Name: an engulfment assay: a protocol to assess interactions between cns phagocytes and neurons
Uploaded: 2014-06-08T23:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Engulfment Assay: A Protocol to Assess Interactions Between CNS Phagocytes and Neurons at JoVE.com

Travail a été soutenu par des subventions de la Fondation de la famille Smith (BS), Dana Foundation (BS), John Scholars Program Merck (BS), NINDS (RO1-NS-07100801, BS), NRSA (F32-NS-066 698; DPS), Nancy Fondation Lurie Marks (DPS), NIH (P30-HD-18655; MRDDRC Imaging Core).

1. Antérograde étiquetage des RGC présynaptiques Entrées Remarque: Toutes les expériences impliquant l&#39;utilisation d&#39;animaux ont été examinés et supervisés par le soin des animaux et l&#39;utilisation comité institutionnel (IACUC) en conformité avec toutes les directives du NIH. <ol><li> Stériliser champ et instruments. </li><li> Anesthésier la souris avec 4 vol% d&#39;isoflurane dans une chambre d&#39;induction plexiglas (ce vol% d&#39;isoflurane fonctionne pour les s...

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Afin de mesurer avec précision la phagocytose, matériel englouti doit être étiqueté de manière à ce que le chercheur peut visualiser une fois la dégradation lysosomale s&#39;est produite. En outre, l&#39;imagerie haute résolution est nécessaire, suivie par l&#39;utilisation d&#39;un logiciel qui va permettre au chercheur de visualiser le volume de la cellule entière et quantifier son contenu. Dans ce protocole, nous décrivons une méthode très fiable et quantitative pour mesurer l&#39;engloutissement de pha...

<html> Circuits synaptiques remodeler tout au long de la vie d&#39;un animal. Dans le développement du cerveau, les synapses se forment dans l&#39;excès et doivent subir l&#39;élagage synaptique qui implique l&#39;élimination sélective d&#39;un sous-ensemble de synapses et le maintien et le renforcement de ces synapses qui restent 8-10. Ce procédé est nécessaire pour réaliser la connectivité caractéristique précise du système nerveux adulte. Chez l&#39;adulte, les synapses peuvent également être en plastique, en particulier dans le contexte de l&#39;apprentissage et de la mémoire. Les corrélats structurels de cette plasticité sont pensés pour inclure l&#39;ajout et / ou l&#39;élimination des épines dendritiques et boutons présynaptiques 11-13. En plus de ces rôles dans le système nerveux sain, remodelage synaptique est également impliqué dans une maladie du système nerveux / blessures 12,14,15. Par exemple, suite à une blessure de la moelle épinière, les axones sectionnés doivent ensuite remodeler et former de nouvelles synapses pour atteindre fonctionnelle 16-19 de récupération. nt &quot;&gt; émergents comme un aspect important de la plasticité synaptique est le processus de phagocytose ou l&#39;engloutissement des synapses destinés à l&#39;élimination 3,5,20. Nous avons récemment montré ce phénomène dans le contexte de l&#39;élagage synaptique dans le, cerveau de souris postnatale sain 7. précisément , les microglies, les cellules résidentes et les phagocytes immunitaires du système nerveux central, ont été présentés à engloutir entrées synaptiques au cours d&#39;une période de pointe et dans une région de la taille synaptique développement, la dorsale postnatale latérale corps genouillé (dLGN) du thalamus. blocus génétique ou pharmacologique de cette immersion entraîné des déficits soutenus dans la connectivité synaptique. Dans ce protocole, nous décrivons un test fiable et hautement quantitative pour mesurer l&#39;engloutissement de phagocyte médiation d&#39;entrées synaptiques. Pour les besoins de cet article, ce dosage sera présentée dans le contexte du système retinogeniculate développement, qui comprend des cellules ganglionnaires de la rétine (RGC) résidant dans la rétine quiINVESTISSEMENTS présynaptiques à la dLGN (figure 1A). Pour commencer, une stratégie d&#39;étiquetage antérograde résistant à la dégradation lysosomale sera décrite, qui est utilisé pour visualiser les entrées synaptiques RGC-spécifiques dans le dLGN (Figure 1) 7,21. Après cette description, une méthodologie détaillée pour l&#39;imagerie et la mesure quantitative de l&#39;engloutissement utilisant la microscopie confocale combinée à 3 dimensions (3D) surface rendu de volume sera donnée. Cette méthodologie est basée sur la préparation de tissu fixe mais peut aussi être adaptée pour être utilisée dans des études d&#39;imagerie en direct. Fait important, alors que le dosage a été validé dans le contexte du système de retinogeniculate sain, postnatal, on pourrait appliquer les mêmes techniques pour évaluer d&#39;autres interactions phagocyte des neurones dans tout le cerveau et pendant la maladie, ainsi que la fonction des phagocytes dans les autres systèmes de l&#39;organisme.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="533">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:144px;">Heat pad</td>
			<td style="width:159px;">Vet Equip, Inc.</td>
			<td style="width:168px;">965500&#160;</td>
			<td style="width:63px;"></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:144px;">Warm water source for heat pad</td>
			<td style="width:159px;">Kent Scientific</td>
			<td style="width:168px;">TP-700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:144px;">Stereo microscope</td>
			<td style="width:159px;">DSC Optical</td>
			<td style="width:168px;">Zeiss Opmi -6 Surgical Microscope</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="40" rowspan="2" style="height:40px;width:144px;">Sliding microtome with freezing stage</td>
			<td rowspan="2" style="width:159px;">Leica</td>
			<td rowspan="2" style="width:168px;">SM2010 R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:144px;">Microtome blade</td>
			<td style="width:159px;">Leica</td>
			<td style="width:168px;">14021607100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="57">
			<td height="57" style="height:57px;width:144px;">Fluorescent dissecting microscope</td>
			<td style="width:159px;">Nikon</td>
			<td style="width:168px;">SMZ800 with Epi-fluorescence attachment</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="57">
			<td height="57" style="height:57px;width:144px;">Spinning disk confocal microscope</td>
			<td style="width:159px;">Perkin Elmer</td>
			<td style="width:168px;">UltraView Vox Spinning Disk Confocal</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="51">
			<td height="51" style="height:51px;width:131px;">10 &#181;l Hamilton gas tight syringes</td>
			<td style="width:131px;">Hamilton</td>
			<td style="width:116px;">80030</td>
			<td style="width:144px;">Use a different syringe for each color dye/tracer</td>
		</tr>
		<tr height="51">
			<td height="51" style="height:51px;width:131px;">Hamilton needles</td>
			<td style="width:131px;">Hamilton</td>
			<td style="width:116px;">7803-05, specifications: blunt, 1.5&#34;</td>
			<td style="width:144px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="54" rowspan="3" style="height:54px;width:131px;">Alexa-conjugated cholera toxin &#946; subunit (CTB)</td>
			<td rowspan="3" style="width:131px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:116px;">488: C22841</td>
			<td rowspan="3" style="width:144px;">Reconstitute in sterile saline, 80 &#181;l (488), 100 &#181;l (594), 20 &#181;l (647)</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:116px;">594: C22842</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:116px;">647: C34778</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:131px;">Phosphate Buffered Saline&#160;(PBS)</td>
			<td style="width:131px;">Sigma</td>
			<td>P4417-50TAB</td>
			<td style="width:144px;"></td>
		</tr>
		<tr height="73">
			<td height="73" style="height:73px;width:131px;">Neomycin and Polymyxin B Sulfates and Bacitracin Zinc Ophthalmic Ointment USP (antibiotic ointment)</td>
			<td style="width:131px;">Bausch &#38; Lomb</td>
			<td style="width:116px;">24208-780-55</td>
			<td style="width:144px;"></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:131px;">30.5 gauge needle</td>
			<td style="width:131px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:116px;">305106</td>
			<td rowspan="3" style="width:144px;"></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:131px;">Spring scissors</td>
			<td style="width:131px;">Roboz</td>
			<td style="width:116px;">RS-5630</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:131px;">Cotton-tipped applicator</td>
			<td style="width:131px;">Fisher</td>
			<td style="width:116px;">23-400-125</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="104" rowspan="2" style="height:104px;width:131px;">Paraformaldeyde (PFA)</td>
			<td rowspan="2" style="width:131px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td rowspan="2" style="width:116px;">15710</td>
			<td rowspan="2" style="width:144px;">Dilute 16%to 4% in PBS. Paraformaldehye is toxic, use&#160; in a fume hood and wear personal protective equipment.</td>
		</tr>
		<tr height="83">
		</tr>
		<tr height="36">
			<td height="138" rowspan="4" style="height:138px;width:131px;">Dissection tools &#8211; scissors, forceps, spatula</td>
			<td style="width:131px;">Small scissors: Fine Science Tools</td>
			<td style="width:116px;">Small scissors:14370-22</td>
			<td rowspan="4" style="width:144px;"></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:131px;">Large scissors: Roboz</td>
			<td style="width:116px;">Large scissors: RS-6820</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:131px;">#55 forceps: Fine Science Tools</td>
			<td style="width:116px;">#55 forceps: 11255-20</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:131px;">Spatula: Ted Pella, Inc.</td>
			<td style="width:116px;">Spatula: 13504</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:131px;">Sucrose</td>
			<td style="width:131px;">Sigma</td>
			<td style="width:116px;">S8501-5KG</td>
			<td style="width:144px;">Make 30% sucrose in PBS (weight/vol)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:131px;">OCT Compound</td>
			<td style="width:131px;">VWR</td>
			<td style="width:116px;">25608-930</td>
			<td style="width:144px;"></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:131px;">Weigh boat</td>
			<td style="width:131px;">USA Scientific</td>
			<td style="width:116px;">2347-1426</td>
			<td style="width:144px;"></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:131px;">24-well plates</td>
			<td style="width:131px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:116px;">353047</td>
			<td style="width:144px;"></td>
		</tr>
		<tr height="87">
			<td height="87" style="height:87px;width:131px;">Sodium phosphate monobasic</td>
			<td style="width:131px;">Sigma</td>
			<td style="width:116px;">S6566-500G</td>
			<td rowspan="2" style="width:144px;">Make 0.2 M sodium phosphate monobasic (PB-A) in ddH20 and 0.2 M sodium phosphate dibasic (PB-B) in ddH20.&#160; To make 0.1 M PB, combine 19 ml PB-A and 81 ml PB-B, fill to 200 ml with ddH20&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:131px;">Sodium phosphate dibasic&#160;</td>
			<td style="width:131px;">Sigma</td>
			<td>S5136-500G</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:131px;">Coverslips, 22 X 50 mm, No. 1.5</td>
			<td style="width:131px;">VWR</td>
			<td style="width:116px;">48393 194</td>
			<td style="width:144px;"></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:131px;">Charged microscope slide</td>
			<td style="width:131px;">VWR</td>
			<td style="width:116px;">48311-703</td>
			<td style="width:144px;"></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:131px;">Vectasheild</td>
			<td style="width:131px;">Vector Laboratories</td>
			<td style="width:116px;">H-1200</td>
			<td style="width:144px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an engulfment assay: a protocol to assess interactions between cns phagocytes and neurons

La phagocytose est un procédé dans lequel une cellule engloutit matériau (cellule entière, des parties d&#39;une cellule, des débris, etc) dans son environnement extracellulaire environnant et digère ce matériau, généralement par suite, la dégradation lysosomale. Les microglies sont les cellules immunitaires résidentes du système nerveux central (SNC) dont la fonction phagocytaire a été décrit dans une large gamme de conditions de maladie neuro-dégénérative (par exemple, la clairance de la bêta-amyloïde dans la maladie d&#39;Alzheimer) pour le développement du cerveau en bonne santé (par exemple, synaptique élagage) 1-6. Le protocole suivant est un test de l&#39;engloutissement développé de visualiser et de quantifier l&#39;engloutissement de la microglie médiation d&#39;entrées synaptiques dans le développement du système de retinogeniculate de la souris 7. Bien que cet essai a été utilisé pour évaluer la fonction de la microglie dans ce contexte particulier, une approche similaire peut être utilisée pour évaluer d&#39;autres phagocytes dans l&#39;ensemble du cerveau (par exemple, les astrocytes) et le reste du corps(par exemple, les macrophages périphériques) ainsi que d&#39;autres contextes dans lesquels remodelage synaptique se produit (par exemple, une lésion cérébrale / maladies).

Récemment, nous avons utilisé ce test de l&#39;engloutissement de visualiser et de quantifier l&#39;engloutissement de la microglie médiation d&#39;entrées synaptiques dans le système retinogeniculate développement (Figure 1) 7. CGR de souris hétérozygotes CX3CR1-EGFP ont été tracées avec antérograde CTB-594 et CTB-647 dans les yeux droit et gauche, respectivement. Après ce traçage, la microglie EGFP-positives dans le dLGN ont été imagées. Ces images ont ensuite été surface...

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An Engulfment Assay: A Protocol to Assess Interactions Between CNS Phagocytes and Neurons

Les microglies sont les cellules immunitaires résidentes du système nerveux central (SNC) avec une grande capacité à phagocyter ou engloutir matériau dans leur environnement extracellulaire. Ici, un test largement applicable, fiable et hautement quantitative pour la visualisation et la mesure de l&#39;engloutissement de la microglie médiation de composants synaptiques est décrite.

Un enlisement test: Un protocole pour évaluer les interactions entre les neurones du système nerveux central et les phagocytes

Phagocytosis is a process in which a cell engulfs material (entire cell, parts of a cell, debris, etc.) in its surrounding extracellular environment and ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neural-Colony Forming Cell Assay: An Assay To Discriminate Bona Fide Neural Stem Cells from Neural Progenitor Cells

Neural-Formant Colonie dosage cellulaire: Un test pour distinguer Bona Fide Cellules souches neuronales à partir de cellules progénitrices neurales

The neurosphere assay (NSA) is one of the most frequently used methods to isolate, expand and also calculate the frequency of neural stem cells (NSCs). ...

Recherche

Neurosciences

Mapping and Application of Enhancer-trap Flippase Expression in Larval and Adult Drosophila CNS

Mapping and Application of Enhancer-trap Flippase Expression in Larval and Adult Drosophila CNS

Application de cartographie et de Enhancer-trap expression flippase dans larvaire et adulte Drosophile SNC

The Gal4/ UAS binary method is powerful for gene and neural circuitry manipulation in Drosophila. For most neurobiological studies, however, Gal4 ...

Analysis of Dendritic Spine Morphology in Cultured CNS Neurons

L&#39;analyse de la morphologie des épines dendritiques dans les neurones du SNC de culture

Dendritic spines are the sites of the majority of excitatory connections within the brain, and form the post-synaptic 
compartment of synapses. These ...

Cut-loading: A Useful Tool for Examining the Extent of Gap Junction Tracer Coupling Between Retinal Neurons

Coupez-chargement: Un outil utile pour examiner l&#39;étendue du couplage Tracer Gap jonction entre neurones rétiniens

In addition to chemical synaptic transmission, neurons that are connected by gap junctions can also communicate rapidly via electrical synaptic ...

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

Rapide Micro-iontophorèse de glutamate et le GABA: un outil utile d&#39;étudier l&#39;intégration synaptique

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...

A Method to Target and Isolate Airway-innervating Sensory Neurons in Mice

Une méthode pour cibler et Isoler Airway-innervant neurones sensoriels chez la souris

Somatosensory nerves transduce thermal, mechanical, chemical, and noxious stimuli caused by both endogenous and environmental agents. The cell bodies of ...

An Approach to Enhance Alignment and Myelination of Dorsal Root Ganglion Neurons

Une approche pour améliorer l&#39;alignement et myélinisation de ganglion de racine dorsale Neurones

Axon regeneration is a chaotic process due largely to unorganized axon alignment. Therefore, in order for a sufficient number of regenerated axons to ...

Stripe Assay to Study the Attractive or Repulsive Activity of a Protein Substrate Using Dissociated Hippocampal Neurons

Stripe Assay pour étudier l&#39;activité attractive ou répulsive d&#39;un substrat protéique utilisant dissociées hippocampique Neurones

Growing axons develop a highly motile structure at their tip, termed the growth cone. The growth cone contacts extracellular environmental cues to ...

The Indirect Neuron-astrocyte Coculture Assay: An In Vitro Set-up for the Detailed Investigation of Neuron-glia Interactions

The Indirect Neuron-astrocyte Coculture Assay: An In Vitro Set-up for the Detailed Investigation of Neuron-glia Interactions

Le Neuron-astrocyte indirecte coculture Assay: Un<em&gt; In vitro</em&gt; Mise en place pour l&#39;investigation détaillée des interactions Neuron-glie

Proper neuronal development and function is the prerequisite of the developing and the adult brain. However, the mechanisms underlying the highly ...

An Optical Assay for Synaptic Vesicle Recycling in Cultured Neurons Overexpressing Presynaptic Proteins

Une analyse optique pour le recyclage de vésicule synaptique dans les neurones en culture surexprimant protéines présynaptiques

At active presynaptic nerve terminals, synaptic vesicles undergo cycles of exo- and endocytosis. During recycling, the luminal domains of SV transmembrane ...