklärung, und die Studie wurde gespendet von den Institutionen regionaler Forschungsethikkommission genehmigt.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="634">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Colorectal cancer cell lines - example shown SW480</td>
			<td style="width:132px;">ATCC</td>
			<td style="width:119px;">ATCC CCL-228</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Collagen</td>
			<td style="width:132px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">354265</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Matrigel</td>
			<td style="width:132px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">354234</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Nylon membrane</td>
			<td style="width:132px;">Merck Millipore</td>
			<td style="width:119px;">VVLP01300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Metal grid</td>
			<td style="width:132px;">The Mesh Company</td>
			<td>WSS20-A4</td>
			<td>themeshcompany.com</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Laser microdissection platform</td>
			<td style="width:132px;">Leica Microsystems</td>
			<td style="width:119px;">Leica AS LMD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Membrane mounted slides</td>
			<td style="width:132px;">Molecular devices</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Cresyl Violet</td>
			<td style="width:132px;">Merck Millipore</td>
			<td style="width:119px;">1052350025</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

molecular profiling of the invasive tumor microenvironment in a 3-dimensional model of colorectal cancer cells and ex vivo fibroblasts

Invasion Darmkrebs (CRC)-Zellen haben die Fähigkeit, aus ihrer Schwesterzellen zu befreien, das Stroma zu infiltrieren, und renovieren die extrazelluläre Matrix (ECM) erworben. Charakterisierung der Biologie dieser phänotypisch bestimmte Gruppe von Zellen könnte wesentlich unser Verständnis der frühen Ereignisse verbessern während der metastatischen Kaskade. Tumorinvasion ist ein dynamischer Prozess, durch bidirektionale Interaktion zwischen dem Epithel und malignem Krebs Stroma erleichtert. Um Zell-spezifische Antworten auf den Tumor-Stroma-Schnittstelle haben wir organotypischen Kokultur und Laser Mikrodissektion Techniken kombiniert untersuchen. Organotypische Modelle, in denen wichtige Bestandteile wie Stroma-Fibroblasten sind 3-dimentioanally co-kultiviert mit Krebs Epithelzellen, sind sehr manipulierbar experimentelle Werkzeuge, die Invasion und Krebs-Stroma-Interaktionen ermöglichen, in der Nähe von-ph studiert werdenysiological Bedingungen. Laser Mikrodissektion (LMD) ist eine Technik, die die chirurgische Präparation und Extraktion der verschiedenen Schichten im Tumorgewebe, mit Mikrometer-Präzision Niveau bringt. Durch die Kombination dieser Techniken mit genomischer, Transkriptom und epigenetische Profiling wollen wir zu einem tieferen Verständnis der molekularen Eigenschaften der Invasion von Tumorzellen und die umliegenden Stroma-Gewebe zu entwickeln, und dabei möglicherweise offenbaren neue Biomarker und Chancen für die Entwicklung von Medikamenten in CRC.

Wir haben das obige Verfahren, um mehrere Kombinationen von CRC-Zelllinien und Stromazellen aufgebracht. Ein Beispiel hier präsentiert wird, ist SW480 CRC epithelialen Zelllinien mit primären humanen ex vivo Darm Fibroblasten. 3-dimensionale Co-Kulturen sind zum Vergleich der unterschiedlich exprimierten miRNAs zwischen Zellen an der invasiven Tumorfront ausgebildet (Fig. 1), um Mikroskopie und Laser-Capture-Mikrodissektion (Fig. 2) unterzogen und durch microRNA (miRNA) Profi...

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Molecular Profiling of the Invasive Tumor Microenvironment in a 3-Dimensional Model of Colorectal Cancer Cells and Ex vivo Fibroblasts

Molecular Profiling von Laser mikrodissektiert Zellen und Stroma aus synthetischen, Tissue-Engineering-Darmkrebs-Modelle stellt einen neuartigen Ansatz zur manipulierbaren und an der Schnittstelle zwischen Tumorzellen zu charakterisieren und zu sezieren die unverwechselbare Biologie an der invasiven Front und Krebs Stromazellen.

Molecular Profiling von der invasiven Tumor-Microenvironment in einem 3-Dimensional Model of Colorectal Cancer Cells und<em&gt; Ex-vivo-</em&gt; Fibroblasten

Invading colorectal cancer (CRC) cells have acquired the capacity to break free from their sister cells, infiltrate the stroma, and remodel the ...

Research

JoVE Journal

Medicine

Molecular Profiling of the Invasive Tumor Microenvironment in a 3-Dimensional Model of Colorectal Cancer Cells and Ex vivo Fibroblasts

Modeling and Imaging 3-Dimensional Collective Cell Invasion

Modeling and Imaging 3-Dimensional Collective Zellinvasion

A defining characteristic of cancer malignancy is invasion and metastasis 1. In some cancers (e.g. glioma 2), local invasion into surrounding healthy ...

Forschung

Medizin

Screening for Melanoma Modifiers using a Zebrafish Autochthonous Tumor Model

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Genomic studies of  human cancers have yielded a wealth of information about genes that are altered  in tumors1,2,3. A challenge arising from these ...

Live Imaging of Drug Responses in the Tumor Microenvironment in Mouse Models of Breast Cancer

Live-Imaging of Drug Responses in der Tumor-Mikroumgebung in Mausmodellen von Brustkrebs

The tumor microenvironment plays a pivotal role in tumor initiation, progression, metastasis, and the response to anti-cancer therapies. Three-dimensional ...

A Novel High-resolution In vivo Imaging Technique to Study the Dynamic Response of Intracranial Structures to Tumor Growth and Therapeutics

A Novel High-resolution In vivo Imaging Technique to Study the Dynamic Response of Intracranial Structures to Tumor Growth and Therapeutics

A Novel Hochauflösende<em&gt; In vivo</em&gt; Bildtechnik, um die Dynamik der intrakranielle Strukturen zu Tumorwachstum und Therapeutics Studieren

We have successfully integrated previously established Intracranial window (ICW) technology 1-4 with intravital 2-photon confocal microscopy to develop a ...

Initiation of Metastatic Breast Carcinoma by Targeting of the Ductal Epithelium with Adenovirus-Cre: A Novel Transgenic Mouse Model of Breast Cancer

Initiation Metastasierende Mammakarzinom durch Targeting des duktalen Epithel mit Adenovirus-Cre: Eine neue transgene Maus-Modell der Brustkrebs

Breast cancer is a heterogeneous disease involving complex cellular interactions between the developing tumor and immune system, eventually resulting in ...

An Ex vivo Model to Study Hormone Action in the Human Breast

An Ex vivo Model to Study Hormone Action in the Human Breast

Ein<em&gt; Ex-vivo-</em&gt; Modell um die Hormonwirkung in der menschlichen Brust Studieren

The study of hormone action in the human breast has been hampered by lack of adequate model systems. Upon in vitro culture, primary mammary epithelial ...

Three-Dimensional (3D) Tumor Spheroid Invasion Assay

Three-Dimensional 3D Tumor Spheroid Invasion Assay

Dreidimensionale (3D) Tumor Spheroid Invasionsassay

Invasion of surrounding normal tissues is generally considered to be a key hallmark of malignant (as opposed to benign) tumors. For some cancers in ...

Studying Pancreatic Cancer Stem Cell Characteristics for Developing New Treatment Strategies

Studieren Bauchspeicheldrüsenkrebs Stammzelleigenschaften für die Entwicklung neuer Behandlungsstrategien

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor ...

Isolation and Propagation of Circulating Tumor Cells from a Mouse Cancer Model

Isolierung und Vermehrung von zirkulierenden Tumorzellen aus einer Maus Cancer

Cancer metastasis is the foremost cause of cancer-associated deaths. Recent studies have shown that circulating tumor cells (CTCs) are important in cancer ...

A Brain Tumor/Organotypic Slice Co-culture System for Studying Tumor Microenvironment and Targeted Drug Therapies

Ein Hirntumor / Organotypischen Co-Kultursystem für die Untersuchung Tumor-Microenvironment und gezielte Arzneimitteltherapie

Brain tumors are a major cause of cancer-related morbidity and mortality. Developing new therapeutics for these cancers is difficult, as many of these ...