Name: molecular profiling of the invasive tumor microenvironment in a 3-dimensional model of colorectal cancer cells and ex vivo fibroblasts
Uploaded: 2014-04-29T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Molecular Profiling of the Invasive Tumor Microenvironment in a 3-Dimensional Model of Colorectal Cancer Cells and Ex vivo Fibroblasts at JoVE.com

MB er støttet av stipend midler fra en MRC fellesskap. KP og AHM støttes av tilskudd finansiering fra Wessex Medical Research and Cancer Research UK / RCS (England) (C28503/A10013). Vi er takknemlig for støtten fra University of Southampton histokjemi Research Unit.

En. Etablering av Primary fibroblastkulturer fra Tykktarms explants <ol><li> Få tak i prøver av normal menneskelig kolon slimhinnen vev direkte fra kirurgisk operasjonssalen, og suspendere i 7-10 ml PBS supplert med 100 enheter / ml penicillin, 100 mikrogram / ml streptomycin, og 0,25 mg / ml Fungizone. </li><li> I laboratoriet, plassere prøven i sentrum av en 10-cm vev kultur fatet og vask tre ganger med PBS / Pen-strep / Fungizone. Ikke aspirer etter siste vask. </li><li> Med steril tang og skalpell, skjære veve...

<ol>
	<li>Nystrom, M. L., Thomas, G. J., Stone, M., Mackenzie, I. C., Hart, I. R., Marshall, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+quantitative+method+to+analyse+tumour+cell+invasion+in+organotypic+culture.">Development of a quantitative method to analyse tumour cell invasion in organotypic culture.</a> J Pathol. 205 (4), 468-475 (2005).</li><li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miR-153+supports+colorectal+cancer+progression+via+pleiotropic+effects+that+enhance+invasion+and+chemotherapeutic+resistance.">miR-153 supports colorectal cancer progression via pleiotropic effects that enhance invasion and chemotherapeutic resistance.</a> Cancer Res. , (2013).</li><li>Bullock, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pleiotropic+actions+of+miR-21+highlight+the+critical+role+of+deregulated+stromal+microRNAs+during+colorectal+cancer+progression.">Pleiotropic actions of miR-21 highlight the critical role of deregulated stromal microRNAs during colorectal cancer progression.</a> Cell Death Dis. 20 (4), (2013).</li><li>Jenei, V., Nystrom, M. L., Thomas, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+invasion+in+an+organotypic+model.">Measuring invasion in an organotypic model.</a> Methods Mol Biol. 769, 223-232 (2011).</li><li>De Wever, O., Demetter, P., Mareel, M., Bracke, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stromal+myofibroblasts+are+drivers+of+invasive+cancer+growth.">Stromal myofibroblasts are drivers of invasive cancer growth.</a> Int J Cancer. 123 (10), 2229-2238 (2008).</li><li>Fries, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+of+fibroblast+heterogeneity+and+the+role+of+fibroblast+subpopulations+in+fibrosis.">Evidence of fibroblast heterogeneity and the role of fibroblast subpopulations in fibrosis.</a> Clin Immunol Immunopathol. 72 (3), 283-292 (1994).</li><li>Moutasim, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Betel-derived+alkaloid+up-regulates+keratinocyte+alphavbeta6+integrin+expression+and+promotes+oral+submucous+fibrosis.">Betel-derived alkaloid up-regulates keratinocyte alphavbeta6 integrin expression and promotes oral submucous fibrosis.</a> J Pathol. 223 (3), 366-377 (2011).</li><li>Winter, J., Jung, S., Keller, S., Gregory, R. I., Diederichs, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Many+roads+to+maturity:+microRNA+biogenesis+pathways+and+their+regulation.">Many roads to maturity: microRNA biogenesis pathways and their regulation.</a> Nat Cell Biol. 11 (3), 228-234 (2009).</li><li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+miRNA+expression+patterns+using+total+RNA+extracted+from+matched+samples+of+formalin-fixed+paraffin-embedded+(FFPE)+cells+and+snap+frozen+cells.">Comparison of miRNA expression patterns using total RNA extracted from matched samples of formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) cells and snap frozen cells.</a> BMC Biotechnol. 7 (36), (2007).</li><li>Szafranska, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+molecular+characterization+of+formalin-fixed,+paraffin-embedded+tissues+by+microRNA+expression+profiling.">Accurate molecular characterization of formalin-fixed, paraffin-embedded tissues by microRNA expression profiling.</a> J Mol Diagn. 10 (5), 415-423 (2008).</li></ol>

Her beskriver vi en fremgangsmåte for spesifikt å isolere og karakterisere tumor-celler som har ervervet evnen til å invadere cancer assosiert stroma i de tidligste stadier av metastatisk progresjon i en 3-dimensjonal ko-kultur konstruksjon av epithelial og stromale celler. Co-kultur modeller består av CRC epitelceller sidestilt med en syntetisk stroma inneholder ex vivo humane colonic fibroblaster ble brukt til å studere CRC invasjon i tre dimensjoner. Dette fysiologisk releva...

Organotypic co-kulturer er vev-konstruerte modeller som hjelpemiddel i å rekonstruere in vivo tumor mikromiljøet i tre dimensjoner ved å sidestille ondartede epitelceller og stromale celler i en kollagen gel inneholder essensielle ekstracellulære matrikskomponenter 1-3. Prinsipielt oppfattet som en metode for å måle tumorinvasjon, organotypics redusere avhengigheten av in vivo dyremodeller, og unngå ulempene ved andre in vitro-teknikker som Transwell-analyser, hvori invaderende celler blir tvunget inn i en kunstig mono-dispergert tilstand 2-4. Inkludering av stromale celler i disse modellene, slik som fibroblaster, reflekterer den essensielle rolle tumor mikromiljøet i regulering ondartet invasjon og metastase 3-4, men den fenotypiske heterogenitet av stroma er slik at for å maksimere den fysiologiske relevans av organotypic modeller, organspesifikk, anatomisk korrekt ex vivofibroblaster bør inkluderes der det er mulig 3,6. Organotypics er en allsidig plattform for å studere samspillet mellom tumor og stromale celler og blir stadig mer brukt i romanen måter å undersøke effekten på tumor invasjon av kjemiske hemmere og målrettede genet endringer 7,8. Studerer invasiv svulst margin er en spesielt spennende prospekt. I organotypic modeller, etablert kolorektal kreft (CRC) cellelinjer som produserer vanligvis en brønn stratifisert epitel lag, og i tverrsnitt, celler som har ervervet evnen til å invadere den ekstracellulære matriks (ECM) er lett synlige. I lys av den etablerte mikro topografisk heterogenitet av tumor og tumorassosierte stromale celler in vivo, trekke disse cellene ved hjelp av laser microdissection og studere dem i isolasjon, kan avsløre viktige biologiske innsikt om opprinnelsen til kolorektal kreft metastasering, og hvordan det kan være mer effektivt målrettet. Jegn følgende metodikk, alle pasienter som har donert vevsprøver gitt skriftlig informert samtykke, og studien ble godkjent av institusjonene regionale forskningsetiske komité.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="634">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Colorectal cancer cell lines - example shown SW480</td>
			<td style="width:132px;">ATCC</td>
			<td style="width:119px;">ATCC CCL-228</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Collagen</td>
			<td style="width:132px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">354265</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Matrigel</td>
			<td style="width:132px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">354234</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Nylon membrane</td>
			<td style="width:132px;">Merck Millipore</td>
			<td style="width:119px;">VVLP01300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Metal grid</td>
			<td style="width:132px;">The Mesh Company</td>
			<td>WSS20-A4</td>
			<td>themeshcompany.com</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Laser microdissection platform</td>
			<td style="width:132px;">Leica Microsystems</td>
			<td style="width:119px;">Leica AS LMD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Membrane mounted slides</td>
			<td style="width:132px;">Molecular devices</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Cresyl Violet</td>
			<td style="width:132px;">Merck Millipore</td>
			<td style="width:119px;">1052350025</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

molecular profiling of the invasive tumor microenvironment in a 3-dimensional model of colorectal cancer cells and ex vivo fibroblasts

Invaderende tykktarmskreft (CRC) celler har ervervet kapasitet til å bryte fri fra sine søster celler, infiltrere stroma, og fornye den ekstracellulære matrix (ECM). Karakteriserer biologien til dette fenotypisk distinkt gruppe av celler kunne vesentlig forbedre vår forståelse av tidlige hendelser i løpet av metastatisk kaskade. Tumor invasjonen er en dynamisk prosess tilrettelagt av toveis interaksjoner mellom ondartet epitel og kreft forbundet stroma. For å undersøke cellespesifikk respons på svulsten stroma-grensesnittet har vi kombinert organotypic ko-kultur og lasermikro disseksjon teknikker. Organotypic modeller, hvor sentrale stromal bestanddeler som fibroblaster er 3-dimentioanally co-kultivert med kreft epitelceller, er svært påvirkelig eksperimentelle verktøy som gjør det mulig invasjon og kreft-stroma interaksjoner som skal studeres i nær-physiological forhold. Laser mikrodisseksjon (LMD) er en teknikk som innebærer den kirurgiske disseksjon og utvinning av de forskjellige strata i tumorvevet, med mikrometer-nivå presisjon. Ved å kombinere disse teknikkene med genomisk, transcriptomic og epigenetisk profilering har vi som mål å utvikle en dypere forståelse av de molekylære egenskapene til invaderende kreftceller og omkringliggende stromal vev, og dermed potensielt avdekke nye biomarkører og muligheter for legemiddelutvikling i CRC.

Vi har benyttet den ovennevnte fremgangsmåte til flere kombinasjoner av CRC-cellelinjer og stromale celler. Ett eksempel som presenteres her er SW480 epitel CRC cellelinjer med primære humane ex vivo colonic fibroblaster. Tre-dimensjonale ko-kulturer blir konstruert (figur 1), utsettes for mikroskopi og laser-fangst mikrodisseksjon (figur 2), og analysert ved mikroRNA (miRNA) profilering (figur 3) for sammenligning av differensielt uttrykte miRNAs mellom cell...

Watch this Scientific Journal Video about Molecular Profiling of the Invasive Tumor Microenvironment in a 3-Dimensional Model of Colorectal Cancer Cells and Ex vivo Fibroblasts at JoVE.com

Molecular Profiling of the Invasive Tumor Microenvironment in a 3-Dimensional Model of Colorectal Cancer Cells and Ex vivo Fibroblasts

Molekylær profilering av laser microdissected celler og stroma fra syntetiske, vev-konstruerte kolorektal kreft modellene representerer en ny og påvirkelig tilnærming til karakterisere og dissekere den særegne biologi i skjæringspunktet mellom kreftceller ved invasiv foran og kreft forbundet stromale celler.

Molekylær Profilering av Invasive Tumor mikromiljøet i en 3-dimensjonal modell av kolorektal kreft celler og<em&gt; Ex vivo</em&gt; Fibroblaster

Invading colorectal cancer (CRC) cells have acquired the capacity to break free from their sister cells, infiltrate the stroma, and remodel the ...

Research

JoVE Journal

Medicine

Molecular Profiling of the Invasive Tumor Microenvironment in a 3-Dimensional Model of Colorectal Cancer Cells and Ex vivo Fibroblasts

Modeling and Imaging 3-Dimensional Collective Cell Invasion

Modellering og Imaging 3-Dimensional Collective Cell Invasion

A defining characteristic of cancer malignancy is invasion and metastasis 1. In some cancers (e.g. glioma 2), local invasion into surrounding healthy ...

Screening for Melanoma Modifiers using a Zebrafish Autochthonous Tumor Model

Screening for Melanom Modifiers ved hjelp av en Sebrafisk stedegen Tumor Model

Genomic studies of  human cancers have yielded a wealth of information about genes that are altered  in tumors1,2,3. A challenge arising from these ...

Live Imaging of Drug Responses in the Tumor Microenvironment in Mouse Models of Breast Cancer

Lever Imaging of Drug Responses i svulsten mikromiljøet i musemodeller av Breast Cancer

The tumor microenvironment plays a pivotal role in tumor initiation, progression, metastasis, and the response to anti-cancer therapies. Three-dimensional ...

A Novel High-resolution In vivo Imaging Technique to Study the Dynamic Response of Intracranial Structures to Tumor Growth and Therapeutics

A Novel High-resolution In vivo Imaging Technique to Study the Dynamic Response of Intracranial Structures to Tumor Growth and Therapeutics

A Novel Høy oppløsning<em&gt; In vivo</em&gt; Imaging teknikk for å studere den dynamiske respons Intrakraniale Structures til tumorvekst og Therapeutics

We have successfully integrated previously established Intracranial window (ICW) technology 1-4 with intravital 2-photon confocal microscopy to develop a ...

Initiation of Metastatic Breast Carcinoma by Targeting of the Ductal Epithelium with Adenovirus-Cre: A Novel Transgenic Mouse Model of Breast Cancer

Innvielse av metastatisk brystkreft ved målretting av Ductal Epitel med Adenovirus-Cre: A Novel transgene mus modell av brystkreft

Breast cancer is a heterogeneous disease involving complex cellular interactions between the developing tumor and immune system, eventually resulting in ...

An Ex vivo Model to Study Hormone Action in the Human Breast

An Ex vivo Model to Study Hormone Action in the Human Breast

En<em&gt; Ex vivo</em&gt; Modell for å studere Hormone Handling i Human Breast

The study of hormone action in the human breast has been hampered by lack of adequate model systems. Upon in vitro culture, primary mammary epithelial ...

Three-Dimensional (3D) Tumor Spheroid Invasion Assay

Three-Dimensional 3D Tumor Spheroid Invasion Assay

Tredimensjonale (3D) Tumor Spheroid invasjonen analysen

Invasion of surrounding normal tissues is generally considered to be a key hallmark of malignant (as opposed to benign) tumors. For some cancers in ...

Studying Pancreatic Cancer Stem Cell Characteristics for Developing New Treatment Strategies

Studerer Bukspyttkjertelkreft Stem Cell Kjennetegn for å utvikle nye behandlingsstrategier

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor ...

Isolation and Propagation of Circulating Tumor Cells from a Mouse Cancer Model

Isolasjon og forplantning av sirkulerende tumorceller fra en mus Cancer Model

Cancer metastasis is the foremost cause of cancer-associated deaths. Recent studies have shown that circulating tumor cells (CTCs) are important in cancer ...

A Brain Tumor/Organotypic Slice Co-culture System for Studying Tumor Microenvironment and Targeted Drug Therapies

En hjernesvulst / organotypiske Slice Co-kultur System for Studerer svulstens mikromiljø og målrettet Drug terapier

Brain tumors are a major cause of cancer-related morbidity and mortality. Developing new therapeutics for these cancers is difficult, as many of these ...