Name: hot biological catalysis: isothermal titration calorimetry to characterize enzymatic reactions
Uploaded: 2014-04-04T13:45:00
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O fertilizante Produtos especializados Company (SFP) é reconhecida por fornecer os fundos necessários para este estudo.

1. Amostras Preparar <ol><li> Prepare a 2 ml de solução de enzima, e de 0,5 ml de solução de substrato para cada ensaio experimental. Dilui-se as soluções de concentrados de enzima e substrato em soluções tampão com composição idêntica para minimizar o calor de diluição e mistura, durante a adição do substrato. <ol><li> Escolha das condições de buffer que forem adequadas para evitar alteração do pH durante o experimento. Por exemplo, HEPES 20 mM, pH 7, é adequada para medições em pH neu...

<ol>
	<li>Leavitt, S., Freire, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+measurement+of+protein+binding+energetics+by+isothermal+titration+calorimetry.">Direct measurement of protein binding energetics by isothermal titration calorimetry.</a> Curr. Opin. Struct. Biol. 11, 560-566 (2001).</li><li>Ladbury, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+isothermal+titration+calorimetry+in+the+biological+sciences:+things+are+heating+up!+BioTechniques.">Application of isothermal titration calorimetry in the biological sciences: things are heating up! BioTechniques.</a> 37, 885-887 (2004).</li><li>Zambelli, B., Bellucci, M., Danielli, A., Scarlato, V., Ciurli, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Ni2++binding+properties+of+Helicobacter+pylori+NikR.">The Ni2+ binding properties of Helicobacter pylori NikR.</a> Chem. Commun. , 3649-3651 (2007).</li><li>Zambelli, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-affinity+Ni2++binding+selectively+promotes+binding+of+Helicobacter+pylori+NikR+to+its+target+urease+promoter.">High-affinity Ni2+ binding selectively promotes binding of Helicobacter pylori NikR to its target urease promoter.</a> J. Mol. Biol. 383, 1129-1143 (2008).</li><li>Duff, M. R., Grubbs, J., Howell, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isothermal+titration+calorimetry+for+measuring+macromolecule-ligand+affinity.">Isothermal titration calorimetry for measuring macromolecule-ligand affinity.</a> J. Vis. Exp. , (2011).</li><li>Ghai, R., Falconer, R. J., Collins, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+isothermal+titration+calorimetry+in+pure+and+applied+research--survey+of+the+literature+from+2010.">Applications of isothermal titration calorimetry in pure and applied research--survey of the literature from 2010.</a> J. Mol. Recognit. 25, 32-52 (2012).</li><li>Todd, M. 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Chem. 69, 435-441 (1926).</li><li>Krajewska, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ureases+I.+Functional,+catalytic+and+kinetic+properties:+A+review.">Ureases I. Functional, catalytic and kinetic properties: A review.</a> J. Mol. Cat. B. 59, 9-21 (2009).</li><li>Callahan, B. P., Yuan, Y., Wolfenden, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+burden+borne+by+urease.">The burden borne by urease.</a> J. Am. Chem. 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J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advantages+of+isothermal+titration+calorimetry+for+xylanase+kinetics+in+comparison+to+chemical-reducing-end+assays.">Advantages of isothermal titration calorimetry for xylanase kinetics in comparison to chemical-reducing-end assays.</a> Anal. Biochem. 410, 19-26 (2011).</li><li>Noske, R., Cornelius, F., Clarke, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigation+of+the+enzymatic+activity+of+the+Na+,K+-ATPase+via+isothermal+titration+microcalorimetry.">Investigation of the enzymatic activity of the Na+,K+-ATPase via isothermal titration microcalorimetry.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1797, 1540-1545 (2010).</li><li>Harmon, K. 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H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Enzyme kinetics: behavior and analysis of rapid equilibrium and steady-state enzyme systems. , (1993).</li></ol>

Significado do ITC para estudar a atividade enzimática em relação a métodos existentes Para além das suas aplicações clássicas para estudar equilíbrio de ligação, calorimetria de titulação isotérmica oferece um método rápido e confiável para caracterizar as reacções enzimáticas em solução usando o calor de reacção como uma sonda, sem a necessidade de modificação do sistema ou rotulagem. Os parâmetros cinéticos de k cat e K ...

A determinação quantitativa de reações bioquímicas fornece insights sobre os processos biológicos a base da vida. Calorimetria oferece uma metodologia livre de etiqueta para caracterizar quantitativamente praticamente todas as reações químicas em solução. Esta técnica mede o calor libertado ou absorvido ao longo do tempo, e é, portanto, um sistema de detecção universal e uma metodologia muito conveniente para quantificar a quantidade de moléculas de reacção de ligação (ou seja, a termodinâmica), bem como para medir a velocidade da reacção (isto é, a cinética). Em particular, calorimetria de titulação isotérmica (ITC) foi adotado como método de escolha para caracterizar a termodinâmica dos equilíbrios biomoleculares, envolvendo proteína-ligante, proteína-proteína, proteína-íons metálicos e interações DNA-proteína 1-6. Além disso, a capacidade de ITC para fornecer informação cinética faz com que seja um sistema poderoso para medir a catálise da enzima, embora o potencial desta aplicação é aindasubestimado 7-9. A equação de Michaelis-Menten de 10 é uma descrição quantitativa das reacções enzimáticas, uma vez que proporciona uma relação entre a velocidade de reacção e a concentração do substrato, dependendo de dois parâmetros cinéticos: a constante de Michaelis (K M) e a constante de velocidade catalítica (kcat) . O kcat / K M é referida como a eficiência catalítica de uma enzima. Na prática, a determinação de K M e K cat para uma reacção específica proporciona uma descrição completa da catálise. Numa reacção típica enzimática (Figura 1), um substrato (S) interage com a enzima (E), formando o complexo enzima-substrato (ES), que é subsequentemente activado no estado de transição (ES *). O último é convertido no complexo enzima-produto (PE) que, eventualmente, se dissocia. Estes passos são descritos através da reacção seguinte. <img fo:content-width="2in" src="/files/ftp_upload/51487/51487eq1.jpg" width="197" /> (1) onde k é uma constante de velocidade para a formação do complexo ES, k -1 é a constante de velocidade da dissociação do complexo ES, enquanto kcat é a constante de velocidade catalítica ou número de turnover. De acordo com a equação de Michaelis-Menten de 10, a taxa da reacção pode ser calculado como: <img fo:content-width="1.5in" src="/files/ftp_upload/51487/51487eq2.jpg" width="144" /> (2) em que M = K (k-1 + k cat) / k 1 e k cat = Vmax / [E], com v max sendo a velocidade máxima atingida quando todos enzima é ligada ao substrato. O calorímetro de titulação isotérmica é o instrumento utilizado neste estudo para caracterizar a hidrólise enzimática de ureia. Este instrumento é feito de um escudo adiabático contendo duas pilhas em forma de cunhadas (Figura 1). Estas estão ligadas ao lado de fora, com tubos de acesso estreitas. A célula da amostra (cerca de 1,4 ml) é carregado com a solução de enzima, enquanto que a célula de referência é geralmente cheia com água ou com o solvente usado para a análise. Uma seringa de rotação com uma agulha comprida e uma pá de agitação ligado, geralmente contendo ca. 0,3 ml de solução de substrato, é montada na célula de amostra. Um dispositivo termoeléctrico mede a diferença de temperatura entre a amostra e a célula de referência e, usando uma &quot;rede de realimentação da célula&quot;, que mantém esta diferença a zero pela adição ou subtracção de calor. Durante o ensaio, o substrato é injectado na solução de enzima a uma temperatura escolhida constante. Quando o enzymatic reacção tem lugar, a quantidade de calor libertada ou absorvida é proporcional ao número de moléculas de substrato que são convertidos em moléculas do produto. Além disso, a taxa de fluxo de calor está directamente relacionada com a velocidade da reacção. Os dados medidos, aparecendo como um desvio de calor a partir do traçado da linha de base inicial (Figura 1), representam a energia térmica (μcal / seg) fornecido pelo aparelho para a célula de amostra, que é proporcional ao fluxo de calor que ocorre na célula de amostra ao longo do tempo. <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51487/51487fig1highres.jpg" width="500" /> Figura 1. Representação esquemática do calorímetro de titulação isotérmica para estudar as reacções enzimáticas. Uma reacção enzimática que ocorre na titulação do substrato (na seringa de injecção), para a solução de enzima (na célula de amostra) resulta em uma mudança da terapmal poder liberado pelo calorímetro, necessário para manter a diferença de temperatura entre a célula de amostra e a constante da célula de referência. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51487/51487fig1highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver imagem ampliada.</a> Em geral, a troca de calor (Q) é proporcional à entalpia molar da reacção (AH) e o número de moles de produto gerado (n), que por sua vez é determinado pelos tempos totais de volume da concentração: <img fo:content-width="2in" src="/files/ftp_upload/51487/51487eq3.jpg" width="200" /> (3) A formação do produto ao longo do tempo (dP / dt), o que corresponde à velocidade da reacção, pode, assim, ser relacionado com a quantidade de calor gerado durante o mesmo tempo (dQ / dt), através da relação: <img fo:content-width="2in" src="/files/ftp_upload/51487/51487eq4.jpg" width="150" /> (4) De acordo com esta equação, a fim de se obter um lote de Michaelis-Menten, é necessário medir i) o total AH entalpia molar, e ii) o fluxo de calor dQ / dt, em diferentes concentrações de substrato. Geralmente, isto é realizado em duas experiências diferentes: na primeira experiência (Método 1, M1), o substrato é injectado na solução de enzima e do calor para a conversão completa do substrato é medida; na segunda experiência (Método 2, M2), injecções múltiplas de substrato são realizados e a taxa de produção de calor é medido em diferentes concentrações de substrato. Estes dois conjuntos de dados são suficientes para derivar os parâmetros cinéticos K M e k cat. No presente artigo, um protocolo geral para determinar os parâmetros cinéticos de reações enzimáticas realizadas utilizando ITC é descrito. O método foi aplicado a hidrólise da uréia por Canavalia ensiformis uréiase, como um sistema de referência. A boa concordância entre os resultados obtidos através deste método e os dados relatados na literatura demonstra a confiabilidade desta abordagem.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="796">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">HEPES</td>
			<td style="width:111px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">H3375</td>
			<td style="width:323px;">dissolving in water and adjusting pH with NaOH</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">TRIZMA-Base</td>
			<td style="width:111px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">T1503</td>
			<td>dissolving in water and adjusting pH with HCl</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">Sodium dihydrogen phosphate</td>
			<td style="width:111px;">Riedel-de-Haen</td>
			<td style="width:119px;">4270</td>
			<td>dissolving in water</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">Sodium phosphate dibasic</td>
			<td style="width:111px;">Riedel-de-Haen</td>
			<td style="width:119px;">30427</td>
			<td>dissolving in water</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">Urea</td>
			<td style="width:111px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">U4128</td>
			<td>dissolving in water at 40 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:245px;">Canavalia ensiformis urease (type C-3)</td>
			<td style="width:111px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">U0251</td>
			<td>dissolving in 20 mM HEPES pH 7 and stored at -80 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:245px;">VP-ITC on Origin 7.0</td>
			<td style="width:111px;">MicroCal (GE Healthcare)</td>
			<td style="width:119px;">SYS13901</td>
			<td>instrument&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:245px;">VPViewer2000 1.30.00 on Origin 7.0</td>
			<td style="width:111px;">MicroCal (GE Healthcare)</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>data acquisition software supplied with the instrument</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

hot biological catalysis: isothermal titration calorimetry to characterize enzymatic reactions

Calorimetria de titulação isotérmica (ITC) é uma técnica bem descrito que mede o calor liberado ou absorvido durante uma reação química, utilizando-o como uma sonda intrínseca para caracterizar praticamente todos os processos químicos. Hoje em dia, esta técnica é amplamente aplicada para determinar os parâmetros termodinâmicos de equilíbrio de ligação biomoleculares. Além disso, o ITC demonstrou ser capaz de medir directamente a cinética e os parâmetros termodinâmicos (cat K, K M, ÔH) de reacções enzimáticas, embora esta aplicação é ainda pouco explorados. Como as mudanças de calor ocorrer espontaneamente durante a catálise enzimática, a ITC não exige qualquer modificação ou rotulagem do sistema sob análise e pode ser realizada em solução. Além disso, o método tem pouca quantidade de material. Estas propriedades fazem com que uma ferramenta de valor inestimável ITC, poderosa e única para o estudo da cinética de enzimas em várias aplicações, tais como, por exemplo, a descoberta de medicamentos. <p class = &quot;jove_content&quot;&gt; Neste trabalho um método baseado em ITC experimental para quantificar a cinética e termodinâmica das reações enzimáticas é minuciosamente descrito. Este método é aplicado para determinar k cat e K M da hidrólise enzimática de uréia por Canavalia ensiformis (feijão de porco) urease. Cálculo da entalpia molar intrínseca (AH int) a reacção é realizada. Os valores assim obtidos são consistentes com os dados anteriores descritos na literatura, o que demonstra a fiabilidade do método.

A urease (EC 3.5.1.5; ureia amidohidrolase) é uma enzima que contém níquel multisubunit encontrado em Archea, bactérias, plantas e eucariotas unicelulares. Esta proteína actua no último passo da mineralização do azoto orgânico, que catalisam a hidrólise de ureia em amónia e carbamato, o qual se decompõe espontaneamente para dar uma segunda molécula de amoníaco e bicarbonato (Equação 6) 12. <img fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/51487/514...

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Hot Biological Catalysis: Isothermal Titration Calorimetry to Characterize Enzymatic Reactions

Isotérmico medidas de calorimetria de titulação fluxo de calor liberado ou absorvido nas reações químicas. Este método pode ser usado para quantificar a enzima-catálise. Neste trabalho, o protocolo para a instalação instrumental, experiência em execução e análise de dados é geralmente descrito, e aplicada à caracterização de hidrólise enzimática de uréia por jack urease do feijão.

Catálise Biológica a Quente: Calorimetria de Titulação Isotérmica para Caracterizar Reações Enzimáticas

Isothermal titration calorimetry (ITC) is a well-described technique that measures the heat released or absorbed during a chemical reaction, using it as ...

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