Name: an engulfment assay: a protocol to assess interactions between cns phagocytes and neurons
Uploaded: 2014-06-08T23:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Engulfment Assay: A Protocol to Assess Interactions Between CNS Phagocytes and Neurons at JoVE.com

Il lavoro è stato sostenuto da finanziamenti della Fondazione Famiglia Smith (BS), Dana Foundation (BS), John Merck Scholars Program (BS), NINDS (RO1-NS-07100801, BS), NRSA (F32-NS-066698; DPS), Nancy Lurie Marks Foundation (DPS), NIH (P30-HD-18655; MRDDRC Imaging Core).

1. Anterograda Etichettatura di RGC presinaptici ingressi Nota: Tutti gli esperimenti che comportano l&#39;uso di animali sono stati esaminati e supervisionate dalla cura degli animali e l&#39;uso comitato istituzionale (IACUC) in conformità a tutte le direttive NIH. <ol><li> Sterilizzare campo e gli strumenti. </li><li> Anestetizzare mouse con 4 vol% isoflurano in una camera di induzione plexiglas (questa vol% isoflurano lavora per topi neonati-adulti). Osservare i topi strettamente per ...

<ol>
	<li>Ransohoff, R. M., Perry, V. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglial+physiology:+unique+stimuli,+specialized+responses.">Microglial physiology: unique stimuli, specialized responses.</a> Annu Rev Immunol. 27, 119-145 (2009).</li><li>Aguzzi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia:+scapegoat,+saboteur,+or+something+else.">Microglia: scapegoat, saboteur, or something else.</a> Science. 339 (6116), 156-161 (2013).</li><li>Tremblay, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+microglia+in+the+healthy+brain.">The role of microglia in the healthy brain.</a> J Neurosci. 31 (45), 16064-16069 (2011).</li><li>Hanisch, U. K., Kettenmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia:+active+sensor+and+versatile+effector+cells+in+the+normal+and+pathologic+brain.">Microglia: active sensor and versatile effector cells in the normal and pathologic brain.</a> Nat. Neurosci. 10 (11), 1387-1394 (2007).</li><li>Sierra, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Janus-faced+microglia:+beneficial+and+detrimental+consequences+of+microglial+phagocytosis.">Janus-faced microglia: beneficial and detrimental consequences of microglial phagocytosis.</a> Front Cell Neurosci. 7, (2013).</li><li>Dheen, S. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglial+activation+and+its+implications+in+the+brain+diseases.">Microglial activation and its implications in the brain diseases.</a> Curr Med Chem. 14 (11), 1189-1197 (2007).</li><li>Schafer, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+sculpt+postnatal+neural+circuits+in+an+activity+and+complement-dependent+manner.">Microglia sculpt postnatal neural circuits in an activity and complement-dependent manner.</a> Neuron. 74 (4), 691-705 (2012).</li><li>Katz, L., Shatz, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+activity+and+the+constuction+of+cortical+circuits.">Synaptic activity and the constuction of cortical circuits.</a> Science. 274 (5290), 1133-1138 (1996).</li><li>Sanes, J. R., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+vertebrate+neuromuscular+junction.">Development of the vertebrate neuromuscular junction.</a> Annu Rev Neurosci. 22, 389-442 (1999).</li><li>Hua, J. Y., Smith, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+activity+and+the+dynamics+of+central+nervous+system+development.">Neural activity and the dynamics of central nervous system development.</a> Nat Neurosci. 7 (4), 327-332 (2004).</li><li>Holtmaat, A., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experience-dependent+structural+synaptic+plasticity+in+the+mammalian+brain.">Experience-dependent structural synaptic plasticity in the mammalian brain.</a> Nat Rev Neurosci. 10 (9), 647-658 (2009).</li><li>Butz, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity-dependent+structural+plasticity.">Activity-dependent structural plasticity.</a> Brain Res Rev. 60 (2), 287-305 (2009).</li><li>Bruel-Jungerman, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+plasticity+mechanisms+and+memory:+a+party+of+four.">Brain plasticity mechanisms and memory: a party of four.</a> Neuroscientist. 13 (5), 492-505 (2007).</li><li>Schafer, D. P., Stevens, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synapse+elimination+during+development+and+disease:+immune+molecules+take+centre+stage.">Synapse elimination during development and disease: immune molecules take centre stage.</a> Biochem Soc Trans. 38 (2), 476-481 (2010).</li><li>Alexander, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+complement+system:+an+unexpected+role+in+synaptic+pruning+during+development+and+disease.">The complement system: an unexpected role in synaptic pruning during development and disease.</a> Annu Rev Neurosci. 35, 369-389 (2012).</li><li>Brown, A., Weaver, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dark+side+of+neuroplasticity.">The dark side of neuroplasticity.</a> Exp Neurol. 235 (1), 133-141 (2012).</li><li>Navarro, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+27:+Neural+plasticity+after+nerve+injury+and+regeneration.">Chapter 27: Neural plasticity after nerve injury and regeneration.</a> Int Rev Neurobiol. 87, 483-505 (2009).</li><li>Tan, A. M., Waxman, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spinal+cord+injury,+dendritic+spine+remodeling,+and+spinal+memory+mechanisms.">Spinal cord injury, dendritic spine remodeling, and spinal memory mechanisms.</a> Exp Neurol. 235 (1), 142-151 (2012).</li><li>Wolpaw, J. R., Tennissen, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity-dependent+spinal+cord+plasticity+in+health+and+disease.">Activity-dependent spinal cord plasticity in health and disease.</a> Annu Rev Neurosci. 24, 807-843 (2001).</li><li>Schafer, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+&amp;#34;quad-partite&amp;#34;+synapse:+Microglia-synapse+interactions+in+the+developing+and+mature+CNS.">The &amp;#34;quad-partite&amp;#34; synapse: Microglia-synapse interactions in the developing and mature CNS.</a> Glia. 61 (1), 24-36 (2013).</li><li>Mukhopadhyay, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manganese-induced+trafficking+and+turnover+of+the+cis-Golgi+glycoprotein+GPP130.">Manganese-induced trafficking and turnover of the cis-Golgi glycoprotein GPP130.</a> Mol Biol Cell. 21 (7), 1282-1292 (2010).</li><li>Jung, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+fractalkine+receptor+CX(3)CR1+function+by+targeted+deletion+and+green+fluorescent+protein+reporter+gene+insertion.">Analysis of fractalkine receptor CX(3)CR1 function by targeted deletion and green fluorescent protein reporter gene insertion.</a> Mol Cell Biol. 20, 4106-4114 (2000).</li><li>Knobloch, M., Mansuy, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+spine+loss+and+synaptic+alterations+in+Alzheimer's+disease.">Dendritic spine loss and synaptic alterations in Alzheimer's disease.</a> Mol Neurobiol. 37 (1), 73-82 (2008).</li><li>Masliah, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+remodeling+during+aging+and+in+Alzheimer's+disease.">Synaptic remodeling during aging and in Alzheimer's disease.</a> J Alzheimers Dis. 9 (3 Suppl), 91-99 (2006).</li><li>Yoshiyama, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synapse+loss+and+microglial+activation+precede+tangles+in+a+P301S+tauopathy+mouse+model.">Synapse loss and microglial activation precede tangles in a P301S tauopathy mouse model.</a> Neuron. 53 (3), 337-351 (1016).</li><li>Milnerwood, A. J., Raymond, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+synaptic+pathophysiology+in+neurodegeneration:+insights+from+Huntington's+disease.">Early synaptic pathophysiology in neurodegeneration: insights from Huntington's disease.</a> Trends Neurosci. 33 (11), 513-523 (2010).</li><li>Noda, M., Suzumura, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sweepers+in+the+CNS:+Microglial+Migration+and+Phagocytosis+in+the+Alzheimer+Disease+Pathogenesis.">Sweepers in the CNS: Microglial Migration and Phagocytosis in the Alzheimer Disease Pathogenesis.</a> Int J Alzheimers Dis. , (2012).</li><li>Rotshenker, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+and+macrophage+activation+and+the+regulation+of+complement-receptor-3+(CR3/MAC-1)-mediated+myelin+phagocytosis+in+injury+and+disease.">Microglia and macrophage activation and the regulation of complement-receptor-3 (CR3/MAC-1)-mediated myelin phagocytosis in injury and disease.</a> J Mol Neurosci. 21 (1), 65-72 (2003).</li><li>Smith, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phagocytosis+of+myelin+in+demyelinative+disease:+a+review.">Phagocytosis of myelin in demyelinative disease: a review.</a> Neurochem Res. 24 (2), 261-268 (1999).</li></ol>

Al fine di misurare con precisione la fagocitosi, materiale inghiottito deve essere etichettato in modo tale che il ricercatore può visualizzare una volta è verificato degradazione lisosomiale. Inoltre, è necessaria imaging ad alta risoluzione, seguito dall&#39;uso di software che permetterà al ricercatore di visualizzare il volume dell&#39;intera cella e quantificare il contenuto. In questo protocollo, si descrive un metodo altamente affidabile e quantitativo per la misurazione fagocitazione phagocyte-mediata con C...

<html> Circuiti sinaptici rimodellare tutta la vita di un animale. Nel cervello in via di sviluppo, le sinapsi si formano in eccesso e devono subire la potatura sinaptica che comporta la rimozione selettiva di un sottoinsieme di sinapsi e la manutenzione e il potenziamento di quelle sinapsi che rimangono 8-10. Questo processo è necessario per conseguire la connettività precisa caratteristica del sistema nervoso adulto. Nell&#39;adulto, sinapsi possono anche essere di plastica, in particolare nel contesto di apprendimento e memoria. Le correlazioni strutturali di questa plasticità si pensa di includere l&#39;aggiunta e / o l&#39;eliminazione delle spine dendritiche e boutons presinaptici 11-13. Oltre a questi ruoli nel sistema nervoso sano, rimodellamento sinaptico è anche coinvolto nella nervoso 12,14,15 malattia del sistema / infortunio. Ad esempio, a seguito di lesioni del midollo spinale, gli assoni mozzate successivamente devono rimodellare e formare nuove sinapsi per raggiungere funzionale 16-19 recupero. nt &quot;&gt; Emergendo come un aspetto importante della plasticità sinaptica è il processo di fagocitosi o fagocitazione delle sinapsi destinati per la rimozione 3,5,20. Abbiamo recentemente dimostrato questo fenomeno nel contesto della potatura sinaptica nel sano, postnatale cervello di topo 7. particolare , microglia, i residenti del SNC cellule immunitarie e fagociti, sono stati mostrati per inghiottire ingressi presinaptici nel corso di un periodo di picco e in una regione di sviluppo di potatura sinaptica, la postnatale dorsale nucleo genicolato laterale (dLGN) del talamo. blocco genetica o farmacologica di questa fagocitazione portato a disavanzi sostenuti nella connettività sinaptica. In questo protocollo, si descrive un test affidabile e altamente quantitativo per misurare fagociti-mediata fagocitazione degli ingressi presinaptici. Ai fini del presente articolo, questo saggio sarà presentato nel contesto del sistema di sviluppo retinogeniculate, che comprende le cellule gangliari retiniche (RGC) residenti nella retina cheproiettare ingressi presinaptici al dLGN (Figura 1A). Per iniziare, un anterograda strategia etichettatura degradazione resistente lisosomiale sarà descritto, che viene utilizzato per visualizzare RGC-specifici ingressi presinaptici nel dLGN (Figura 1) 7,21. A seguito di questa descrizione, una metodologia dettagliata per l&#39;imaging e misurare quantitativamente fagocitazione usando la microscopia confocale in combinazione con 3 dimensioni (3D) della superficie volume rendering sarà dato. Questa metodologia si basa sulla preparazione del tessuto fisso, ma può anche essere adattato per l&#39;utilizzo in studi di imaging dal vivo. È importante sottolineare che, mentre il test è stato convalidato nel contesto del sistema retinogeniculate sano, postnatale, si potrebbe applicare le stesse tecniche per valutare altre interazioni fagociti neuroni in tutto il cervello e durante la malattia, così come la funzione dei fagociti in altri organi.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="533">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:144px;">Heat pad</td>
			<td style="width:159px;">Vet Equip, Inc.</td>
			<td style="width:168px;">965500&#160;</td>
			<td style="width:63px;"></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:144px;">Warm water source for heat pad</td>
			<td style="width:159px;">Kent Scientific</td>
			<td style="width:168px;">TP-700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:144px;">Stereo microscope</td>
			<td style="width:159px;">DSC Optical</td>
			<td style="width:168px;">Zeiss Opmi -6 Surgical Microscope</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="40" rowspan="2" style="height:40px;width:144px;">Sliding microtome with freezing stage</td>
			<td rowspan="2" style="width:159px;">Leica</td>
			<td rowspan="2" style="width:168px;">SM2010 R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:144px;">Microtome blade</td>
			<td style="width:159px;">Leica</td>
			<td style="width:168px;">14021607100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="57">
			<td height="57" style="height:57px;width:144px;">Fluorescent dissecting microscope</td>
			<td style="width:159px;">Nikon</td>
			<td style="width:168px;">SMZ800 with Epi-fluorescence attachment</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="57">
			<td height="57" style="height:57px;width:144px;">Spinning disk confocal microscope</td>
			<td style="width:159px;">Perkin Elmer</td>
			<td style="width:168px;">UltraView Vox Spinning Disk Confocal</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="51">
			<td height="51" style="height:51px;width:131px;">10 &#181;l Hamilton gas tight syringes</td>
			<td style="width:131px;">Hamilton</td>
			<td style="width:116px;">80030</td>
			<td style="width:144px;">Use a different syringe for each color dye/tracer</td>
		</tr>
		<tr height="51">
			<td height="51" style="height:51px;width:131px;">Hamilton needles</td>
			<td style="width:131px;">Hamilton</td>
			<td style="width:116px;">7803-05, specifications: blunt, 1.5&#34;</td>
			<td style="width:144px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="54" rowspan="3" style="height:54px;width:131px;">Alexa-conjugated cholera toxin &#946; subunit (CTB)</td>
			<td rowspan="3" style="width:131px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:116px;">488: C22841</td>
			<td rowspan="3" style="width:144px;">Reconstitute in sterile saline, 80 &#181;l (488), 100 &#181;l (594), 20 &#181;l (647)</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:116px;">594: C22842</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:116px;">647: C34778</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:131px;">Phosphate Buffered Saline&#160;(PBS)</td>
			<td style="width:131px;">Sigma</td>
			<td>P4417-50TAB</td>
			<td style="width:144px;"></td>
		</tr>
		<tr height="73">
			<td height="73" style="height:73px;width:131px;">Neomycin and Polymyxin B Sulfates and Bacitracin Zinc Ophthalmic Ointment USP (antibiotic ointment)</td>
			<td style="width:131px;">Bausch &#38; Lomb</td>
			<td style="width:116px;">24208-780-55</td>
			<td style="width:144px;"></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:131px;">30.5 gauge needle</td>
			<td style="width:131px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:116px;">305106</td>
			<td rowspan="3" style="width:144px;"></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:131px;">Spring scissors</td>
			<td style="width:131px;">Roboz</td>
			<td style="width:116px;">RS-5630</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:131px;">Cotton-tipped applicator</td>
			<td style="width:131px;">Fisher</td>
			<td style="width:116px;">23-400-125</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="104" rowspan="2" style="height:104px;width:131px;">Paraformaldeyde (PFA)</td>
			<td rowspan="2" style="width:131px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td rowspan="2" style="width:116px;">15710</td>
			<td rowspan="2" style="width:144px;">Dilute 16%to 4% in PBS. Paraformaldehye is toxic, use&#160; in a fume hood and wear personal protective equipment.</td>
		</tr>
		<tr height="83">
		</tr>
		<tr height="36">
			<td height="138" rowspan="4" style="height:138px;width:131px;">Dissection tools &#8211; scissors, forceps, spatula</td>
			<td style="width:131px;">Small scissors: Fine Science Tools</td>
			<td style="width:116px;">Small scissors:14370-22</td>
			<td rowspan="4" style="width:144px;"></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:131px;">Large scissors: Roboz</td>
			<td style="width:116px;">Large scissors: RS-6820</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:131px;">#55 forceps: Fine Science Tools</td>
			<td style="width:116px;">#55 forceps: 11255-20</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:131px;">Spatula: Ted Pella, Inc.</td>
			<td style="width:116px;">Spatula: 13504</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:131px;">Sucrose</td>
			<td style="width:131px;">Sigma</td>
			<td style="width:116px;">S8501-5KG</td>
			<td style="width:144px;">Make 30% sucrose in PBS (weight/vol)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:131px;">OCT Compound</td>
			<td style="width:131px;">VWR</td>
			<td style="width:116px;">25608-930</td>
			<td style="width:144px;"></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:131px;">Weigh boat</td>
			<td style="width:131px;">USA Scientific</td>
			<td style="width:116px;">2347-1426</td>
			<td style="width:144px;"></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:131px;">24-well plates</td>
			<td style="width:131px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:116px;">353047</td>
			<td style="width:144px;"></td>
		</tr>
		<tr height="87">
			<td height="87" style="height:87px;width:131px;">Sodium phosphate monobasic</td>
			<td style="width:131px;">Sigma</td>
			<td style="width:116px;">S6566-500G</td>
			<td rowspan="2" style="width:144px;">Make 0.2 M sodium phosphate monobasic (PB-A) in ddH20 and 0.2 M sodium phosphate dibasic (PB-B) in ddH20.&#160; To make 0.1 M PB, combine 19 ml PB-A and 81 ml PB-B, fill to 200 ml with ddH20&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:131px;">Sodium phosphate dibasic&#160;</td>
			<td style="width:131px;">Sigma</td>
			<td>S5136-500G</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:131px;">Coverslips, 22 X 50 mm, No. 1.5</td>
			<td style="width:131px;">VWR</td>
			<td style="width:116px;">48393 194</td>
			<td style="width:144px;"></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:131px;">Charged microscope slide</td>
			<td style="width:131px;">VWR</td>
			<td style="width:116px;">48311-703</td>
			<td style="width:144px;"></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:131px;">Vectasheild</td>
			<td style="width:131px;">Vector Laboratories</td>
			<td style="width:116px;">H-1200</td>
			<td style="width:144px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an engulfment assay: a protocol to assess interactions between cns phagocytes and neurons

La fagocitosi è un processo in cui una cellula avvolge materiale (intera cella, parti di una cellula, detriti, ecc) nel suo ambiente extracellulare circostante e successivamente digerisce questo materiale, comunemente mediante degradazione lisosomiale. Microglia sono le cellule immunitarie residenti del sistema nervoso centrale (CNS) la cui funzione fagocitica è stata descritta in una vasta gamma di condizioni di malattia neurodegenerativa (es. pallone beta-amiloide nella malattia di Alzheimer) allo sviluppo del cervello sano (ad esempio, sinaptica potature) 1-6. Il protocollo che segue è un test fagocitazione sviluppato per visualizzare e quantificare microglia-mediata fagocitazione degli ingressi presinaptici nel sistema retinogeniculate topo in via di sviluppo 7. Mentre questo test è stato utilizzato per valutare la funzione microglia in questo particolare contesto, un approccio simile può essere utilizzato per valutare altri fagociti tutto il cervello (ad esempio, astrociti) e il resto del corpo(ad esempio, macrofagi periferici) nonché altri contesti in cui avviene il rimodellamento sinaptico (ad esempio, il trauma cranico / malattia).

Recentemente, abbiamo utilizzato questo test fagocitazione per visualizzare e quantificare microglia-mediata fagocitazione degli ingressi presinaptici nel sistema retinogeniculate in via di sviluppo (Figura 1) 7. RGC da CX3CR1-EGFP topi eterozigoti sono stati rintracciati anterogradely con CTB-594 e CTB-647 negli occhi sinistro e destro rispettivamente. A seguito di tale tracciato, microglia EGFP-positivi all&#39;interno del dLGN sono stati ripresi. Queste immagini sono state successivamente ...

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An Engulfment Assay: A Protocol to Assess Interactions Between CNS Phagocytes and Neurons

Microglia sono le cellule immunitarie residenti del sistema nervoso centrale (CNS) con una elevata capacità di fagocitare o fagocitare materiale nel loro ambiente extracellulare. Qui, un saggio largamente applicabile, affidabile e altamente quantitativa per la visualizzazione e la misurazione microglia-mediata fagocitazione dei componenti sinaptiche è descritto.

Un test Engulfment: un protocollo per valutare le interazioni tra sistema nervoso centrale fagociti e neuroni

Phagocytosis is a process in which a cell engulfs material (entire cell, parts of a cell, debris, etc.) in its surrounding extracellular environment and ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neural-Colony Forming Cell Assay: An Assay To Discriminate Bona Fide Neural Stem Cells from Neural Progenitor Cells

Neural-formanti colonia saggio Cell: un test per discriminare Bona Fide cellule staminali neurali da cellule progenitrici neurali

The neurosphere assay (NSA) is one of the most frequently used methods to isolate, expand and also calculate the frequency of neural stem cells (NSCs). ...

Ricerca

Neuroscienze

Mapping and Application of Enhancer-trap Flippase Expression in Larval and Adult Drosophila CNS

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The Gal4/ UAS binary method is powerful for gene and neural circuitry manipulation in Drosophila. For most neurobiological studies, however, Gal4 ...

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Analisi di Morfologia spine dendritiche in colture di neuroni del SNC

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Cut-loading: A Useful Tool for Examining the Extent of Gap Junction Tracer Coupling Between Retinal Neurons

Cut-loading: uno strumento utile per esaminare fino di accoppiamento Tracer Junction Gap tra i neuroni della retina

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Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

Veloce micro-ionoforesi di glutammato e GABA: un utile strumento per indagare l&#39;integrazione Synaptic

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A Method to Target and Isolate Airway-innervating Sensory Neurons in Mice

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Stripe Assay per studiare l&#39;attività attrattiva o repulsiva di un substrato proteico Utilizzando dissociata neuroni dell&#39;ippocampo

Growing axons develop a highly motile structure at their tip, termed the growth cone. The growth cone contacts extracellular environmental cues to ...

The Indirect Neuron-astrocyte Coculture Assay: An In Vitro Set-up for the Detailed Investigation of Neuron-glia Interactions

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