Name: an engulfment assay: a protocol to assess interactions between cns phagocytes and neurons
Uploaded: 2014-06-08T23:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Engulfment Assay: A Protocol to Assess Interactions Between CNS Phagocytes and Neurons at JoVE.com

El trabajo fue apoyado por becas de la Fundación Smith Family (BS), la Fundación Dana (BS), John Merck Scholars Program (BS), NINDS (SR1-NS-07100801; BS), NRSA (F32-NS-066698; DPS), Nancy Fundación Lurie Marks (DPS), el NIH (P30-HD-18655; MRDDRC Imaging Core).

1. Anterógrada etiquetado de CGR Presinápticos Entradas Nota: Todos los experimentos que implican el uso de animales fueron revisados ​​y supervisados ​​por el cuidado de los animales y el uso comité institucional (IACUC) de conformidad con todas las directrices de NIH. <ol><li> Campo y los instrumentos Esterilizar. </li><li> Anestesie ratón con 4 vol% de isoflurano en una cámara de inducción de plexiglás (este volumen% isoflurano funciona para los ratones-neonatal adulto). ...

<ol>
	<li>Ransohoff, R. M., Perry, V. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglial+physiology:+unique+stimuli,+specialized+responses.">Microglial physiology: unique stimuli, specialized responses.</a> Annu Rev Immunol. 27, 119-145 (2009).</li><li>Aguzzi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia:+scapegoat,+saboteur,+or+something+else.">Microglia: scapegoat, saboteur, or something else.</a> Science. 339 (6116), 156-161 (2013).</li><li>Tremblay, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+microglia+in+the+healthy+brain.">The role of microglia in the healthy brain.</a> J Neurosci. 31 (45), 16064-16069 (2011).</li><li>Hanisch, U. 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J., Raymond, L. 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Con el fin de medir con precisión la fagocitosis, el material engullido debe etiquetarse de tal manera que el investigador puede visualizar una vez se ha producido la degradación lisosomal. Además, se requiere formación de imágenes de alta resolución, seguido por el uso de software que permita el investigador para visualizar el volumen de toda la célula y cuantificar su contenido. En este protocolo, se describe un método altamente fiable y cuantitativa para medir la inmersión de los fagocitos mediada por el uso...

<html> Circuitos sinápticos remodelar largo de la vida de un animal. En el cerebro en desarrollo, las sinapsis se forman en exceso y deben someterse a la poda sináptica que consiste en la eliminación selectiva de un subconjunto de las sinapsis y el mantenimiento y fortalecimiento de esas sinapsis que permanecen 8-10. Este proceso es necesario para lograr la conectividad característica precisa del sistema nervioso adulto. En el adulto, las sinapsis también pueden ser de plástico, en particular en el contexto del aprendizaje y la memoria. Las correlaciones estructurales de esta plasticidad se cree que incluyen la adición y / o eliminación de las espinas dendríticas y presináptica boutons 11-13. Además de estas funciones en el sistema nervioso saludable, remodelación sináptica también está implicada en la enfermedad del sistema nervioso 12,14,15 / lesión. Por ejemplo, después de una lesión de la médula espinal, los axones cortados deben posteriormente remodelar y formar nuevas sinapsis para lograr la recuperación funcional 16-19. nt &quot;&gt; Emergiendo como un aspecto importante de la plasticidad sináptica es el proceso de la fagocitosis o la inmersión de las sinapsis con destino a la eliminación 3,5,20. Recientemente, hemos mostrado este fenómeno en el contexto de la poda sináptica en el sano, el cerebro postnatal ratón 7. Específicamente , microglía, las células inmunes residentes del SNC y los fagocitos, se muestra para engullir entradas presinápticas durante un período de pico y en una región de la poda sináptica de desarrollo, el dorsal posnatal núcleo geniculado lateral (dLGN) del tálamo. bloqueo genética o farmacológica de esta inmersión traducido en déficits sostenidos en la conectividad sináptica. En este protocolo, se describe un ensayo fiable y altamente cuantitativo para medir la inmersión fagocítica mediada de insumos presináptica. A los efectos de este artículo, este ensayo se presentará en el marco del sistema de desarrollo de retinogeniculadas, que incluye las células ganglionares de la retina (CGR) que reside en la retina queproyectar entradas presináptica a la dLGN (Figura 1A). Para empezar, una estrategia de marcaje anterógrado resistente a la degradación lisosomal se describirá, que se utiliza para visualizar entradas presinápticas RGC-específicos en la dLGN (Figura 1) 7,21. Después de esta descripción, una metodología detallada para la imagen y la medición cuantitativa de inmersión utilizando microscopía confocal combinadas con 3 dimensiones (3D) de superficie representación de volumen se le dará. Esta metodología se basa en la preparación del tejido fija, pero también puede ser adaptado para su uso en estudios de formación de imágenes en vivo. Es importante destacar que, mientras que el ensayo ha sido validado en el contexto del sistema de retinogeniculadas saludable, posnatal, se podría aplicar las mismas técnicas para evaluar otras interacciones fagocito-neuronas en todo el cerebro y durante la enfermedad, así como la función fagocítica en otros sistemas de órganos.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="533">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:144px;">Heat pad</td>
			<td style="width:159px;">Vet Equip, Inc.</td>
			<td style="width:168px;">965500&#160;</td>
			<td style="width:63px;"></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:144px;">Warm water source for heat pad</td>
			<td style="width:159px;">Kent Scientific</td>
			<td style="width:168px;">TP-700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:144px;">Stereo microscope</td>
			<td style="width:159px;">DSC Optical</td>
			<td style="width:168px;">Zeiss Opmi -6 Surgical Microscope</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="40" rowspan="2" style="height:40px;width:144px;">Sliding microtome with freezing stage</td>
			<td rowspan="2" style="width:159px;">Leica</td>
			<td rowspan="2" style="width:168px;">SM2010 R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:144px;">Microtome blade</td>
			<td style="width:159px;">Leica</td>
			<td style="width:168px;">14021607100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="57">
			<td height="57" style="height:57px;width:144px;">Fluorescent dissecting microscope</td>
			<td style="width:159px;">Nikon</td>
			<td style="width:168px;">SMZ800 with Epi-fluorescence attachment</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="57">
			<td height="57" style="height:57px;width:144px;">Spinning disk confocal microscope</td>
			<td style="width:159px;">Perkin Elmer</td>
			<td style="width:168px;">UltraView Vox Spinning Disk Confocal</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="51">
			<td height="51" style="height:51px;width:131px;">10 &#181;l Hamilton gas tight syringes</td>
			<td style="width:131px;">Hamilton</td>
			<td style="width:116px;">80030</td>
			<td style="width:144px;">Use a different syringe for each color dye/tracer</td>
		</tr>
		<tr height="51">
			<td height="51" style="height:51px;width:131px;">Hamilton needles</td>
			<td style="width:131px;">Hamilton</td>
			<td style="width:116px;">7803-05, specifications: blunt, 1.5&#34;</td>
			<td style="width:144px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="54" rowspan="3" style="height:54px;width:131px;">Alexa-conjugated cholera toxin &#946; subunit (CTB)</td>
			<td rowspan="3" style="width:131px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:116px;">488: C22841</td>
			<td rowspan="3" style="width:144px;">Reconstitute in sterile saline, 80 &#181;l (488), 100 &#181;l (594), 20 &#181;l (647)</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:116px;">594: C22842</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:116px;">647: C34778</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:131px;">Phosphate Buffered Saline&#160;(PBS)</td>
			<td style="width:131px;">Sigma</td>
			<td>P4417-50TAB</td>
			<td style="width:144px;"></td>
		</tr>
		<tr height="73">
			<td height="73" style="height:73px;width:131px;">Neomycin and Polymyxin B Sulfates and Bacitracin Zinc Ophthalmic Ointment USP (antibiotic ointment)</td>
			<td style="width:131px;">Bausch &#38; Lomb</td>
			<td style="width:116px;">24208-780-55</td>
			<td style="width:144px;"></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:131px;">30.5 gauge needle</td>
			<td style="width:131px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:116px;">305106</td>
			<td rowspan="3" style="width:144px;"></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:131px;">Spring scissors</td>
			<td style="width:131px;">Roboz</td>
			<td style="width:116px;">RS-5630</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:131px;">Cotton-tipped applicator</td>
			<td style="width:131px;">Fisher</td>
			<td style="width:116px;">23-400-125</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="104" rowspan="2" style="height:104px;width:131px;">Paraformaldeyde (PFA)</td>
			<td rowspan="2" style="width:131px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td rowspan="2" style="width:116px;">15710</td>
			<td rowspan="2" style="width:144px;">Dilute 16%to 4% in PBS. Paraformaldehye is toxic, use&#160; in a fume hood and wear personal protective equipment.</td>
		</tr>
		<tr height="83">
		</tr>
		<tr height="36">
			<td height="138" rowspan="4" style="height:138px;width:131px;">Dissection tools &#8211; scissors, forceps, spatula</td>
			<td style="width:131px;">Small scissors: Fine Science Tools</td>
			<td style="width:116px;">Small scissors:14370-22</td>
			<td rowspan="4" style="width:144px;"></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:131px;">Large scissors: Roboz</td>
			<td style="width:116px;">Large scissors: RS-6820</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:131px;">#55 forceps: Fine Science Tools</td>
			<td style="width:116px;">#55 forceps: 11255-20</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:131px;">Spatula: Ted Pella, Inc.</td>
			<td style="width:116px;">Spatula: 13504</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:131px;">Sucrose</td>
			<td style="width:131px;">Sigma</td>
			<td style="width:116px;">S8501-5KG</td>
			<td style="width:144px;">Make 30% sucrose in PBS (weight/vol)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:131px;">OCT Compound</td>
			<td style="width:131px;">VWR</td>
			<td style="width:116px;">25608-930</td>
			<td style="width:144px;"></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:131px;">Weigh boat</td>
			<td style="width:131px;">USA Scientific</td>
			<td style="width:116px;">2347-1426</td>
			<td style="width:144px;"></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:131px;">24-well plates</td>
			<td style="width:131px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:116px;">353047</td>
			<td style="width:144px;"></td>
		</tr>
		<tr height="87">
			<td height="87" style="height:87px;width:131px;">Sodium phosphate monobasic</td>
			<td style="width:131px;">Sigma</td>
			<td style="width:116px;">S6566-500G</td>
			<td rowspan="2" style="width:144px;">Make 0.2 M sodium phosphate monobasic (PB-A) in ddH20 and 0.2 M sodium phosphate dibasic (PB-B) in ddH20.&#160; To make 0.1 M PB, combine 19 ml PB-A and 81 ml PB-B, fill to 200 ml with ddH20&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:131px;">Sodium phosphate dibasic&#160;</td>
			<td style="width:131px;">Sigma</td>
			<td>S5136-500G</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:131px;">Coverslips, 22 X 50 mm, No. 1.5</td>
			<td style="width:131px;">VWR</td>
			<td style="width:116px;">48393 194</td>
			<td style="width:144px;"></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:131px;">Charged microscope slide</td>
			<td style="width:131px;">VWR</td>
			<td style="width:116px;">48311-703</td>
			<td style="width:144px;"></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:131px;">Vectasheild</td>
			<td style="width:131px;">Vector Laboratories</td>
			<td style="width:116px;">H-1200</td>
			<td style="width:144px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an engulfment assay: a protocol to assess interactions between cns phagocytes and neurons

La fagocitosis es un proceso en el que una célula envuelve el material (célula entera, partes de una célula, escombros, etc) en su entorno extracelular que rodea y posteriormente se digiere este material, comúnmente a través de la degradación lisosomal. La microglía son las células inmunes residentes del sistema nervioso central (SNC) cuya función fagocítica se ha descrito en una amplia gama de condiciones de enfermedad neurodegenerativa (por ejemplo, aclaramiento de beta-amiloide en la enfermedad de Alzheimer) para el desarrollo del cerebro sano (por ejemplo, sináptica poda) 1-6. El siguiente protocolo es un ensayo de inmersión desarrollado para visualizar y cuantificar inmersión microglia mediada de insumos presinápticas del sistema retinogeniculadas ratón en desarrollo 7. Mientras que se utilizó este ensayo para evaluar la función microglia en este contexto particular, un enfoque similar se puede utilizar para evaluar otros fagocitos en todo el cerebro (por ejemplo, astrocitos) y el resto del cuerpo(por ejemplo, macrófagos periféricos), así como otros contextos en los que ocurre la remodelación sináptica (por ejemplo, lesión cerebral / enfermedad).

Recientemente, se utilizó este ensayo de inmersión para visualizar y cuantificar inmersión microglia mediada de entradas presinápticas en el sistema retinogeniculadas en desarrollo (Figura 1) 7. CGR de ratones heterocigotos CX3CR1-EGFP fueron anterogradely remontar con CTB-594 y CTB-647 en los ojos izquierdo y derecho, respectivamente. A raíz de esta localización, se obtuvieron imágenes de microglia EGFP-positivas dentro de la dLGN. Estas imágenes fueron posteriormente superficie pres...

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An Engulfment Assay: A Protocol to Assess Interactions Between CNS Phagocytes and Neurons

La microglía son las células inmunes residentes del sistema nervioso central (SNC) con una alta capacidad de fagocitar o material de envolver en su entorno extracelular. Aquí, se describe un ensayo ampliamente aplicable, fiable, y altamente cuantitativo para visualizar y medir la microglia mediada por inmersión de componentes sinápticas.

Un ensayo de Inmersión en: Un Protocolo para Evaluar Interacciones entre CNS fagocitos y neuronas

Phagocytosis is a process in which a cell engulfs material (entire cell, parts of a cell, debris, etc.) in its surrounding extracellular environment and ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neural-Colony Forming Cell Assay: An Assay To Discriminate Bona Fide Neural Stem Cells from Neural Progenitor Cells

Neural formadoras de colonias ensayo de células: un ensayo para discriminar Bona Fide células troncales nerviosas de células progenitoras neurales

The neurosphere assay (NSA) is one of the most frequently used methods to isolate, expand and also calculate the frequency of neural stem cells (NSCs). ...

Investigación

Neurociencias

Mapping and Application of Enhancer-trap Flippase Expression in Larval and Adult Drosophila CNS

Mapping and Application of Enhancer-trap Flippase Expression in Larval and Adult Drosophila CNS

La cartografía y la aplicación de potenciador de la trampa de expresión Flippase en larvas y adultos Drosophila SNC

The Gal4/ UAS binary method is powerful for gene and neural circuitry manipulation in Drosophila. For most neurobiological studies, however, Gal4 ...

Analysis of Dendritic Spine Morphology in Cultured CNS Neurons

Análisis de la morfología espina dendrítica en las neuronas del SNC cultivadas

Dendritic spines are the sites of the majority of excitatory connections within the brain, and form the post-synaptic 
compartment of synapses. These ...

Cut-loading: A Useful Tool for Examining the Extent of Gap Junction Tracer Coupling Between Retinal Neurons

De corte de carga: una herramienta útil para examinar el grado de acoplamiento Marcador brecha unión entre las neuronas retinianas

In addition to chemical synaptic transmission, neurons that are connected by gap junctions can also communicate rapidly via electrical synaptic ...

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

Fast Micro-iontoforesis de glutamato y GABA: una herramienta útil para investigar la integración sináptica

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...

A Method to Target and Isolate Airway-innervating Sensory Neurons in Mice

Un método para detectar y aislar las vías aéreas que inervan las neuronas sensoriales en ratones

Somatosensory nerves transduce thermal, mechanical, chemical, and noxious stimuli caused by both endogenous and environmental agents. The cell bodies of ...

An Approach to Enhance Alignment and Myelination of Dorsal Root Ganglion Neurons

Un Enfoque para Mejorar la alineación y la mielinización de las neuronas del ganglio de la raíz dorsal

Axon regeneration is a chaotic process due largely to unorganized axon alignment. Therefore, in order for a sufficient number of regenerated axons to ...

Stripe Assay to Study the Attractive or Repulsive Activity of a Protein Substrate Using Dissociated Hippocampal Neurons

Raya de ensayo para estudiar la actividad de atracción o repulsión de un sustrato de proteína usando las neuronas del hipocampo disociadas

Growing axons develop a highly motile structure at their tip, termed the growth cone. The growth cone contacts extracellular environmental cues to ...

The Indirect Neuron-astrocyte Coculture Assay: An In Vitro Set-up for the Detailed Investigation of Neuron-glia Interactions

The Indirect Neuron-astrocyte Coculture Assay: An In Vitro Set-up for the Detailed Investigation of Neuron-glia Interactions

La indirecta neurona-astrocito Coculture Ensayo: Un<em&gt; In Vitro</em&gt; Puesta en marcha de la investigación detallada de las interacciones neurona-glía

Proper neuronal development and function is the prerequisite of the developing and the adult brain. However, the mechanisms underlying the highly ...

An Optical Assay for Synaptic Vesicle Recycling in Cultured Neurons Overexpressing Presynaptic Proteins

Un análisis óptico para el reciclaje de la vesícula sináptica en neuronas cultivadas Overexpressing proteínas presinápticas

At active presynaptic nerve terminals, synaptic vesicles undergo cycles of exo- and endocytosis. During recycling, the luminal domains of SV transmembrane ...