Name: complete spinal cord injury and brain dissection protocol for subsequent wholemount in situ hybridization in larval sea lamprey
Uploaded: 2014-10-14T13:00:00
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Supported by NIH Grants NS14837, R01 NS38537, R24 HD050838 to Dr. Michael E. Selzer; Shriners Research Grant SHC-85220 to Dr. Michael E Selzer; and Shriners Research Grant SHC-85310 to Dr. Michael I. Shifman. Dr. Ant&#243;n Barreiro-Iglesias was supported by the Fundaci&#243;n Barri&#233; (Spain) and the Xunta de Galicia (Galicia, Spain).

Siehe Tabelle 1 für alle in diesem Protokoll verwendeten Materialien. Die Experimente wurden von der Institutional Animal Care und Use Committee an der Temple University zugelassen. 1. Tiere <ol><li> Erhalten Wildtyp-Larven Meerneunaugen (Petromyzon marinus L.), von 10 - 14 cm in der Länge (4 - 7 Jahre alt) aus Bächen Fütterung Lake Michigan, von Nebenflüssen auf dem Delaware River (Pennsylvania) oder Streams in Maine. </li><li> I...

<ol>
	<li>Rodicio, M. C., Barreiro-Iglesias, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lampreys+as+an+animal+model+in+regeneration+studies+after+spinal+cord+injury.">Lampreys as an animal model in regeneration studies after spinal cord injury.</a> Rev Neurol. 55, 157-166 (2012).</li><li>Davis, G. R., McClellan, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extent+and+time+course+of+restoration+of+descending+brainstem+projections+in+spinalcord-transected+lamprey.">Extent and time course of restoration of descending brainstem projections in spinalcord-transected lamprey.</a> J Comp Neurol. 344, 65-82 (1994).</li><li>Jacobs, A. J., Swain, G. P., Snedeker, J. A., Pijak, D. S., Gladstone, L. J., Selzer, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recovery+of+neurofilament+expression+selectively+in+regenerating+reticulospinal+neurons.">Recovery of neurofilament expression selectively in regenerating reticulospinal neurons.</a> J Neurosci. 17, 5206-5220 (1997).</li><li>Shifman, M. I., Selzer, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+the+netrin+receptor+UNC-5+in+lamprey+brain+modulation+by+spinal+cord+transection.">Expression of the netrin receptor UNC-5 in lamprey brain modulation by spinal cord transection.</a> Neurorehabil Neural Repair. 14, 49-58 (2000).</li><li>Barreiro-Iglesias, A., Laramore, C., Shifman, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+sea+lamprey+UNC5+receptors+cDNA+cloning,+phylogenetic+analysis+and+expression+in+reticulospinal+neurons+at+larval+and+adult+stages+of+development.">The sea lamprey UNC5 receptors cDNA cloning, phylogenetic analysis and expression in reticulospinal neurons at larval and adult stages of development.</a> J Comp Neurol. 520, 4141-4156 (2012).</li><li>Shifman, M. I., Yumu, l. R. E., Laramore, C., Selzer, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+the+repulsive+guidance+molecule+RGM+and+its+receptor+neogenin+after+spinal+cord+injury+in+sea+lamprey.">Expression of the repulsive guidance molecule RGM and its receptor neogenin after spinal cord injury in sea lamprey.</a> Exp Neurol. 217, 242-251 (2009).</li><li>Busch, D. J., Morgan, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synuclein+accumulation+is+associated+with+cell-specific+neuronal+death+after+spinal+cord+injury.">Synuclein accumulation is associated with cell-specific neuronal death after spinal cord injury.</a> J Comp Neurol. 520, 1751-1771 (2012).</li><li>Shifman, M. I., Zhang, G., Selzer, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delayed+death+of+identified+reticulospinal+neurons+after+spinal+cord+injury+in+lampreys.">Delayed death of identified reticulospinal neurons after spinal cord injury in lampreys.</a> J Comp Neurol. 510, 269-282 (2008).</li><li>Swain, G. P., Jacobs, A. J., Frei, E., Selzer, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+in+situ+hybridization+in+wholemounted+lamprey+brain+neurofilament+expression+in+larvae+and+adults.">A method for in situ hybridization in wholemounted lamprey brain neurofilament expression in larvae and adults.</a> Exp. Neurol. 126, 256-269 (1994).</li><li>Bullock, T. H., Moore, J. K., Fields, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+myelin+sheaths:+both+lamprey+and+hagfish+lack+myelin.">Evolution of myelin sheaths: both lamprey and hagfish lack myelin.</a> Neurosci Lett. 48, 145-148 (1984).</li><li>Cohen, A. H., Kiemel, T., Pate, V., Blinder, J., Guan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temperature+can+alter+the+function+outcome+of+spinal+cord+regeneration+in+larval+lampreys.">Temperature can alter the function outcome of spinal cord regeneration in larval lampreys.</a> Neuroscience. 90, 957-965 (1999).</li></ol>

Hier präsentieren wir Ihnen ein ausführliches Protokoll, um eine komplette Durchtrennung des Rückenmarks und hinteren Hirn Dissektion in Larvenmeerneunaugen durchzuführen. Dieses Verfahren ermöglicht die Analyse Unterschiede in der Genexpression zwischen den identifizierbaren Rückenmark vorst Neuronen nach einer Rückenmarksverletzung durch eine ganze Montage Gehirn in situ Hybridisierung. Der kritische Schritt in dem Verfahren ist die korrekte Ausführung einer vollständigen Durchtrennung des Rückenmarks, die d...

Bei Säugetieren Rückenmarksverletzungen (SCI) ist eine verheerende Erkrankung, die zu dauerhaften Verlust der Funktion unterhalb der Verletzungsstelle führt, weil verletzt Axone nicht durch das Trauma Zone zu regenerieren und wieder in die entsprechenden Ziele. Im Gegensatz zu Säugetieren, Neunaugen erholen Fortbewegung nach einer kompletten Rückenmarksverletzungen. 1 Interessanterweise Neunaugen haben einen Satz von 36 Rückenmark hervorstehenden Neuronen, die in individuell identifizierbar sind ganze Gehirn-Mount-Präparate wegen ihrer großen Größe 2,3 (Abbildung 1) . Alle diese Rücken ragenden Neuronen werden von einer hochrangigen komplette Durchtrennung des Rückenmarks axotomisierten. Frühere Studien unserer Gruppe und andere haben gezeigt, dass auch in der Gegenwart die funktionelle Erholung nach einer Rückenmarks einige dieser Neuronen zeigen eine sehr geringe Regenerationsfähigkeit (sie werden als &quot;schlecht Regeneratoren&quot;), während andere in der Regel regenerieren ihre Axon durch den Ort der Verletzung (sie werden als &quot;gOOD Regeneratoren &quot;). 2,3 Diese Eigenschaft macht Neunaugen eine interessante Wirbeltiermodell, um die Unterschiede in der Genexpression zwischen guten und schlechten Regenerator Rücken ragenden Neuronen, die wiederum auf die Unterschiede in der intrinsischen Regenerationsfähigkeit von Neuronen, die versuchen Leitstudie regenerieren ihre Axone in der gleichen äußeren Umgebung. 1 Mit diesem Modell haben wir bereits gezeigt, dass Rücken ragenden Neuronen mit niedrigen Regenerationsfähigkeit zeigen Ausdruck der axonalen Führung Molekül Rezeptoren wie UNC5 4,5 und Neogenin, 6, die die hemmende Wirkung von Netrin und RGM bzw. zu vermitteln. Darüber hinaus kann durch diese Methode unserer Gruppe hat auch gezeigt, dass nur die guten Regeneratoren zeigen eine Erholung der Ausdruck von Neurofilamenten nach der Verletzung und während des Regenerationsprozesses. Kürzlich, Busch und Morgan 7 wurden durch Immunfluoreszenz gezeigt, dass die schlechten Regeneratoren zeigen eine zunehed Expression Synuclein nach der Verletzung, die von den Autoren der Tatsache, dass die &quot;schlechte Regenerator&quot; spinal ragenden Neuronen langsam nach einer vollständigen Durchtrennung des Rückenmarks 5,7,8 sterben bezogen wurde. So hat sich die Neunaugen Modell eines kompletten Rückenmarksverletzung als ein sehr nützliches Modell zu verstehen, was eine Rückenmark hervorstehenden Neuron eine &quot;schlechte Regenerator&quot; nach Axotomie entstanden. Unseren Untersuchungen führen wir führen eine komplette Durchtrennung des Rückenmarks-Chirurgie-Protokoll und eine hintere Gehirn Dissektion bei den gewünschten Zeitpunkten nach der Verletzung von wholemount in-situ-Hybridisierung durchzuführen. In der vorliegenden methodischen Artikel stellen wir ein ausführliches Protokoll für die ordnungsgemäße Durchführung eines kompletten Rückenmarksverletzungen Chirurgie in Larvenneunaugen, die anschließende Pflege der Tiere und die letzte Gehirn Präparation und Vorbereitung des Gehirns für eine wholemount in-situ-Hybridisierung. Ein detailliertes Protokoll perform die Wholemount in situ-Hybridisierung im Gehirn von Larven Neunaugen wurde bereits berichtet. 9 Darüber hinaus kann dieses Protokoll für die Verletzung des Rückenmarks und des Gehirns Präparation auch verwendet werden, um dann verarbeitet das Gehirn für die Immunhistochemie oder anderen histologischen Methoden werden.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="280">
	<tbody>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:64px;">Name of the reagent</td>
			<td style="width:83px;">Company</td>
			<td style="width:64px;">Catalogue number</td>
			<td style="width:71px;">Comments (optional)</td>
		</tr>
		<tr height="148">
			<td height="148" style="height:148px;width:64px;">Tricaine methane sulfonate</td>
			<td style="width:83px;">Spectrum</td>
			<td style="width:64px;">TR108</td>
			<td style="width:71px;">Benzocaine saturated solution in PBS for sacrifice</td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:64px;">Scalpel #3</td>
			<td style="width:83px;">Fine Science Tools (FST)</td>
			<td style="width:64px;">10003-12</td>
			<td style="width:71px;"></td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:64px;">Blades for scalpel: #11</td>
			<td style="width:83px;">Fine Science Tools&#160;</td>
			<td style="width:64px;">10011-00</td>
			<td style="width:71px;"></td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:64px;">Castroviejo scissors #8</td>
			<td style="width:83px;">Fine Science Tools&#160;</td>
			<td style="width:64px;">15002-08</td>
			<td style="width:71px;"></td>
		</tr>
		<tr height="190">
			<td height="190" style="height:190px;width:64px;">Forceps #4 &#38; #5</td>
			<td style="width:83px;">Dumont, Switzerland</td>
			<td style="width:64px;">Roboz RS4955</td>
			<td style="width:71px;">#4 for dissection of Spinal cord; #5 for stripping menninges</td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:64px;">Dissecting Microscope</td>
			<td style="width:83px;">Olympus</td>
			<td style="width:64px;">SZ51</td>
			<td style="width:71px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="63" rowspan="2" style="height:63px;width:64px;">Sylgard</td>
			<td rowspan="2" style="width:83px;">Dow Corning Co.</td>
			<td rowspan="2" style="width:64px;">184</td>
			<td rowspan="2" style="width:71px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
		</tr>
		<tr height="168">
			<td height="189" rowspan="2" style="height:189px;width:64px;">Insect pins 0.15, 0.20 mm</td>
			<td rowspan="2" style="width:83px;">Austerlitz</td>
			<td rowspan="2" style="width:64px;">No catalogue #</td>
			<td rowspan="2" style="width:71px;">0.15 mm for pinning brain and spinal cord; 0.20 mm for the body</td>
		</tr>
		<tr height="21">
		</tr>
		<tr height="127">
			<td height="127" style="height:127px;width:64px;">7 ml HDPE Scintillation Tubes with Caps</td>
			<td style="width:83px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:64px;">03-337-1</td>
			<td style="width:71px;"></td>
		</tr>
		<tr height="106">
			<td height="106" style="height:106px;width:64px;">Paraformaldehyde 16%</td>
			<td style="width:83px;">Electron Microscopy Science (EMS)</td>
			<td style="width:64px;">19210</td>
			<td style="width:71px;">Dilute to 4% in PBS</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

complete spinal cord injury and brain dissection protocol for subsequent wholemount in situ hybridization in larval sea lamprey

Nach einer kompletten Rückenmarksverletzungen, werden Meerneunaugen auf den ersten unter dem Niveau der Durchtrennung gelähmt. Bewegungs jedoch erholen sie nach mehreren Wochen, und dies wird durch kurzes Stück Regeneration (einige mm) von propriospinale Axonen und Rücken ragenden Axone aus dem Hirnstamm begleitet. Unter den 36 großen erkennbaren Rücken ragenden Neuronen, sind einige gute Regeneratoren und andere sind schlecht Regeneratoren. Diese Neuronen können am einfachsten in wholemount CNS Vorbereitungen identifiziert werden. Um die Neuron-intrinsische Mechanismen, begünstigen oder hemmen verstehen Axon Regeneration nach Verletzung im ZNS der Wirbeltiere, bestimmen wir Unterschiede in der Genexpression zwischen den guten und schlechten Regeneratoren und wie Expression durch Rückenmarksdurchtrennung beeinflusst. Dieses Papier zeigt die Techniken für die Larvengehäuse und vor kurzem umgewandelt Erwachsenen Seeneunaugen in Frischwassertanks, produziert komplette Rückenmarksquerschnitten erhalten unter mikroskopischer Sicht, und die Vorbereitung brAin und Rückenmark wholemounts für in situ-Hybridisierung. Kurz gesagt, werden die Tiere bei 16 gehalten &#160; ° C und in 1% Benzocain in Neunauge Ringer betäubt. Das Rückenmark ist mit Iridektomie Schere über einen dorsalen Zugang durchtrennt und das Tier darf in Frischwassertanks bei 23 ° C erholen. Für in-situ-Hybridisierung werden die Tiere reanästhesiert und die Gehirn und Rückenmark über einen dorsalen Zugang entfernt.

Als Beispiel für die Ergebnisse, die bei der Verwendung dieser Methode erhalten werden können, repräsentative Bilder von wholemounted Gehirn, die die Expression der Transkripte in Neogenin identifizierbaren Rückenmark-Nervenzellen des vorstehenden Steuer und 2 Wochen nach der Läsion Larvenmeerneunaugen sind in Abbildung 2 dargestellt. Die Leser werden auf einer früheren Studie 6 die Berichterstattung über die Beziehung zwischen der Expression von Neogenin nach einer kompletten Durchtre...

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Complete Spinal Cord Injury and Brain Dissection Protocol for Subsequent Wholemount In Situ Hybridization in Larval Sea Lamprey

Komplette Spinal Cord Injury and Brain Dissection Protokoll für spätere Wholemount<em&gt; In-situ</em&gt; Hybridisierung in Larven Seeneunauge

Neunaugen erholen Fortbewegung nach einer kompletten Rückenmarksverletzungen. Jedoch einige Rücken ragenden Neuronen sind gut Regeneratoren sind und andere nicht. Dieses Papier zeigt die Techniken für den Wohnungsbau Meerneunauge Larven (und vor kurzem umgewandelt Erwachsene), Herstellung vollständiger Rückenmarksquerschnitten erhalten und Vorbereitung wholemount Gehirn und Rückenmark für die in situ-Hybridisierung.

After a complete spinal cord injury, sea lampreys at first are paralyzed below the level of transection. However, they recover locomotion after several ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Complete Spinal Cord Injury and Brain Dissection Protocol for Subsequent Wholemount In Situ Hybridization in Larval Sea Lamprey

Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

Dissection und Kultur kommissuralen Nervenzellen aus embryonalen Rückenmark

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

Forschung

Neurowissenschaften

Double Fluorescence in situ Hybridization in Fresh Brain Sections

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Doppel-Fluoreszenz- In situ Hybridisierung in Fresh Hirnschnitten

Here we describe a modified version of a double fluorescence in situ hybridization (dFISH) method optimized for detecting two mRNAs of interest in fresh ...

Lateral Fluid Percussion: Model of Traumatic Brain Injury in Mice

Lateral Fluid-Percussion: Modell Schädel-Hirn-Verletzungen in Mäuse

Traumatic brain injury (TBI) research has attained renewed momentum due to the increasing awareness of head injuries, which result in morbidity and ...

Spinal Cord Transection in the Larval Zebrafish

Rückenmarksdurchtrennung in der Zebrafisch-Larven

Mammals fail in sensory and motor recovery following spinal cord injury due to lack of axonal regrowth below the level of injury as well as an inability ...

An Ex Vivo Laser-induced Spinal Cord Injury Model to Assess Mechanisms of Axonal Degeneration in Real-time

An Ex Vivo Laser-induced Spinal Cord Injury Model to Assess Mechanisms of Axonal Degeneration in Real-time

Ein<em&gt; Ex vivo</em&gt; Laser-induzierte Rückenmarksverletzungen Modell zu Mechanismen der axonalen Degeneration Beurteilen Sie in Echtzeit

Injured CNS axons fail to regenerate and often retract away from the injury site. Axons spared from the initial injury may later undergo secondary axonal ...

Zebrafish In Situ Spinal Cord Preparation for Electrophysiological Recordings from Spinal Sensory and Motor Neurons

Zebrafish In Situ Spinal Cord Preparation for Electrophysiological Recordings from Spinal Sensory and Motor Neurons

Zebrafisch<em&gt; In Situ</em&gt; Spinal Cord Vorbereitung für elektrophysiologische Aufzeichnungen von Spinal Sensory and Motor Neurons

Zebrafish, first introduced as a developmental model, have gained popularity in many other fields. The ease of rearing large numbers of rapidly developing ...

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

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Neuronalen Aktivität im primären somatosensorischen Cortex mit Thy1Imaging-GCaMP6s transgene Mäuse

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in ...

An In Vivo Duo-color Method for Imaging Vascular Dynamics Following Contusive Spinal Cord Injury

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Eine In Vivo Duo-Farbe-Methode für Imaging-vaskuläre Dynamik nach Contusive Spinal Cord Injury

Spinal cord injury (SCI) causes significant vascular disruption at the site of injury. Vascular pathology occurs immediately after SCI and continues ...

Intra-Arterial Delivery of Neural Stem Cells to the Rat and Mouse Brain: Application to Cerebral Ischemia

Intra-arterielle Lieferung von neuronalen Stammzellen an das Ratten- und Maushirn: Anwendung auf zerebrale Ischämie

Neural stem cell (NSC) therapy is an emerging innovative treatment for stroke, traumatic brain injury and neurodegenerative disorders. As compared to ...

Induction of Complete Transection-Type Spinal Cord Injury in Mice

Induktion von vollständiger Transektion-Typ Rückenmarksverletzung bei Mäusen

Spinal cord injury (SCI) largely leads to irreversible and permanent loss of function, most commonly as a result of trauma. Several treatment options, ...