Wir möchten die NIH Gemeinsamen Fonds anerkennen - Protein Einfangreagenzien Programm für die Finanzierung der Entwicklung des rekombinanten Antikörpers Netzwerk Antikörperselektion und Charakterisierung Pipeline und der kanadischen Stiftung für Innovation zur Finanzierung Kauf des Roboterauswahl Plattform.

1. Antigen-Generation HINWEIS: Antigen-Domänen synthetisiert und durch eine Vielzahl von kommerziellen Anbietern in einen geeigneten IPTG-induzierbare Expressionskonstrukt kloniert werden. <ol><li> Transform-Expressionskonstrukte in chemisch kompetente, T1-Phagen resistent, BL21 E. coli-Zellen hergestellt, indem 10 ng von DNA in 20 ul 1X KCM auf Eis kodiert in einer 96-Well-PCR-Platte, gefolgt von der Zugabe von 20 l chemisch kompetente Zellen. </li><li> Inkubieren der Zell / DNA...

<ol>
	<li>Winter, G., Milstein, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Man-made+antibodies.">Man-made antibodies.</a> Nature. 349, 293-299 (1991).</li><li>Miersch, S., Sidhu, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+antibodies:+concepts,+potential+and+practical+considerations.">Synthetic antibodies: concepts, potential and practical considerations.</a> Methods. 57, 486-498 (2012).</li><li>Schofield, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+phage+display+to+high+throughput+antibody+generation+and+characterization.">Application of phage display to high throughput antibody generation and characterization.</a> Genome Biol. 8, R254 (2007).</li><li>Hust, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+human+scFv+antibody+generation+pipeline+for+proteome+research.">A human scFv antibody generation pipeline for proteome research.</a> J. 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Biotechnol. 27, 118-128 (2010).</li><li>Pershad, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generating+a+panel+of+highly+specific+antibodies+to+20+human+SH2+domains+by+phage+display.">Generating a panel of highly specific antibodies to 20 human SH2 domains by phage display.</a> Protein Eng. Des. Sel. 23, 279-288 (2010).</li><li>Turunen, L., Takkinen, K., Soderlund, H., Pulli, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+panning+and+screening+procedure+on+microplates+for+antibody+generation+from+phage+display+libraries.">Automated panning and screening procedure on microplates for antibody generation from phage display libraries.</a> J Biomol. Screen. 14, 282-293 (2009).</li><li>Hughes, R. A., Miklos, A. E., Ellington, A. 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Biol. 373, 924-940 (2007).</li><li>Paduch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generating+conformation-specific+synthetic+antibodies+to+trap+proteins+in+selected+functional+states.">Generating conformation-specific synthetic antibodies to trap proteins in selected functional states.</a> Methods. 60, 3-14 (2013).</li><li>Studier, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+production+by+auto-induction+in+high+density+shaking+cultures.">Protein production by auto-induction in high density shaking cultures.</a> Protein Expr. Purif. 41, 207-234 (2005).</li><li>Huang, H., Sidhu, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+binding+specificities+of+peptide+recognition+modules+by+high-throughput+phage+display+selections.">Studying binding specificities of peptide recognition modules by high-throughput phage display selections.</a> Methods Mol. Biol. 781, 87-97 (2011).</li><li>McLaughlin, M. E., Sidhu, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+and+analysis+of+peptide-recognition+domain+specificities+by+phage+display+and+deep+Sequencing.">Engineering and analysis of peptide-recognition domain specificities by phage display and deep Sequencing.</a> Methods Enzymol. 523, 327-349 (2013).</li><li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding.">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Anal. Biochem. 72, 248-254 (1976).</li><li>den Engelsman, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategies+for+the+assessment+of+protein+aggregates+in+pharmaceutical+biotech+product+development.">Strategies for the assessment of protein aggregates in pharmaceutical biotech product development.</a> Pharm. Res. 28, 920-933 (2011).</li><li>Lavinder, J. J., Hari, S. B., Sullivan, B. J., Magliery, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+thermal+scanning:+a+general,+rapid+dye-binding+thermal+shift+screen+for+protein+engineering.">High-throughput thermal scanning: a general, rapid dye-binding thermal shift screen for protein engineering.</a> J. Am. Chem. Soc. 131, 3794-3795 (2009).</li><li>Fellouse, F. A., Sidhu, S. S., Howard, G. C., MR, K. a. s. e. r. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Making antibodies in bacteria. in Making and Using Antibodies: A Practical Handbook. , 151-172 (2013).</li><li>Acton, T. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+protein+samples+for+NMR+structure,+function,+and+small-molecule+screening+studies.">Preparation of protein samples for NMR structure, function, and small-molecule screening studies.</a> Methods in Enzymology. 483, 23-47 (2011).</li><li>Mahon, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+interrogation+of+a+minimalist+synthetic+CDR-H3+library+and+its+ability+to+generate+antibodies+with+therapeutic+potential.">Comprehensive interrogation of a minimalist synthetic CDR-H3 library and its ability to generate antibodies with therapeutic potential.</a> J. Mol. Biol. 425, 1712-1730 (2013).</li><li>Persson, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CDR-H3+diversity+is+not+required+for+antigen+recognition+by+synthetic+antibodies.">CDR-H3 diversity is not required for antigen recognition by synthetic antibodies.</a> J. Mol. Biol. 425, 803-811 (2013).</li><li>Bradbury, A. R., Sidhu, S., Dubel, S., McCafferty, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beyond+natural+antibodies:+the+power+of+in+vitro+display+technologies.">Beyond natural antibodies: the power of in vitro display technologies.</a> Nat. Biotechnol. 29, 245-254 (2011).</li></ol>

Bei der Durchführung von in vitro-Antikörper-Selektionen, die zwei primäre Determinanten Auswahl Erfolg sind 1) die Isolierung von gut gefalteten Antigenziele zur Auswahl auf und 2) die Verfügbarkeit einer hohen Funktionsvielfalt Antikörperbibliothek. In vielen Fällen kann die Verfügbarkeit ausreichender Mengen von gut gefalteten Protein voller Länge nicht limitierend sein. Ein Ansatz zur Überwindung dieser Einschränkung ist, Domains von Bioinformatik-Analyse 22 identifiziert und zur Insert...

Mit dem Beginn der Post-Genom-Zeitalter, ist die Verfügbarkeit von qualitativ hochwertigen Bindungsreagenzien zur Charakterisierung und zu modulieren Proteine ​​wichtig, neue Forschung und therapeutische Wege eröffnen. Antikörper weiterhin entscheidend für die akademische und industrielle Forscher als Grundlagenforschung und Diagnose- und potenziellen Therapeutika zu sein. Es überrascht nicht, hat es eine beeindruckende Wachstum der Vertrags Antikörper-Entwicklung von Unternehmen, von denen die meisten verlassen sich auf herkömmliche Hybridom-Technologien, um kundenspezifische Antikörper zu erzeugen. Dennoch In-vitro-Selektion unter Verwendung von Phagen präsentierten Antikörperbibliotheken ist immer eine leistungsstarke Alternative Technologie, die einzigartige Vorteile und Erfolg in dem herkömmlichen Technologien kann Einschränkungen 1, 2 gegenüber anbieten können. Angesichts der erheblichen Nachfrage nach qualitativ hochwertigen Antikörpern als Forschungswerkzeuge, zwei zentralen Herausforderungen für die Erzeugung erneuerbarer Antikörper 1) Auswahl Durchsatz und 2) Antigen availability. Einige Gruppen haben nun in vitro Selektionsleitungen auf der Durchsatz erhöht und die Rate der Antikörperidentifizierung gerichtet beschrieben. Diese Beschreibungen detailliert eine Vielzahl von lebensfähigen Ansätzen, die entweder auf voller Länge der Auswahl gehören zielt 3,4 oder strukturell verwandte Domänen 5,6,7, entweder mit Wulst-basierten 6,8 oder plattenbasierte 3,4 Antigen Immobilisierung Systeme. Darüber hinaus hat die zunehmende Verbreitung der Gensynthese Technologien 9 systematische Antigen Generation, insbesondere aus isolierten Domänen, einigermaßen kostengünstig und können die Schwierigkeiten bei der Beschaffung ausreichender Mengen an gereinigtem, in voller Länge Antigen möglicherweise lindern. Durch die Verwendung der beiden Techniken in Tandem, wurde eine in sich geschlossene und skalierbare Antigenerzeugung und Antikörperselektion Pipeline erarbeitet, die die parallele Isolierung von Antikörpern für große Mengen an exprimiertem Antigen Domänen ermöglichen und erleichtern die Entwicklung von Reagenzien für cha würderacterizing ganze Klassen strukturell oder funktionell verwandten Proteinen. Zu diesem Ziel, eine integrierte Rohrleitung, die Paare in silico Identifizierung exprimierbaren Antigendomänen, Gensynthese, Hochdurchsatz-bakterielle Expression von Antigenen und skalierbare Phagen präsentierten Antikörper Selektionen wurde entwickelt. Diese Pipeline benötigt nur grundlegende Infrastruktur für die meisten Life-Science-Labors (einschließlich Antikörperbibliotheken, die durch Lizenz oder Materialübertragungsvereinbarung immer zur Verfügung stehen), sondern eignet sich auch für den Einsatz im industriellen Maßstab Automatisierung. Unter Verwendung dieses Protokolls ist es möglich, Hunderte von affinitätsmarkierten Antigen-Domänen zu erzeugen, und routinemäßig an viele dieser Antigene zu isolieren, hochspezifische Antikörperfragmente. Phagen-Display-Technologie hat gezeigt, die Kompatibilität mit einer Vielzahl von rekombinanten Affinitätsreagens Formate einschließlich Fab, scFv, Fv und autonomen Domänen und eine gezeigtenwachsende Zahl von kleinen &quot;alternativen Frameworks&quot; (entworfen Ankyrin Repeat Proteine ​​(DARPins), Fibronektin (Fn), Lipocalin Domains und 10). Diskussion In diesem Beispiel wird die Isolierung von Fab-Antikörperfragmente beschränkt, obwohl angenommen wird, können diese Verfahren auf andere Arten von Bibliotheken angepasst werden. Mit Hilfe dieser Technologie Fabs mit niedrigen nanomolaren Affinität zu kleinen, markierten Proteindomänen mit Transkriptionsfaktor-Domänen, SH2-Domänen, RNA-bindende Proteine ​​und andere haben erfolgreich ausgewählt, von denen viele zu binden Protein voller Länge und sind funktional in Immunoassays, wie Immunfluoreszenz , Immunpräzipitation und Immunhistochemie. Wichtig ist, dass rekombinantes Bindungs ​​Klone vollständig erneuerbaren und kann von Ausdruck neu generiert werden konstruiert durch bakterielle Produktionsangebot erhöhte Konsistenz, Reproduzierbarkeit und Wirtschaftlichkeit, so dass die Kosten der strengen Klon Überprüfung rechtfertigen. In diesem Protocol und dazugehörige Video, werden grundlegende Methoden zur Antikörperselektion von Phagen präsentierten Bibliothek unter Verwendung von immobilisiertem Antigen Domänen demonstriert. Dieses besondere Verfahren verwendet mit GST markierten Proteindomänen durch passive Adsorption in Mikrotiterplatten immobilisiert, obwohl auch andere Tags 11,12,13 und Selektionsformate 13,14,2 wurden ebenfalls erfolgreich verwendet. Kritische Überlegungen für die Einrichtung und Durchführung von Selektionen mit paralleler Überwachung der Auswahlparameter zu identifizieren und zu isolieren speziell angereicherten klonalen Antikörpern für die Validierung gerichtet sind detailliert.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="470">
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td colspan="4" height="22" style="height:22px;width:471px;">MATERIALS</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td colspan="2" height="43" style="height:43px;width:249px;">Name</td>
			<td style="width:135px;">Company</td>
			<td style="width:87px;">Catalog Number</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td colspan="2" height="40" style="height:40px;width:249px;">New Brunswick Innova44 stackable incubator shaker</td>
			<td style="width:135px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:87px;">M1282-0004</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td colspan="2" height="40" style="height:40px;width:249px;">Liquidator 96 channel manual benchtop pipetting system</td>
			<td style="width:135px;">Anachem Ltd</td>
			<td style="width:87px;">LIQ-96-200</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td colspan="2" height="22" style="height:22px;width:249px;">Microplate shaker</td>
			<td style="width:135px;">VWR</td>
			<td style="width:87px;">12620-926</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td colspan="2" height="40" style="height:40px;width:249px;">ThermoScientific Sorvall ST-40 benchtop centrifuge</td>
			<td style="width:135px;">Thermo Product</td>
			<td style="width:87px;">75004525</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td colspan="2" height="40" style="height:40px;width:249px;">ELx405 Select Deep Well Microplate Washer</td>
			<td style="width:135px;">Biotek</td>
			<td>ELX405USD</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td colspan="2" height="41" style="height:41px;width:249px;">Custom High Throughput Automated Phage Selection Robot</td>
			<td style="width:135px;">S&#38;P Robotics</td>
			<td style="width:87px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="2" height="21" style="height:21px;width:249px;">Plastic conical Falcon tube: 50 mL</td>
			<td style="width:135px;">VWR</td>
			<td style="width:87px;">21008-178</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="2" height="21" style="height:21px;width:249px;">Plastic conical Falcon tube: 15 mL</td>
			<td style="width:135px;">VWR</td>
			<td style="width:87px;">89039-668</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="2" height="21" style="height:21px;width:249px;">Axygen 1.7 mL microcentrifuge tubes</td>
			<td style="width:135px;">Corning</td>
			<td style="width:87px;">MCT-175-L-C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="2" height="21" style="height:21px;width:249px;">96-well/384-well Maxisorp plate</td>
			<td style="width:135px;">Sigma</td>
			<td style="width:87px;">M9410-1CS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="2" height="21" style="height:21px;width:249px;">Corning 96-well V-bottom deep-well block</td>
			<td style="width:135px;">Corning</td>
			<td style="width:87px;">3960</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="2" height="21" style="height:21px;width:249px;">Axygen Mini-tube 96-well sterile microplate blue box</td>
			<td style="width:135px;">Corning</td>
			<td style="width:87px;">AXY-MTS-06-C-R-S</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="2" height="21" style="height:21px;width:249px;">Breathable adhesive plate sealing film</td>
			<td style="width:135px;">VWR</td>
			<td style="width:87px;">60941-084</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td colspan="4" height="22" style="height:22px;width:471px;">REAGENTS</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td colspan="2" height="43" style="height:43px;width:249px;">Name</td>
			<td style="width:135px;">Company</td>
			<td style="width:87px;">Catalog Number</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td colspan="2" height="22" style="height:22px;width:249px;">polyethylene glycol</td>
			<td style="width:135px;">Bioshop</td>
			<td style="width:87px;">PEG800.1</td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td colspan="2" height="18" style="height:18px;">yeast extract</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>YEX401.1</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td colspan="2" height="22" style="height:22px;width:249px;">bio-tryptone</td>
			<td style="width:135px;">Bioshop</td>
			<td style="width:87px;">TRP402.1</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td colspan="2" height="22" style="height:22px;width:249px;">N-Z amine</td>
			<td style="width:135px;">Sigma</td>
			<td style="width:87px;">C7290</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td colspan="2" height="22" style="height:22px;width:249px;">glucose</td>
			<td style="width:135px;">Sigma</td>
			<td style="width:87px;">G8270-1KG</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td colspan="2" height="22" style="height:22px;width:249px;">lactose</td>
			<td style="width:135px;">Bioshop</td>
			<td style="width:87px;">LAC234</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td colspan="2" height="22" style="height:22px;width:249px;">glycerol</td>
			<td style="width:135px;">Bioshop</td>
			<td>GLY001.500</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td colspan="2" height="22" style="height:22px;width:249px;">carbenicillin&#160;</td>
			<td style="width:135px;">Bioshop</td>
			<td style="width:87px;">CAR544.10</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td colspan="2" height="22" style="height:22px;width:249px;">kanamycin</td>
			<td style="width:135px;">Bioshop</td>
			<td style="width:87px;">KAN201.25</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td colspan="2" height="22" style="height:22px;width:249px;">tetracycline&#160;</td>
			<td style="width:135px;">Bioshop</td>
			<td style="width:87px;">TET701.25</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td colspan="2" height="43" style="height:43px;width:249px;">Tween 20</td>
			<td style="width:135px;">Bioshop</td>
			<td style="width:87px;">TWN510.500</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="2" height="21" style="height:21px;width:249px;">monobasic potassium phophate</td>
			<td style="width:135px;">Bioshop</td>
			<td style="width:87px;">PPM302.1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="2" height="21" style="height:21px;width:249px;">dibasic sodium phosphate</td>
			<td style="width:135px;">Anachemia</td>
			<td style="width:87px;">84486-440</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="2" height="21" style="height:21px;width:249px;">sodium chloride</td>
			<td style="width:135px;">Bioshop</td>
			<td style="width:87px;">SOD001.10</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="2" height="21" style="height:21px;width:249px;">potassium chloride</td>
			<td style="width:135px;">Bioshop</td>
			<td style="width:87px;">POC308.1</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td colspan="2" height="20" style="height:20px;width:249px;">calcium chloride</td>
			<td style="width:135px;">Bioshop</td>
			<td style="width:87px;">CCL302.500</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="2" height="21" style="height:21px;width:249px;">magnesium sulphate</td>
			<td style="width:135px;">EMD</td>
			<td style="width:87px;">MX0070-1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="2" height="21" style="height:21px;width:249px;">magnesium chloride</td>
			<td style="width:135px;">Bioshop</td>
			<td style="width:87px;">MAG510.500</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="2" height="21" style="height:21px;width:249px;">NH4Cl</td>
			<td style="width:135px;">Amresco</td>
			<td style="width:87px;">0621-1KG</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="2" height="21" style="height:21px;width:249px;">Na2SO4</td>
			<td style="width:135px;">Bioshop</td>
			<td style="width:87px;">SOS513.500</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="2" height="21" style="height:21px;width:249px;">agar</td>
			<td style="width:135px;">Bioshop</td>
			<td style="width:87px;">AGR001.500</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="2" height="21" style="height:21px;width:249px;">SybrSafe DNA gel stain</td>
			<td style="width:135px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:87px;">S33102</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="2" height="21" style="height:21px;width:249px;">phosphoric acid</td>
			<td style="width:135px;">Acros Organics</td>
			<td style="width:87px;">201140010</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="2" height="21" style="height:21px;width:249px;">lysozyme</td>
			<td style="width:135px;">Bioshop</td>
			<td style="width:87px;">LYS702.25</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="2" height="21" style="height:21px;width:249px;">benzonase</td>
			<td style="width:135px;">Novagen</td>
			<td style="width:87px;">71205</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:139px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:135px;">Bioshop</td>
			<td style="width:87px;">TRX506.500</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="2" height="21" style="height:21px;width:249px;">protease inhibitor cocktail tablets</td>
			<td style="width:135px;">Roche</td>
			<td style="width:87px;">11 836 170 001</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td colspan="2" height="22" style="height:22px;width:249px;">Ni-NTA resin&#160;</td>
			<td style="width:135px;">Qiagen</td>
			<td style="width:87px;">1018240</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td colspan="2" height="42" style="height:43px;width:249px;">1000x helper phage (M13K07) stock (1013 phage per mL)</td>
			<td style="width:135px;">NEB</td>
			<td style="width:87px;">N0315S</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="2" height="39" rowspan="2" style="height:40px;width:249px;">HRP conjugated M13-specific antibody (anti-M13-HRP).</td>
			<td rowspan="2" style="width:135px;">GE Healthcare</td>
			<td rowspan="2" style="width:87px;">27-9241-01</td>
		</tr>
		<tr height="18">
		</tr>
		<tr height="44">
			<td colspan="2" height="44" style="height:44px;width:249px;">TMB substrate: mix equal volumes of TMB and H2O2 peroxidase substrate&#160;</td>
			<td style="width:135px;">KPL</td>
			<td style="width:87px;">50-76-00</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td colspan="2" height="22" style="height:22px;width:249px;">dNTPs</td>
			<td style="width:135px;">Biobasic</td>
			<td style="width:87px;">DD0056</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td colspan="2" height="22" style="height:22px;width:249px;">Taq polymerase</td>
			<td style="width:135px;">Genscript</td>
			<td style="width:87px;">E00007</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td colspan="2" height="22" style="height:22px;width:249px;">Exonuclease</td>
			<td style="width:135px;">GE Healthcare&#160;</td>
			<td style="width:87px;">EZ0073X-EZ</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td colspan="2" height="22" style="height:22px;width:249px;">Shrimp alkaline phosphatase</td>
			<td style="width:135px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:87px;">E70092Z-EZ</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

scalable high throughput selection from  phage-displayed synthetic antibody libraries

Die Nachfrage nach Antikörpern, die den Bedürfnissen von Grundlagen- und klinischer Forschung Anwendungen zu erfüllen ist hoch und wird sich dramatisch in der Zukunft zu erhöhen. Es ist jedoch offensichtlich, dass herkömmliche monoklonale Techniken nicht allein bis zu dieser Aufgabe. Dies hat zu der Entwicklung von alternativen Verfahren führte zu der Forderung nach hoher Qualität und erneuerbarer Affinitätsreagenzien an alle zugänglichen Elemente des Proteoms befriedigen. Zu diesem Zweck sind Hochdurchsatzverfahren zur Durchführung von Auswahlen aus Phagendisplay-Bibliotheken synthetischer Antikörper für Anwendungen mit unterschiedlichen Antigenen entwickelt worden und zur schnellen Durchsatz und erfolgreich optimiert. Hierin wird ein Protokoll im Detail, die mit Video-Demonstration zeigt die parallel Auswahl Fab-Phagenklone aus hohe Diversität Bibliotheken gegen Hunderte von Ziele entweder mit einem manuellen 96-Kanal Liquid Handler oder automatisierten Robotersystem beschrieben. Unter Verwendung dieses Protokolls kann ein einzelner Benutzer Hunderte von Antigenen zu erzeugen,Wählen Antikörper, um sie parallel und zu validieren Antikörperbindung in 6-8 Wochen. Hervorgehoben sind: i) eine tragfähige Antigen-Format, ii) Vorauswahl Antigen Charakterisierung, iii) wichtige Schritte, die die Auswahl von spezifischen und hohen Affinität Klone beeinflussen und iv) Formen der Überwachung Auswahl Wirksamkeit und frühzeitig Antikörperklon Charakterisierung. Mit dieser Vorgehensweise haben wir synthetische Antikörperfragmenten (Fabs), viele Zielklassen einschließlich Single-Pass-Membranrezeptoren, sekretierte Proteinhormone und Multi-Domain intrazellulären Proteinen erhalten. Diese Fragmente werden leicht an Volllängen-Antikörpern umgesetzt und validiert worden sind, um eine hohe Affinität und Spezifität aufweisen. Ferner wurden sie nachgewiesen funktionellen in einer Vielzahl von Standard-Immunoassays, einschließlich Western-Blotting, ELISA, zelluläre Immunfluoreszenz, Immunpräzipitation und ähnliche Assays sein. Diese Methodik wird Antikörper Entdeckung zu beschleunigen und letztlich bringen uns näher an die Verwirklichung des Ziels of Erzeugung erneuerbarer, hochwertige Antikörper gegen das Proteom.

Das hier beschriebene Protokoll verwendet worden, um Antikörperfragmente zu einer Vielzahl von sowohl strukturell und funktionell verwandten Antigen-Domänen, von kombi Phagen präsentierten Fab-Bibliotheken, die parallel zu isolieren. Probleme, die Antigen Verfügbarkeit bezogen in silico Identifizierung exprimierbaren Antigen-Domänen, die geeignet sind für die Antikörper-Selektion 23 umgangen werden können, in vielen Fällen durch. Durch Kopplung an Antikörper-Antigen-Expression Auswahl im gleichen La...

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Scalable High Throughput Selection From  Phage-displayed Synthetic Antibody Libraries

Skalierbare High Throughput Auswahl aus Phagen-Antikörperbibliotheken angezeigt Synthetische

Es wird ein Verfahren mit visuellen Begleitung für die Durchführung von skalierbaren, Hochdurchsatz-Auswahl aus Phagendisplaykombi synthetische Antikörperbibliotheken gegen Hunderte von Antigenen gleichzeitig beschrieben. Mit dieser parallelen Ansatz haben wir Antikörperfragmente, die eine hohe Affinität und Spezifität für verschiedene Antigene, die in Funktionsstandard Immunoassays weisen isoliert.

The demand for antibodies that fulfill the needs of both basic and clinical research applications is high and will dramatically increase in the future. ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Separation of Single-stranded DNA, Double-stranded DNA and RNA from an Environmental Viral Community Using Hydroxyapatite Chromatography

Trennung von Einzelstrang-DNA, doppelsträngige DNA und RNA aus ökologischer Viral Gemeinschaft mit Hydroxyapatit-Chromatographie

Viruses, particularly bacteriophages (phages), are the most numerous biological entities on Earth1,2.  Viruses modulate host cell abundance and diversity, ...

Forschung

Immunologie und Infektion

High-throughput Detection Method for Influenza Virus

High-Throughput Nachweisverfahren für Influenza-Virus

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, ...

Quantitative High-throughput Single-cell Cytotoxicity Assay For T Cells

Quantitative High-throughput Single-cell Zytotoxizitätstest für T-Zellen

Cancer immunotherapy can harness the specificity of  immune response to target and eliminate tumors. Adoptive cell therapy (ACT)  based on the adoptive ...

High-throughput Screening for Broad-spectrum Chemical Inhibitors of RNA Viruses

Hochdurchsatz-Screening für Breitspektrum-Chemische Inhibitoren der RNA-Viren

RNA viruses are responsible for major human diseases such as flu, bronchitis, dengue, Hepatitis C or measles. They also represent an emerging threat ...

ScanLag: High-throughput Quantification of Colony Growth and Lag Time

ScanLag: High-Throughput-Quantifizierung von Colony Wachstum und Verzögerungszeit

Growth dynamics are fundamental characteristics of microorganisms. Quantifying growth precisely is an important goal in microbiology. Growth dynamics are ...

High-throughput Gene Tagging in Trypanosoma brucei

High-throughput Gene Tagging in Trypanosoma brucei

Hochdurchsatz-Gene Tagging in<em&gt; Trypanosoma brucei</em

Improvements in mass spectrometry, sequencing and bioinformatics have generated large datasets of potentially interesting genes. Tagging these proteins ...

Construction of Synthetic Phage Displayed Fab Library with Tailored Diversity

Bau von synthetischen Phagen Fab Bibliothek mit maßgeschneiderten Vielfalt angezeigt

Demand for monoclonal antibodies (mAbs) in basic research and medicine is increasing yearly. Hybridoma technology has been the dominant method for mAb ...

A High-throughput, High-content, Liquid-based C. elegans Pathosystem

A High-throughput, High-content, Liquid-based C. elegans Pathosystem

Ein High-Throughput, High-Content, Liquid-basierter C. Elegans Pathosystem

The number of new drugs identified by traditional, in vitro screens has waned, reducing the success of this approach in the search for new weapons to ...

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

Ein High-Throughput- Shigella-spezifischen bakterizide Assay

Serum bactericidal assays (SBAs) measure the functional activity of antibodies and have been used for many decades. SBAs directly measure antibody killing ...

Targeted Antibody Blocking by a Dual-Functional Conjugate of Antigenic Peptide and Fc-III Mimetics (DCAF)

Targeted Antibody Blocking by a Dual-Functional Conjugate of Antigenic Peptide and Fc-III Mimetics DCAF

Gezielte Antikörperblockierung durch ein dual-funktionales Konjugat von antigenem Peptid und Fc-III-Mimetik (DCAF)

Elimination of harmful antibodies from organisms is a valuable approach for the intervention of antibody-associated diseases, such as Dengue hemorrhagic ...