Name: complete spinal cord injury and brain dissection protocol for subsequent wholemount in situ hybridization in larval sea lamprey
Uploaded: 2014-10-14T13:00:00
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Supported by NIH Grants NS14837, R01 NS38537, R24 HD050838 to Dr. Michael E. Selzer; Shriners Research Grant SHC-85220 to Dr. Michael E Selzer; and Shriners Research Grant SHC-85310 to Dr. Michael I. Shifman. Dr. Ant&#243;n Barreiro-Iglesias was supported by the Fundaci&#243;n Barri&#233; (Spain) and the Xunta de Galicia (Galicia, Spain).

इस प्रोटोकॉल में प्रयुक्त सामग्री के लिए 1 टेबल देखें. प्रयोगों मंदिर विश्वविद्यालय में संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया. 1 पशु <ol><li> Wildtype लार्वा...

<ol>
	<li>Rodicio, M. C., Barreiro-Iglesias, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lampreys+as+an+animal+model+in+regeneration+studies+after+spinal+cord+injury.">Lampreys as an animal model in regeneration studies after spinal cord injury.</a> Rev Neurol. 55, 157-166 (2012).</li><li>Davis, G. R., McClellan, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extent+and+time+course+of+restoration+of+descending+brainstem+projections+in+spinalcord-transected+lamprey.">Extent and time course of restoration of descending brainstem projections in spinalcord-transected lamprey.</a> J Comp Neurol. 344, 65-82 (1994).</li><li>Jacobs, A. J., Swain, G. P., Snedeker, J. A., Pijak, D. S., Gladstone, L. J., Selzer, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recovery+of+neurofilament+expression+selectively+in+regenerating+reticulospinal+neurons.">Recovery of neurofilament expression selectively in regenerating reticulospinal neurons.</a> J Neurosci. 17, 5206-5220 (1997).</li><li>Shifman, M. I., Selzer, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+the+netrin+receptor+UNC-5+in+lamprey+brain+modulation+by+spinal+cord+transection.">Expression of the netrin receptor UNC-5 in lamprey brain modulation by spinal cord transection.</a> Neurorehabil Neural Repair. 14, 49-58 (2000).</li><li>Barreiro-Iglesias, A., Laramore, C., Shifman, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+sea+lamprey+UNC5+receptors+cDNA+cloning,+phylogenetic+analysis+and+expression+in+reticulospinal+neurons+at+larval+and+adult+stages+of+development.">The sea lamprey UNC5 receptors cDNA cloning, phylogenetic analysis and expression in reticulospinal neurons at larval and adult stages of development.</a> J Comp Neurol. 520, 4141-4156 (2012).</li><li>Shifman, M. I., Yumu, l. R. E., Laramore, C., Selzer, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+the+repulsive+guidance+molecule+RGM+and+its+receptor+neogenin+after+spinal+cord+injury+in+sea+lamprey.">Expression of the repulsive guidance molecule RGM and its receptor neogenin after spinal cord injury in sea lamprey.</a> Exp Neurol. 217, 242-251 (2009).</li><li>Busch, D. J., Morgan, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synuclein+accumulation+is+associated+with+cell-specific+neuronal+death+after+spinal+cord+injury.">Synuclein accumulation is associated with cell-specific neuronal death after spinal cord injury.</a> J Comp Neurol. 520, 1751-1771 (2012).</li><li>Shifman, M. I., Zhang, G., Selzer, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delayed+death+of+identified+reticulospinal+neurons+after+spinal+cord+injury+in+lampreys.">Delayed death of identified reticulospinal neurons after spinal cord injury in lampreys.</a> J Comp Neurol. 510, 269-282 (2008).</li><li>Swain, G. P., Jacobs, A. J., Frei, E., Selzer, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+in+situ+hybridization+in+wholemounted+lamprey+brain+neurofilament+expression+in+larvae+and+adults.">A method for in situ hybridization in wholemounted lamprey brain neurofilament expression in larvae and adults.</a> Exp. Neurol. 126, 256-269 (1994).</li><li>Bullock, T. H., Moore, J. K., Fields, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+myelin+sheaths:+both+lamprey+and+hagfish+lack+myelin.">Evolution of myelin sheaths: both lamprey and hagfish lack myelin.</a> Neurosci Lett. 48, 145-148 (1984).</li><li>Cohen, A. H., Kiemel, T., Pate, V., Blinder, J., Guan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temperature+can+alter+the+function+outcome+of+spinal+cord+regeneration+in+larval+lampreys.">Temperature can alter the function outcome of spinal cord regeneration in larval lampreys.</a> Neuroscience. 90, 957-965 (1999).</li></ol>

यहाँ हम लार्वा समुद्र lampreys में एक पूरा रीढ़ की हड्डी transection और पीछे मस्तिष्क विच्छेदन प्रदर्शन करने के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं. यह प्रक्रिया स्वस्थानी संकरण में एक साबुत माउंट मस्तिष्...

स्तनधारियों में रीढ़ की हड्डी की चोट (एससीआई) घायल axons आघात क्षेत्र के माध्यम से पुनर्जन्म और उनके उचित लक्ष्यों को जोड़ने नहीं है क्योंकि चोट की साइट से नीचे समारोह की स्थायी नुकसान होता है कि एक विनाशकारी स्थिति है. स्तनधारियों के विपरीत, lampreys एक पूरा रीढ़ की हड्डी में चोट के बाद हरकत ठीक हो. 1 दिलचस्प है, lampreys क्योंकि उनके बड़े आकार 2,3 (चित्रा 1) के मस्तिष्क की तैयारी माउंट पूरे 36 रीढ़ की हड्डी में व्यक्तिगत रूप से पहचाने जाने योग्य हैं कि न्यूरॉन्स पेश का एक सेट है . इन रीढ़ की हड्डी में पेश न्यूरॉन्स के सभी एक उच्च स्तरीय पूरा रीढ़ की हड्डी transection द्वारा axotomized रहे हैं. हमारे समूह और अन्य लोगों की पिछले अध्ययनों से दूसरों को आमतौर पर चोट की साइट के माध्यम से अपने अक्षतंतु को पुनर्जीवित करते हुए भी इन न्यूरॉन्स के कुछ एक बहुत कम पुनर्योजी क्षमता दिखाने एससीआई के बाद कार्यात्मक वसूली की उपस्थिति में, (वे &quot;बुरा regenerators&quot; माना जाता है) पता चला है कि (वे विचार कर रहे हैं &quot;जीई regenerators &quot;). 2,3 यह विशेषता lampreys बारी में करने का प्रयास है कि न्यूरॉन्स की आंतरिक पुनर्योजी क्षमता में अंतर को बढ़ावा मिलेगा कि अच्छे और बुरे रिजनरेटर रीढ़ की हड्डी में पेश न्यूरॉन्स के बीच जीन अभिव्यक्ति में मतभेद का अध्ययन करने के लिए एक दिलचस्प हड्डीवाला मॉडल बनाता है एक ही बाह्य वातावरण में अपने axons पुनर्जन्म. 1 हम पहले से पता चला है कि इस मॉडल का उपयोग रीढ़ की हड्डी में पेश क्रमश netrin और RGM की निरोधात्मक कार्रवाई मध्यस्थता जो UNC5 4,5 और neogenin, 6 की तरह axonal मार्गदर्शन अणु रिसेप्टर्स की कम पुनर्योजी क्षमता दिखाने अभिव्यक्ति के साथ न्यूरॉन्स. इसके अलावा, इस पद्धति का उपयोग करके अपने समूह में भी केवल अच्छा regenerators चोट के बाद और उत्थान की प्रक्रिया के दौरान neurofilaments की अभिव्यक्ति का एक वसूली चलता है कि दिखाया गया है. हाल ही में, बुश और मॉर्गन 7 बुरा regenerators एक बढ़ाने बताते हैं कि immunofluorescence से पता चला है&quot;बुरा सुधारनेवाला&quot; रीढ़ की हड्डी में पेश न्यूरॉन्स धीरे धीरे एक पूरा रीढ़ की हड्डी transection 5,7,8 के बाद मर जाते हैं तथ्य यह है कि लेखकों द्वारा संबंधित दिया गया है जो चोट के बाद synuclein की एड अभिव्यक्ति,. तो, एक पूरा रीढ़ की हड्डी में चोट की एक प्रकार की मछली मॉडल एक रीढ़ की हड्डी में पेश न्यूरॉन axotomy के बाद एक &quot;बुरा सुधारनेवाला&quot; क्या करता है समझने के लिए एक बहुत ही उपयोगी मॉडल के रूप में उभरा है. हम स्वस्थानी संकरण में wholemount प्रदर्शन करने के लिए चोट के बाद वांछित समय बिंदुओं पर एक पूरा रीढ़ की हड्डी transection सर्जरी प्रोटोकॉल और एक पीछे मस्तिष्क विच्छेदन प्रदर्शन कर रहे हैं हमारे अध्ययन का संचालन करने के लिए. वर्तमान पद्धति लेख में हम लार्वा lampreys में एक पूरा रीढ़ की हड्डी में चोट की सर्जरी के समुचित निष्पादन के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल मौजूद है, पशुओं के बाद रखरखाव और स्वस्थानी संकरण में एक wholemount के लिए अंतिम मस्तिष्क विच्छेदन और मस्तिष्क की तैयारी. एक विस्तृत प्रोटोकॉल पेलार्वा lampreys के मस्तिष्क में स्वस्थानी संकरण में wholemount rform जैसा कि पहले बताया गया है. 9 इसके अलावा, रीढ़ की हड्डी में चोट और मस्तिष्क विच्छेदन के लिए इस प्रोटोकॉल भी तो immunohistochemistry या अन्य ऊतकीय तरीकों के लिए दिमाग पर कार्रवाई करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="280">
	<tbody>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:64px;">Name of the reagent</td>
			<td style="width:83px;">Company</td>
			<td style="width:64px;">Catalogue number</td>
			<td style="width:71px;">Comments (optional)</td>
		</tr>
		<tr height="148">
			<td height="148" style="height:148px;width:64px;">Tricaine methane sulfonate</td>
			<td style="width:83px;">Spectrum</td>
			<td style="width:64px;">TR108</td>
			<td style="width:71px;">Benzocaine saturated solution in PBS for sacrifice</td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:64px;">Scalpel #3</td>
			<td style="width:83px;">Fine Science Tools (FST)</td>
			<td style="width:64px;">10003-12</td>
			<td style="width:71px;"></td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:64px;">Blades for scalpel: #11</td>
			<td style="width:83px;">Fine Science Tools&#160;</td>
			<td style="width:64px;">10011-00</td>
			<td style="width:71px;"></td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:64px;">Castroviejo scissors #8</td>
			<td style="width:83px;">Fine Science Tools&#160;</td>
			<td style="width:64px;">15002-08</td>
			<td style="width:71px;"></td>
		</tr>
		<tr height="190">
			<td height="190" style="height:190px;width:64px;">Forceps #4 &#38; #5</td>
			<td style="width:83px;">Dumont, Switzerland</td>
			<td style="width:64px;">Roboz RS4955</td>
			<td style="width:71px;">#4 for dissection of Spinal cord; #5 for stripping menninges</td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:64px;">Dissecting Microscope</td>
			<td style="width:83px;">Olympus</td>
			<td style="width:64px;">SZ51</td>
			<td style="width:71px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="63" rowspan="2" style="height:63px;width:64px;">Sylgard</td>
			<td rowspan="2" style="width:83px;">Dow Corning Co.</td>
			<td rowspan="2" style="width:64px;">184</td>
			<td rowspan="2" style="width:71px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
		</tr>
		<tr height="168">
			<td height="189" rowspan="2" style="height:189px;width:64px;">Insect pins 0.15, 0.20 mm</td>
			<td rowspan="2" style="width:83px;">Austerlitz</td>
			<td rowspan="2" style="width:64px;">No catalogue #</td>
			<td rowspan="2" style="width:71px;">0.15 mm for pinning brain and spinal cord; 0.20 mm for the body</td>
		</tr>
		<tr height="21">
		</tr>
		<tr height="127">
			<td height="127" style="height:127px;width:64px;">7 ml HDPE Scintillation Tubes with Caps</td>
			<td style="width:83px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:64px;">03-337-1</td>
			<td style="width:71px;"></td>
		</tr>
		<tr height="106">
			<td height="106" style="height:106px;width:64px;">Paraformaldehyde 16%</td>
			<td style="width:83px;">Electron Microscopy Science (EMS)</td>
			<td style="width:64px;">19210</td>
			<td style="width:71px;">Dilute to 4% in PBS</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

complete spinal cord injury and brain dissection protocol for subsequent wholemount in situ hybridization in larval sea lamprey

एक पूरा रीढ़ की हड्डी में चोट के बाद, पहली बार में समुद्र lampreys transection के स्तर से नीचे लकवा मार जाता है. हालांकि, वे कई हफ्तों के बाद हरकत की वसूली, और इस propriospinal axons और brainstem से रीढ़ की हड्डी में पेश axons की कम दूरी उत्थान (कुछ मिमी) के साथ है. 36 बड़ी पहचान योग्य रीढ़ की हड्डी में पेश न्यूरॉन्स के अलावा, कुछ अच्छा regenerators हैं और दूसरों को बुरा regenerators हैं. ये न्यूरॉन्स सबसे आसानी से wholemount सीएनएस तैयारी में पहचाना जा सकता है. एहसान कि न्यूरॉन आंतरिक तंत्र को समझने या रीढ़ सीएनएस में चोट के बाद अक्षतंतु उत्थान को बाधित करने के लिए, हम अच्छे और बुरे regenerators के बीच जीन अभिव्यक्ति में मतभेद का निर्धारण, और कैसे अभिव्यक्ति रीढ़ की हड्डी transection से प्रभावित है. इस पत्र में सूक्ष्म दृष्टि के तहत पूरा रीढ़ की हड्डी लेनदेन का निर्माण, और बी आर तैयारी, ताजा पानी के टैंक में आवास लार्वा के लिए तकनीक और हाल ही में तब्दील वयस्क समुद्र lampreys दिखाता हैऐन और स्वस्थानी संकरण में के लिए रीढ़ की हड्डी wholemounts. संक्षेप में, जानवरों 16 में रखा जाता है &#160; सी ° और एक प्रकार की मछली घंटी में 1% Benzocaine में anesthetized. रीढ़ की हड्डी एक पृष्ठीय दृष्टिकोण के माध्यम से iridectomy कैंची के साथ transected है और पशु 23 डिग्री सेल्सियस पर ताजा पानी के टैंक में ठीक करने के लिए अनुमति दी है. स्वस्थानी संकरण में के लिए, जानवरों reanesthetized रहे हैं और मस्तिष्क और रस्सी एक पृष्ठीय दृष्टिकोण के माध्यम से हटा दिया.

इस पद्धति का उपयोग करते समय प्राप्त किया जा सकता है कि परिणामों के एक उदाहरण के रूप में पहचाने जाने रीढ़ की हड्डी पेश नियंत्रण के न्यूरॉन्स और 2 सप्ताह में neogenin टेप की अभिव्यक्ति दिखा wholemounted दिमाग के प्रति?...

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Complete Spinal Cord Injury and Brain Dissection Protocol for Subsequent Wholemount In Situ Hybridization in Larval Sea Lamprey

इसके बाद wholemount के लिए पूरी स्पाइनल कॉर्ड चोट और मस्तिष्क विच्छेदन प्रोटोकॉल<em&gt; बगल में</em&gt; लारवल सागर एक प्रकार की मछली में संकरण

Lampreys एक पूरा रीढ़ की हड्डी में चोट के बाद हरकत ठीक हो. हालांकि, कुछ रीढ़ की हड्डी में पेश न्यूरॉन्स अच्छा regenerators हैं और दूसरों को नहीं कर रहे हैं. इस पत्र में पूरा रीढ़ की हड्डी लेनदेन उत्पादन और स्वस्थानी संकरण में लिए wholemount दिमाग और रीढ़ की हड्डी डोरियों की तैयारी, आवास समुद्र एक प्रकार की मछली लार्वा (और हाल ही में तब्दील वयस्क) के लिए तकनीक दिखाता है.

After a complete spinal cord injury, sea lampreys at first are paralyzed below the level of transection. However, they recover locomotion after several ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Complete Spinal Cord Injury and Brain Dissection Protocol for Subsequent Wholemount In Situ Hybridization in Larval Sea Lamprey

Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

विच्छेदन और भ्रूणीय स्पाइनल कॉर्ड से Commissural न्यूरॉन्स की संस्कृति

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

Double Fluorescence in situ Hybridization in Fresh Brain Sections

Double Fluorescence in situ Hybridization in Fresh Brain Sections

डबल प्रतिदीप्ति बगल में</emताजा ब्रेन धारा में> संकरण

Here we describe a modified version of a double fluorescence in situ hybridization (dFISH) method optimized for detecting two mRNAs of interest in fresh ...

Lateral Fluid Percussion: Model of Traumatic Brain Injury in Mice

पार्श्व द्रव टक्कर: चूहों में अभिघातजन्य मस्तिष्क चोट के मॉडल

Traumatic brain injury (TBI) research has attained renewed momentum due to the increasing awareness of head injuries, which result in morbidity and ...

Spinal Cord Transection in the Larval Zebrafish

लार्वा zebrafish में रीढ़ की हड्डी transection

Mammals fail in sensory and motor recovery following spinal cord injury due to lack of axonal regrowth below the level of injury as well as an inability ...

An Ex Vivo Laser-induced Spinal Cord Injury Model to Assess Mechanisms of Axonal Degeneration in Real-time

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एक<em&gt; पूर्व vivo</em&gt; लेजर प्रेरित स्पाइनल कॉर्ड चोट मॉडल वास्तविक समय में axonal अध: पतन के तंत्र का आकलन करने के लिए

Injured CNS axons fail to regenerate and often retract away from the injury site. Axons spared from the initial injury may later undergo secondary axonal ...

Zebrafish In Situ Spinal Cord Preparation for Electrophysiological Recordings from Spinal Sensory and Motor Neurons

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zebrafish<em&gt; सीटू</em&gt; रीढ़ की हड्डी रीढ़ की हड्डी में संवेदी और मोटर न्यूरॉन्स से electrophysiological रिकॉर्डिंग के लिए तैयारी

Zebrafish, first introduced as a developmental model, have gained popularity in many other fields. The ease of rearing large numbers of rapidly developing ...

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

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इमेजिंग तंत्रिका गतिविधि प्राथमिक Somatosensory प्रांतस्था का उपयोग Thy1-GCaMP6s ट्रांसजेनिक चूहों में

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in ...

An In Vivo Duo-color Method for Imaging Vascular Dynamics Following Contusive Spinal Cord Injury

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Vivo में एक डुओ-रंग विधि इमेजिंग संवहनी गतिशीलता के लिए निंनलिखित Contusive रीढ़ की हड्डी में चोट

Spinal cord injury (SCI) causes significant vascular disruption at the site of injury. Vascular pathology occurs immediately after SCI and continues ...

Intra-Arterial Delivery of Neural Stem Cells to the Rat and Mouse Brain: Application to Cerebral Ischemia

चूहा और माउस मस्तिष्क के लिए तंत्रिका स्टेम सेल की अंतर-धमनी वितरण: सेरेब्रल इस्केमिया के लिए आवेदन

Neural stem cell (NSC) therapy is an emerging innovative treatment for stroke, traumatic brain injury and neurodegenerative disorders. As compared to ...

Induction of Complete Transection-Type Spinal Cord Injury in Mice

चूहों में पूर्ण ट्रांसेक्शन-टाइप स्पाइनल कॉर्ड इंजरी का प्रेरण

Spinal cord injury (SCI) largely leads to irreversible and permanent loss of function, most commonly as a result of trauma. Several treatment options, ...