Name: complete spinal cord injury and brain dissection protocol for subsequent wholemount in situ hybridization in larval sea lamprey
Uploaded: 2014-10-14T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Complete Spinal Cord Injury and Brain Dissection Protocol for Subsequent Wholemount In Situ Hybridization in Larval Sea Lamprey at JoVE.com

Supported by NIH Grants NS14837, R01 NS38537, R24 HD050838 to Dr. Michael E. Selzer; Shriners Research Grant SHC-85220 to Dr. Michael E Selzer; and Shriners Research Grant SHC-85310 to Dr. Michael I. Shifman. Dr. Ant&#243;n Barreiro-Iglesias was supported by the Fundaci&#243;n Barri&#233; (Spain) and the Xunta de Galicia (Galicia, Spain).

ראה לוח 1 לכל חומרים המשמשים בפרוטוקול זה. ניסויים אושרו על ידי הוועדה המוסדית הטיפול בבעלי חיים ושימוש באוניברסיטת טמפל. .1 בעלי חיים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl...

<ol>
	<li>Rodicio, M. C., Barreiro-Iglesias, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lampreys+as+an+animal+model+in+regeneration+studies+after+spinal+cord+injury.">Lampreys as an animal model in regeneration studies after spinal cord injury.</a> Rev Neurol. 55, 157-166 (2012).</li><li>Davis, G. R., McClellan, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extent+and+time+course+of+restoration+of+descending+brainstem+projections+in+spinalcord-transected+lamprey.">Extent and time course of restoration of descending brainstem projections in spinalcord-transected lamprey.</a> J Comp Neurol. 344, 65-82 (1994).</li><li>Jacobs, A. J., Swain, G. P., Snedeker, J. A., Pijak, D. S., Gladstone, L. J., Selzer, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recovery+of+neurofilament+expression+selectively+in+regenerating+reticulospinal+neurons.">Recovery of neurofilament expression selectively in regenerating reticulospinal neurons.</a> J Neurosci. 17, 5206-5220 (1997).</li><li>Shifman, M. I., Selzer, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+the+netrin+receptor+UNC-5+in+lamprey+brain+modulation+by+spinal+cord+transection.">Expression of the netrin receptor UNC-5 in lamprey brain modulation by spinal cord transection.</a> Neurorehabil Neural Repair. 14, 49-58 (2000).</li><li>Barreiro-Iglesias, A., Laramore, C., Shifman, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+sea+lamprey+UNC5+receptors+cDNA+cloning,+phylogenetic+analysis+and+expression+in+reticulospinal+neurons+at+larval+and+adult+stages+of+development.">The sea lamprey UNC5 receptors cDNA cloning, phylogenetic analysis and expression in reticulospinal neurons at larval and adult stages of development.</a> J Comp Neurol. 520, 4141-4156 (2012).</li><li>Shifman, M. I., Yumu, l. R. E., Laramore, C., Selzer, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+the+repulsive+guidance+molecule+RGM+and+its+receptor+neogenin+after+spinal+cord+injury+in+sea+lamprey.">Expression of the repulsive guidance molecule RGM and its receptor neogenin after spinal cord injury in sea lamprey.</a> Exp Neurol. 217, 242-251 (2009).</li><li>Busch, D. J., Morgan, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synuclein+accumulation+is+associated+with+cell-specific+neuronal+death+after+spinal+cord+injury.">Synuclein accumulation is associated with cell-specific neuronal death after spinal cord injury.</a> J Comp Neurol. 520, 1751-1771 (2012).</li><li>Shifman, M. I., Zhang, G., Selzer, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delayed+death+of+identified+reticulospinal+neurons+after+spinal+cord+injury+in+lampreys.">Delayed death of identified reticulospinal neurons after spinal cord injury in lampreys.</a> J Comp Neurol. 510, 269-282 (2008).</li><li>Swain, G. P., Jacobs, A. J., Frei, E., Selzer, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+in+situ+hybridization+in+wholemounted+lamprey+brain+neurofilament+expression+in+larvae+and+adults.">A method for in situ hybridization in wholemounted lamprey brain neurofilament expression in larvae and adults.</a> Exp. Neurol. 126, 256-269 (1994).</li><li>Bullock, T. H., Moore, J. K., Fields, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+myelin+sheaths:+both+lamprey+and+hagfish+lack+myelin.">Evolution of myelin sheaths: both lamprey and hagfish lack myelin.</a> Neurosci Lett. 48, 145-148 (1984).</li><li>Cohen, A. H., Kiemel, T., Pate, V., Blinder, J., Guan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temperature+can+alter+the+function+outcome+of+spinal+cord+regeneration+in+larval+lampreys.">Temperature can alter the function outcome of spinal cord regeneration in larval lampreys.</a> Neuroscience. 90, 957-965 (1999).</li></ol>

כאן אנו מציגים פרוטוקול מפורט לביצוע חיתוך רוחב מלא בחוט השדרה ומוח אחורי לנתיחה בlampreys ים זחל. הליך זה מאפשר הבדלי ניתוח בביטוי גנים בין חוט השדרה לזיהוי תאי עצב מקרינים לאחר פגיעה בחוט השדרה באמצעות מוח כל ההר בכלאה באתר. השלב הקריטי בהליך הוא הביצוע הנכון של חיתוך ר...

ביונקי פגיעה בחוט השדרה (SCI) היא מצב הרסני שמוביל לאובדן קבוע של תפקוד מתחת לאתר של פציעה כי האקסונים נפצעו לא להתחדש דרך אזור הטראומה ולהתחבר מחדש למטרות המתאימות. בניגוד ליונקים, lampreys לשחזר תנועה לאחר פגיעה בחוט השדרה מלאה. 1 ​​מעניין, יש לי lampreys סט של 36 חוט השדרה מקרין נוירונים כי הם אישי מזהים בכל הר הכנות מוח בגללם גודל גדול 2,3 (איור 1) . כל הנוירונים מקרין שדרה אלה axotomized על ידי חיתוך רוחב חוט השדרה מלא ברמה גבוהה. המחקרים קודמים של הקבוצה ואחרים שלנו הראו כי אפילו בנוכחות של החלמה תפקודית לאחר SCI חלק מהנוירונים האלה להראות יכולת התחדשות נמוכה מאוד (הם נחשבים &quot;regenerators הרע&quot;), בעוד שאחרים בדרך כלל להתחדש האקסון שלהם דרך האתר של פציעה (הם נחשבים גרם &quot;regenerators ood &quot;). 2,3 מאפיין זה הופך את lampreys מודל חוליות מעניין ללמוד את ההבדלים בביטוי הגנים בין תאי עצב מקרין שדרת regenerator הטוב והרע, כי בתורו יובילו להבדלים ביכולת ההתחדשות הפנימית של תאי עצב המנסה להתחדש האקסונים שלהם באותה הסביבה חיצונית. 1 שימוש במודל זה יש לנו הראה בעבר כי תאי עצב עם ביטוי מופע יכולת משובי נמוך של קולטני מולקולת הדרכת axonal כמו UNC5 4,5 וneogenin, 6 אשר מתווכים את הפעולה המעכבת של netrin וRGM בהתאמה מקרינה שדרה. בנוסף, על ידי שימוש בשיטה זו הקבוצה שלנו הראתה גם כי רק regenerators הטוב להראות התאוששות של הביטוי של neurofilaments לאחר הפציעה ובמהלך תהליך ההתחדשות. לאחרונה, בוש ו7 מורגן הראו על ידי immunofluorescence שregenerators הרע להראות increasביטוי עורך של סינוקלאין לאחר פציעה, שספר על ידי המחברים לעובדה שתאי העצב מקרין השדרה &quot;regenerator הרע&quot; למות לאט לאחר 5,7,8 חיתוך רוחב חוט השדרה מלא. אז, מודל צמד ים של פגיעה בחוט השדרה שלמה התפתח כמודל שימושי מאוד להבין מה גורם נוירון כבל מקרין השדרה &quot;regenerator רע&quot; לאחר axotomy. לבצע המחקרים שלנו אנו מבצעים פרוטוקול מלא בעמוד השדרה חיתוך רוחב כבל ניתוח ונתיחת מוח אחורי בנקודות הזמן הרצויות לאחר פציעה לבצע wholemount הכלאה באתר. במאמר המתודולוגי הנוכחי אנו מציגים פרוטוקול מפורט לביצוע התקין של ניתוח פגיעה בחוט השדרה מלא בlampreys הזחל, התחזוקה הבאה של בעלי החיים ונתיחה הסופית המוח והכנת המוח לwholemount הכלאה באתר. פרוטוקול מפורט לperform wholemount הכלאה באתר במוח של lampreys זחל כבר דווח בעבר. 9 בנוסף, פרוטוקול זה לפגיעה בחוט השדרה ומוח לנתיחה יכול לשמש גם לאחר מכן לעבד את המוח לאימונוהיסטוכימיה או שיטות היסטולוגית אחרות.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="280">
	<tbody>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:64px;">Name of the reagent</td>
			<td style="width:83px;">Company</td>
			<td style="width:64px;">Catalogue number</td>
			<td style="width:71px;">Comments (optional)</td>
		</tr>
		<tr height="148">
			<td height="148" style="height:148px;width:64px;">Tricaine methane sulfonate</td>
			<td style="width:83px;">Spectrum</td>
			<td style="width:64px;">TR108</td>
			<td style="width:71px;">Benzocaine saturated solution in PBS for sacrifice</td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:64px;">Scalpel #3</td>
			<td style="width:83px;">Fine Science Tools (FST)</td>
			<td style="width:64px;">10003-12</td>
			<td style="width:71px;"></td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:64px;">Blades for scalpel: #11</td>
			<td style="width:83px;">Fine Science Tools&#160;</td>
			<td style="width:64px;">10011-00</td>
			<td style="width:71px;"></td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:64px;">Castroviejo scissors #8</td>
			<td style="width:83px;">Fine Science Tools&#160;</td>
			<td style="width:64px;">15002-08</td>
			<td style="width:71px;"></td>
		</tr>
		<tr height="190">
			<td height="190" style="height:190px;width:64px;">Forceps #4 &#38; #5</td>
			<td style="width:83px;">Dumont, Switzerland</td>
			<td style="width:64px;">Roboz RS4955</td>
			<td style="width:71px;">#4 for dissection of Spinal cord; #5 for stripping menninges</td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:64px;">Dissecting Microscope</td>
			<td style="width:83px;">Olympus</td>
			<td style="width:64px;">SZ51</td>
			<td style="width:71px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="63" rowspan="2" style="height:63px;width:64px;">Sylgard</td>
			<td rowspan="2" style="width:83px;">Dow Corning Co.</td>
			<td rowspan="2" style="width:64px;">184</td>
			<td rowspan="2" style="width:71px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
		</tr>
		<tr height="168">
			<td height="189" rowspan="2" style="height:189px;width:64px;">Insect pins 0.15, 0.20 mm</td>
			<td rowspan="2" style="width:83px;">Austerlitz</td>
			<td rowspan="2" style="width:64px;">No catalogue #</td>
			<td rowspan="2" style="width:71px;">0.15 mm for pinning brain and spinal cord; 0.20 mm for the body</td>
		</tr>
		<tr height="21">
		</tr>
		<tr height="127">
			<td height="127" style="height:127px;width:64px;">7 ml HDPE Scintillation Tubes with Caps</td>
			<td style="width:83px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:64px;">03-337-1</td>
			<td style="width:71px;"></td>
		</tr>
		<tr height="106">
			<td height="106" style="height:106px;width:64px;">Paraformaldehyde 16%</td>
			<td style="width:83px;">Electron Microscopy Science (EMS)</td>
			<td style="width:64px;">19210</td>
			<td style="width:71px;">Dilute to 4% in PBS</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

complete spinal cord injury and brain dissection protocol for subsequent wholemount in situ hybridization in larval sea lamprey

לאחר פגיעה בחוט השדרה שלמה, lampreys הים בראשון משותק מתחת לרמה של חיתוך רוחב. עם זאת, הם להתאושש תנועה לאחר מספר שבועות, וזה מלווה בהתחדשות מרחק קצר (כמה מ&quot;מ) של האקסונים propriospinal ואקסונים מקרינים שדרה מגזע המוח. בין 36 הנוירונים מקרין שדרת זיהוי גדול, חלקם regenerators טוב ואחרים הם regenerators רע. יכולים בקלות להיות מזוהים ביותר נוירונים אלה בהכנות למערכת עצבים המרכזיות wholemount. על מנת להבין את מנגנוני נוירון הפנימי שמעדיפים או לעכב התחדשות האקסון לאחר פציעה בחוליות במערכת העצבים המרכזית, אנו קובעים הבדלים בביטוי הגנים בין regenerators הטוב ורע, וכיצד ביטוי מושפע מחיתוך רוחב חוט השדרה. מאמר זה ממחיש את הטכניקות לזחל דיור וlampreys ים הבוגר הפך לאחרונה במיכלי מים טרי, הפקת transections חוט השדרה שלמה תחת חזון מיקרוסקופי, והכנת brעין וwholemounts חוט השדרה לכלאה באתר. בקצרה, מוחזקי בעלים חיים ביום 16 ב &#160; ° C ומורדם ב1% benzocaine ברינגר צמד ים. חוט השדרה הוא transected עם המספריים iridectomy באמצעות גישת גב ובעלי החיים מותר להתאושש במיכלי מים טרי ב23 ° C. לכלאה באתר, בעלי החיים reanesthetized והמוח וחוט שהוסרו באמצעות גישת גב.

כדוגמא לתוצאות שניתן להשיג בעת השימוש בשיטה זו, תמונות מייצגות של מוח wholemounted מראים את הביטוי של תעתיקי neogenin בתאי עצב הניתן לזיהוי בעמוד השדרה מקרין-כבל שליטה ו2 שבועות לפרסם lampreys ים זחל נגע מוצגים באיור 2. הקוראים מופנים למחקר קודם 6 דיווח הקשר בין הביטו...

Watch this Scientific Journal Video about Complete Spinal Cord Injury and Brain Dissection Protocol for Subsequent Wholemount In Situ Hybridization in Larval Sea Lamprey at JoVE.com

Complete Spinal Cord Injury and Brain Dissection Protocol for Subsequent Wholemount In Situ Hybridization in Larval Sea Lamprey

חוט השדרה מלא פגיעה ומוח Dissection פרוטוקול Wholemount לאחר<em&gt; באתר</em&gt; הכלאה בזחל ים צמד ים

Lampreys לשחזר תנועה לאחר פגיעה בחוט השדרה מלאה. עם זאת, חלק מתאי העצב מקרין שדרה הם regenerators טוב ואחרים לא. מאמר זה ממחיש את הטכניקות לזחלי צמד ים ים דיור (ומבוגרים הפכו לאחרונה), הפקת transections חוט השדרה מלאה והכנת מוח wholemount וחוט שדרה לכלאה באתר.

After a complete spinal cord injury, sea lampreys at first are paralyzed below the level of transection. However, they recover locomotion after several ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Complete Spinal Cord Injury and Brain Dissection Protocol for Subsequent Wholemount In Situ Hybridization in Larval Sea Lamprey

Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

Dissection והתרבות של נוירונים Commissural מחוט השדרה עובריים

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

Double Fluorescence in situ Hybridization in Fresh Brain Sections

Double Fluorescence in situ Hybridization in Fresh Brain Sections

פעמיים פלואורסצנטי באתרו הכלאה בסעיפים המוח טריים

Here we describe a modified version of a double fluorescence in situ hybridization (dFISH) method optimized for detecting two mRNAs of interest in fresh ...

Lateral Fluid Percussion: Model of Traumatic Brain Injury in Mice

נוזל הקשה Lateral: דגם של פגיעה מוחית טראומטית של עכברים

Traumatic brain injury (TBI) research has attained renewed momentum due to the increasing awareness of head injuries, which result in morbidity and ...

Spinal Cord Transection in the Larval Zebrafish

חיתוך רוחב חוט השדרה בדג הזברה הזחל

Mammals fail in sensory and motor recovery following spinal cord injury due to lack of axonal regrowth below the level of injury as well as an inability ...

An Ex Vivo Laser-induced Spinal Cord Injury Model to Assess Mechanisms of Axonal Degeneration in Real-time

An Ex Vivo Laser-induced Spinal Cord Injury Model to Assess Mechanisms of Axonal Degeneration in Real-time

<em&gt; Ex Vivo</em&gt; חוט השדרה מושרה לייזר הפגיעה דגם להערכת מנגנוני axonal הניוון בזמן אמת

Injured CNS axons fail to regenerate and often retract away from the injury site. Axons spared from the initial injury may later undergo secondary axonal ...

Zebrafish In Situ Spinal Cord Preparation for Electrophysiological Recordings from Spinal Sensory and Motor Neurons

Zebrafish In Situ Spinal Cord Preparation for Electrophysiological Recordings from Spinal Sensory and Motor Neurons

זברה<em&gt; באתרו</em&gt; הכנת בחוט השדרה עבור הקלטות אלקטרו מתוך השדרה חושית הנוירונים המוטוריים

Zebrafish, first introduced as a developmental model, have gained popularity in many other fields. The ease of rearing large numbers of rapidly developing ...

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

הדמיה פעילות עצבית בתוך קליפת המגע הראשי באמצעות Thy1-העכברים הטרנסגניים GCaMP6s

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in ...

An In Vivo Duo-color Method for Imaging Vascular Dynamics Following Contusive Spinal Cord Injury

An In Vivo Duo-color Method for Imaging Vascular Dynamics Following Contusive Spinal Cord Injury

Vivo דואו-צבע שיטת הדמיה Dynamics כלי הדם בעקבות פגיעה בחוט השדרה Contusive

Spinal cord injury (SCI) causes significant vascular disruption at the site of injury. Vascular pathology occurs immediately after SCI and continues ...

Intra-Arterial Delivery of Neural Stem Cells to the Rat and Mouse Brain: Application to Cerebral Ischemia

משלוח פנים-עורקי של תאי גזע עצביים למוח עכברוש ועכבר: יישום איסכמיה מוחין

Neural stem cell (NSC) therapy is an emerging innovative treatment for stroke, traumatic brain injury and neurodegenerative disorders. As compared to ...

Induction of Complete Transection-Type Spinal Cord Injury in Mice

אינדוקציה של פגיעה מלאה בחוט השדרה מסוג טרנס-פעולה בעכברים

Spinal cord injury (SCI) largely leads to irreversible and permanent loss of function, most commonly as a result of trauma. Several treatment options, ...