Name: complete spinal cord injury and brain dissection protocol for subsequent wholemount in situ hybridization in larval sea lamprey
Uploaded: 2014-10-14T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Complete Spinal Cord Injury and Brain Dissection Protocol for Subsequent Wholemount In Situ Hybridization in Larval Sea Lamprey at JoVE.com

Supported by NIH Grants NS14837, R01 NS38537, R24 HD050838 to Dr. Michael E. Selzer; Shriners Research Grant SHC-85220 to Dr. Michael E Selzer; and Shriners Research Grant SHC-85310 to Dr. Michael I. Shifman. Dr. Ant&#243;n Barreiro-Iglesias was supported by the Fundaci&#243;n Barri&#233; (Spain) and the Xunta de Galicia (Galicia, Spain).

Voir le tableau 1 pour tous les matériaux utilisés dans ce protocole. Des expériences ont été approuvés par le soin et l&#39;utilisation des animaux Commission institutionnelle à l&#39;Université Temple. 1. Animaux <ol><li> Obtenir type sauvage larves de lamproie de mer (Petromyzon marinus L.), 10 - 14 cm de longueur (4 - 7 ans) des cours d&#39;eau qui alimentent le lac Michigan, des affluents de la rivière Delaware (Pennsylva...

<ol>
	<li>Rodicio, M. C., Barreiro-Iglesias, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lampreys+as+an+animal+model+in+regeneration+studies+after+spinal+cord+injury.">Lampreys as an animal model in regeneration studies after spinal cord injury.</a> Rev Neurol. 55, 157-166 (2012).</li><li>Davis, G. R., McClellan, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extent+and+time+course+of+restoration+of+descending+brainstem+projections+in+spinalcord-transected+lamprey.">Extent and time course of restoration of descending brainstem projections in spinalcord-transected lamprey.</a> J Comp Neurol. 344, 65-82 (1994).</li><li>Jacobs, A. J., Swain, G. P., Snedeker, J. A., Pijak, D. S., Gladstone, L. J., Selzer, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recovery+of+neurofilament+expression+selectively+in+regenerating+reticulospinal+neurons.">Recovery of neurofilament expression selectively in regenerating reticulospinal neurons.</a> J Neurosci. 17, 5206-5220 (1997).</li><li>Shifman, M. I., Selzer, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+the+netrin+receptor+UNC-5+in+lamprey+brain+modulation+by+spinal+cord+transection.">Expression of the netrin receptor UNC-5 in lamprey brain modulation by spinal cord transection.</a> Neurorehabil Neural Repair. 14, 49-58 (2000).</li><li>Barreiro-Iglesias, A., Laramore, C., Shifman, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+sea+lamprey+UNC5+receptors+cDNA+cloning,+phylogenetic+analysis+and+expression+in+reticulospinal+neurons+at+larval+and+adult+stages+of+development.">The sea lamprey UNC5 receptors cDNA cloning, phylogenetic analysis and expression in reticulospinal neurons at larval and adult stages of development.</a> J Comp Neurol. 520, 4141-4156 (2012).</li><li>Shifman, M. I., Yumu, l. R. E., Laramore, C., Selzer, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+the+repulsive+guidance+molecule+RGM+and+its+receptor+neogenin+after+spinal+cord+injury+in+sea+lamprey.">Expression of the repulsive guidance molecule RGM and its receptor neogenin after spinal cord injury in sea lamprey.</a> Exp Neurol. 217, 242-251 (2009).</li><li>Busch, D. J., Morgan, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synuclein+accumulation+is+associated+with+cell-specific+neuronal+death+after+spinal+cord+injury.">Synuclein accumulation is associated with cell-specific neuronal death after spinal cord injury.</a> J Comp Neurol. 520, 1751-1771 (2012).</li><li>Shifman, M. I., Zhang, G., Selzer, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delayed+death+of+identified+reticulospinal+neurons+after+spinal+cord+injury+in+lampreys.">Delayed death of identified reticulospinal neurons after spinal cord injury in lampreys.</a> J Comp Neurol. 510, 269-282 (2008).</li><li>Swain, G. P., Jacobs, A. J., Frei, E., Selzer, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+in+situ+hybridization+in+wholemounted+lamprey+brain+neurofilament+expression+in+larvae+and+adults.">A method for in situ hybridization in wholemounted lamprey brain neurofilament expression in larvae and adults.</a> Exp. Neurol. 126, 256-269 (1994).</li><li>Bullock, T. H., Moore, J. K., Fields, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+myelin+sheaths:+both+lamprey+and+hagfish+lack+myelin.">Evolution of myelin sheaths: both lamprey and hagfish lack myelin.</a> Neurosci Lett. 48, 145-148 (1984).</li><li>Cohen, A. H., Kiemel, T., Pate, V., Blinder, J., Guan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temperature+can+alter+the+function+outcome+of+spinal+cord+regeneration+in+larval+lampreys.">Temperature can alter the function outcome of spinal cord regeneration in larval lampreys.</a> Neuroscience. 90, 957-965 (1999).</li></ol>

Nous présentons ici un protocole détaillé pour effectuer un sectionnement de la moelle épinière complète et postérieure dissection du cerveau en larves de lamproie de mer. Cette procédure permet d&#39;analyser les différences dans l&#39;expression génique entre les neurones de la moelle épinière en saillie identifiables après une lésion de la moelle épinière par l&#39;intermédiaire d&#39;un cerveau entier de montage en hybridation in situ. L&#39;étape critique dans la procédure est la performance corr...

Chez les mammifères lésion de la moelle épinière (SCI) est une maladie dévastatrice qui conduit à une perte permanente de la fonction ci-dessous le site de la lésion, car axones lésés ne se régénèrent pas dans la zone de traumatisme et se reconnecter à leurs cibles. Contrairement aux mammifères, les lamproies récupérer locomotion après une lésion complète de la moelle épinière. 1 Fait intéressant, les lamproies ont un ensemble de 36 moelle épinière projection neurones qui sont identifiables individuellement dans l&#39;ensemble du montage des préparations du cerveau en raison de leur grande taille 2,3 (Figure 1) . Tous ces neurones spinaux sont en saillie par un axotomisés complète transection de la moelle épinière de haut niveau. Des études antérieures de notre groupe et d&#39;autres ont montré que, même en présence de la récupération fonctionnelle après un traumatisme médullaire certains de ces neurones présentent une très faible capacité de régénération (ils sont considérés comme «mauvais régénérateurs»), tandis que d&#39;autres se régénèrent généralement leur axone à travers le site de la lésion (ils sont considérés comme «grégénérateurs ood »). 2,3 Cette caractéristique rend les lamproies un modèle vertébré intéressant d&#39;étudier les différences d&#39;expression génique entre le bien et le mal régénérateur neurones spinaux saillie qui à son tour conduire à des différences dans la capacité de régénération intrinsèque des neurones qui tentent de régénérer leurs axones dans le même environnement extrinsèque. 1 En utilisant ce modèle, nous avons précédemment montré que les neurones de projection de la colonne vertébrale avec une faible capacité de régénération axonale de montrer l&#39;expression des récepteurs de molécules de guidage comme UNC5 néogénine 4,5 et 6, qui assurent la médiation de l&#39;action inhibitrice de la nétrine et RGM respectivement. En outre, en utilisant cette méthode notre groupe a également montré que seules les bonnes régénérateurs montrent une récupération de l&#39;expression des neurofilaments après la lésion et au cours du processus de régénération. Récemment, Busch et Morgan 7 ont montré par immunofluorescence que les mauvaises régénérateurs montrent un increasexpression ée de synucléine après une blessure, qui a été rapporté par les auteurs sur le fait que les &quot;mauvais&quot; régénérateur neurones spinaux saillie meurent lentement après un sectionnement de la moelle épinière 5,7,8 complète. Ainsi, le modèle de la lamproie d&#39;une lésion complète de la moelle épinière a émergé comme un modèle très utile pour comprendre ce qui rend un cordon en saillie neurone spinal une «mauvaise régénérateur&quot; après axotomie. Pour mener nos études, nous effectuons un sectionnement de la moelle épinière protocole de chirurgie complète et une dissection postérieure du cerveau au niveau des points de temps souhaités après une blessure à effectuer wholemount hybridation in situ. Dans l&#39;article méthodologique actuelle, nous présentons un protocole détaillé pour la bonne exécution d&#39;une opération complète de lésions de la moelle épinière chez les lamproies larvaires, l&#39;entretien ultérieur des animaux et la dissection du cerveau finale et la préparation du cerveau pour une wholemount hybridation in situ. Un protocole détaillé de perform la wholemount hybridation in situ dans le cerveau des lamproies larvaires a été indiqué précédemment. 9 En outre, ce protocole en cas de blessure de la moelle épinière et le cerveau dissection peut être également utilisé pour traiter ensuite les cerveaux pour l&#39;immunohistochimie ou d&#39;autres méthodes histologiques.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="280">
	<tbody>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:64px;">Name of the reagent</td>
			<td style="width:83px;">Company</td>
			<td style="width:64px;">Catalogue number</td>
			<td style="width:71px;">Comments (optional)</td>
		</tr>
		<tr height="148">
			<td height="148" style="height:148px;width:64px;">Tricaine methane sulfonate</td>
			<td style="width:83px;">Spectrum</td>
			<td style="width:64px;">TR108</td>
			<td style="width:71px;">Benzocaine saturated solution in PBS for sacrifice</td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:64px;">Scalpel #3</td>
			<td style="width:83px;">Fine Science Tools (FST)</td>
			<td style="width:64px;">10003-12</td>
			<td style="width:71px;"></td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:64px;">Blades for scalpel: #11</td>
			<td style="width:83px;">Fine Science Tools&#160;</td>
			<td style="width:64px;">10011-00</td>
			<td style="width:71px;"></td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:64px;">Castroviejo scissors #8</td>
			<td style="width:83px;">Fine Science Tools&#160;</td>
			<td style="width:64px;">15002-08</td>
			<td style="width:71px;"></td>
		</tr>
		<tr height="190">
			<td height="190" style="height:190px;width:64px;">Forceps #4 &#38; #5</td>
			<td style="width:83px;">Dumont, Switzerland</td>
			<td style="width:64px;">Roboz RS4955</td>
			<td style="width:71px;">#4 for dissection of Spinal cord; #5 for stripping menninges</td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:64px;">Dissecting Microscope</td>
			<td style="width:83px;">Olympus</td>
			<td style="width:64px;">SZ51</td>
			<td style="width:71px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="63" rowspan="2" style="height:63px;width:64px;">Sylgard</td>
			<td rowspan="2" style="width:83px;">Dow Corning Co.</td>
			<td rowspan="2" style="width:64px;">184</td>
			<td rowspan="2" style="width:71px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
		</tr>
		<tr height="168">
			<td height="189" rowspan="2" style="height:189px;width:64px;">Insect pins 0.15, 0.20 mm</td>
			<td rowspan="2" style="width:83px;">Austerlitz</td>
			<td rowspan="2" style="width:64px;">No catalogue #</td>
			<td rowspan="2" style="width:71px;">0.15 mm for pinning brain and spinal cord; 0.20 mm for the body</td>
		</tr>
		<tr height="21">
		</tr>
		<tr height="127">
			<td height="127" style="height:127px;width:64px;">7 ml HDPE Scintillation Tubes with Caps</td>
			<td style="width:83px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:64px;">03-337-1</td>
			<td style="width:71px;"></td>
		</tr>
		<tr height="106">
			<td height="106" style="height:106px;width:64px;">Paraformaldehyde 16%</td>
			<td style="width:83px;">Electron Microscopy Science (EMS)</td>
			<td style="width:64px;">19210</td>
			<td style="width:71px;">Dilute to 4% in PBS</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

complete spinal cord injury and brain dissection protocol for subsequent wholemount in situ hybridization in larval sea lamprey

Après une lésion complète de la moelle épinière, la lamproie marine dans un premier temps sont paralysés en dessous du niveau de sectionnement. Cependant, ils récupèrent locomotion après plusieurs semaines, ce qui est accompagné par régénération à courte distance (quelques mm) des axones et des axones spinaux propriospinaux saillie du tronc cérébral. Parmi les 36 grands neurones spinaux saillie identifiables, certains sont bons régénérateurs et d&#39;autres sont mauvaises régénérateurs. Ces neurones peuvent le plus facilement être identifiés dans les préparations wholemount SNC. Afin de comprendre les mécanismes neuronaux intrinsèques qui favorisent ou inhibent la régénération axonale après une lésion du système nerveux central chez les vertébrés, nous déterminons les différences d&#39;expression génique entre les bons et les mauvais régénérateurs, et comment l&#39;expression est influencée par la moelle sectionnement de la moelle. Cet article illustre les techniques pour le logement des larves et des adultes lamproies récemment transformées en réservoirs d&#39;eau, la production de sections transversales de la moelle épinière complets sous vision microscopique, et la préparation de brain échantillons entiers et de la moelle épinière pour l&#39;hybridation in situ. En bref, les animaux sont maintenus à 16 &#160; ° C et anesthésiés dans 1% de benzocaïne dans lamproie Ringer. La moelle épinière est sectionnée avec iridectomie ciseaux par une approche dorsale et l&#39;animal est autorisé à récupérer dans les réservoirs d&#39;eau douce à 23 ° C. Par hybridation in situ, les animaux sont reanesthetized et le cerveau et la moelle éliminés par un abord dorsal.

Comme un exemple des résultats qui peuvent être obtenus en utilisant cette méthode, des images représentatives de cerveaux wholemounted montrant l&#39;expression des transcrits néogénine dans les neurones identifiables de la moelle épinière saillie de contrôle et 2 semaines après la lésion larves de lamproie de mer sont présentés dans la figure 2. Les lecteurs sont invités à une étude précédente 6 rapports de la relation entre l&#39;expression de la néogénine après un sec...

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Complete Spinal Cord Injury and Brain Dissection Protocol for Subsequent Wholemount In Situ Hybridization in Larval Sea Lamprey

Spinal Cord Injury complète et cerveau Protocole Dissection pour Wholemount suite<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridation dans des larves de la lamproie marine

Les lamproies récupérer locomotion après une lésion complète de la moelle épinière. Cependant, certains neurones spinaux en saillie sont de bons régénérateurs et d&#39;autres non. Cet article illustre les techniques de larves logements de la lamproie marine (et les adultes récemment transformées), la production complètes transections de la moelle épinière et le cerveau wholemount préparation et la moelle épinière pour l&#39;hybridation in situ.

After a complete spinal cord injury, sea lampreys at first are paralyzed below the level of transection. However, they recover locomotion after several ...

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