Name: complete spinal cord injury and brain dissection protocol for subsequent wholemount in situ hybridization in larval sea lamprey
Uploaded: 2014-10-14T13:00:00
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Supported by NIH Grants NS14837, R01 NS38537, R24 HD050838 to Dr. Michael E. Selzer; Shriners Research Grant SHC-85220 to Dr. Michael E Selzer; and Shriners Research Grant SHC-85310 to Dr. Michael I. Shifman. Dr. Ant&#243;n Barreiro-Iglesias was supported by the Fundaci&#243;n Barri&#233; (Spain) and the Xunta de Galicia (Galicia, Spain).

このプロトコルで使用されるすべての材料については、表1を参照してください。 実験は、テンプル大学の施設内動物管理使用委員会によって承認された。 1。動物<ol><li>野生型幼虫の海ヤツメウナギ（Petromyzonマリナス L.）を取得し、10 -メイン州のデラウェア川（ペンシルベニア州）またはストリームへの支流から、ミシガン湖?...

<ol>
	<li>Rodicio, M. C., Barreiro-Iglesias, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lampreys+as+an+animal+model+in+regeneration+studies+after+spinal+cord+injury.">Lampreys as an animal model in regeneration studies after spinal cord injury.</a> Rev Neurol. 55, 157-166 (2012).</li><li>Davis, G. R., McClellan, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extent+and+time+course+of+restoration+of+descending+brainstem+projections+in+spinalcord-transected+lamprey.">Extent and time course of restoration of descending brainstem projections in spinalcord-transected lamprey.</a> J Comp Neurol. 344, 65-82 (1994).</li><li>Jacobs, A. J., Swain, G. P., Snedeker, J. A., Pijak, D. S., Gladstone, L. J., Selzer, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recovery+of+neurofilament+expression+selectively+in+regenerating+reticulospinal+neurons.">Recovery of neurofilament expression selectively in regenerating reticulospinal neurons.</a> J Neurosci. 17, 5206-5220 (1997).</li><li>Shifman, M. I., Selzer, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+the+netrin+receptor+UNC-5+in+lamprey+brain+modulation+by+spinal+cord+transection.">Expression of the netrin receptor UNC-5 in lamprey brain modulation by spinal cord transection.</a> Neurorehabil Neural Repair. 14, 49-58 (2000).</li><li>Barreiro-Iglesias, A., Laramore, C., Shifman, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+sea+lamprey+UNC5+receptors+cDNA+cloning,+phylogenetic+analysis+and+expression+in+reticulospinal+neurons+at+larval+and+adult+stages+of+development.">The sea lamprey UNC5 receptors cDNA cloning, phylogenetic analysis and expression in reticulospinal neurons at larval and adult stages of development.</a> J Comp Neurol. 520, 4141-4156 (2012).</li><li>Shifman, M. I., Yumu, l. R. E., Laramore, C., Selzer, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+the+repulsive+guidance+molecule+RGM+and+its+receptor+neogenin+after+spinal+cord+injury+in+sea+lamprey.">Expression of the repulsive guidance molecule RGM and its receptor neogenin after spinal cord injury in sea lamprey.</a> Exp Neurol. 217, 242-251 (2009).</li><li>Busch, D. J., Morgan, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synuclein+accumulation+is+associated+with+cell-specific+neuronal+death+after+spinal+cord+injury.">Synuclein accumulation is associated with cell-specific neuronal death after spinal cord injury.</a> J Comp Neurol. 520, 1751-1771 (2012).</li><li>Shifman, M. I., Zhang, G., Selzer, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delayed+death+of+identified+reticulospinal+neurons+after+spinal+cord+injury+in+lampreys.">Delayed death of identified reticulospinal neurons after spinal cord injury in lampreys.</a> J Comp Neurol. 510, 269-282 (2008).</li><li>Swain, G. P., Jacobs, A. J., Frei, E., Selzer, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+in+situ+hybridization+in+wholemounted+lamprey+brain+neurofilament+expression+in+larvae+and+adults.">A method for in situ hybridization in wholemounted lamprey brain neurofilament expression in larvae and adults.</a> Exp. Neurol. 126, 256-269 (1994).</li><li>Bullock, T. H., Moore, J. K., Fields, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+myelin+sheaths:+both+lamprey+and+hagfish+lack+myelin.">Evolution of myelin sheaths: both lamprey and hagfish lack myelin.</a> Neurosci Lett. 48, 145-148 (1984).</li><li>Cohen, A. H., Kiemel, T., Pate, V., Blinder, J., Guan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temperature+can+alter+the+function+outcome+of+spinal+cord+regeneration+in+larval+lampreys.">Temperature can alter the function outcome of spinal cord regeneration in larval lampreys.</a> Neuroscience. 90, 957-965 (1999).</li></ol>

ここでは、幼虫の海のヤツメウナギで完全な脊髄離断および後脳の解剖を実行するために詳細なプロトコルを提示する。この手順では、in situハイブリダイゼーションホールマウント脳による脊髄損傷後のニューロンを投影する識別可能な脊髄の間の遺伝子発現の差を分析することができる。手順における重要なステップはstereomicrocope下、脊髄の切断端を観察することによって制御され、穏や...

哺乳動物では、脊髄損傷（SCI）は、負傷した軸索がトラウマゾーンを通って再生し、それらの適切なターゲットに再接続していないため、損傷部位以下の機能の永久的な損失につながる壊滅的な条件である。哺乳類とは対照的に、ヤツメウナギは、完全な脊髄損傷後の運動を回復。1興味深いことに、ヤツメウナギは、それらの大きなサイズのホールマウント脳調製物において個別に識別可能なニューロンを投影する36脊髄のセットを持っている2,3（ 図1） 。これらの脊髄投射ニューロンのすべてが高レベルの完全な脊髄離断により軸索切断されている。私たちのグループとその他の以前の研究では、他の人は通常、損傷部位を通じて軸索を再生しながらでも、これらのニューロンのいくつかは非常に低い再生能力を示し、SCI後の機能回復の存在下で、（彼らは &quot;悪い再生器を」と考えられている）ことを示している（それらが考慮される「グラムOOD再生器」）。2,3この特性は、ヤツメウナギ面白い脊椎動物モデルは今度にしようとする神経細胞の本質的な再生能力の違いにつながる良い面と悪い蓄冷脊髄投射ニューロン間の遺伝子発現の違いを研究することができます同じ外因環境での軸索を再生。1 このモデルを用いて、私たちは、以前にそれぞれネトリンとRGMの阻害作用を媒介しUNC5 4,5及びネオゲニンなどの軸索ガイダンス分子レセプターの低い再生能力を示して発現とその脊髄投射ニューロン、6を示している。また、この方法を使用することによってわれわれのグループはまた、唯一の良い再生器は、損傷後、再生プロセス中にニューロフィラメントの発現の回復を示すことが示されている。最近では、ブッシュとモーガン7が悪い再生器がincreasを示すことが免疫蛍光によって示されている「悪い再生器「脊髄投射ニューロンはゆっくりと完全な脊髄離断5,7,8の後に死亡するという事実に著者によって関係している傷害後シヌクレインのエド式。だから、完全な脊髄損傷のヤツメウナギモデルは、脊髄に突出ニューロン軸索切断後に「悪い再生器 &quot;を作るかを理解するために非常に有用なモデルとして登場しました。 私たちの研究を実施するために、本 ​​発明者らは、in situハイブリダイゼーションホールマウントを実行するために、損傷した後、所望の時点で完全な脊髄離断手術プロトコルと後方脳の解剖を行っている。現在の方法論的な記事では、幼虫ヤツメウナギにおける完全な脊髄損傷の手術の適正なパフォーマンスのために詳細なプロトコルを提示し、動物のその後のメンテナンスやin situハイブリダイゼーションホールマウントのための最終的な脳の解剖と脳の準備。 PEに詳細なプロトコル幼虫ヤツメウナギの脳においてin situハイブリダイゼーションホールマウントをrformは、以前に報告されている。9はまた、脊髄損傷および脳の解剖のためのこのプロトコルは、その後、免疫組織化学または他の組織学的方法のために脳を処理するために使用することができる。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="280">
	<tbody>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:64px;">Name of the reagent</td>
			<td style="width:83px;">Company</td>
			<td style="width:64px;">Catalogue number</td>
			<td style="width:71px;">Comments (optional)</td>
		</tr>
		<tr height="148">
			<td height="148" style="height:148px;width:64px;">Tricaine methane sulfonate</td>
			<td style="width:83px;">Spectrum</td>
			<td style="width:64px;">TR108</td>
			<td style="width:71px;">Benzocaine saturated solution in PBS for sacrifice</td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:64px;">Scalpel #3</td>
			<td style="width:83px;">Fine Science Tools (FST)</td>
			<td style="width:64px;">10003-12</td>
			<td style="width:71px;"></td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:64px;">Blades for scalpel: #11</td>
			<td style="width:83px;">Fine Science Tools&#160;</td>
			<td style="width:64px;">10011-00</td>
			<td style="width:71px;"></td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:64px;">Castroviejo scissors #8</td>
			<td style="width:83px;">Fine Science Tools&#160;</td>
			<td style="width:64px;">15002-08</td>
			<td style="width:71px;"></td>
		</tr>
		<tr height="190">
			<td height="190" style="height:190px;width:64px;">Forceps #4 &#38; #5</td>
			<td style="width:83px;">Dumont, Switzerland</td>
			<td style="width:64px;">Roboz RS4955</td>
			<td style="width:71px;">#4 for dissection of Spinal cord; #5 for stripping menninges</td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:64px;">Dissecting Microscope</td>
			<td style="width:83px;">Olympus</td>
			<td style="width:64px;">SZ51</td>
			<td style="width:71px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="63" rowspan="2" style="height:63px;width:64px;">Sylgard</td>
			<td rowspan="2" style="width:83px;">Dow Corning Co.</td>
			<td rowspan="2" style="width:64px;">184</td>
			<td rowspan="2" style="width:71px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
		</tr>
		<tr height="168">
			<td height="189" rowspan="2" style="height:189px;width:64px;">Insect pins 0.15, 0.20 mm</td>
			<td rowspan="2" style="width:83px;">Austerlitz</td>
			<td rowspan="2" style="width:64px;">No catalogue #</td>
			<td rowspan="2" style="width:71px;">0.15 mm for pinning brain and spinal cord; 0.20 mm for the body</td>
		</tr>
		<tr height="21">
		</tr>
		<tr height="127">
			<td height="127" style="height:127px;width:64px;">7 ml HDPE Scintillation Tubes with Caps</td>
			<td style="width:83px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:64px;">03-337-1</td>
			<td style="width:71px;"></td>
		</tr>
		<tr height="106">
			<td height="106" style="height:106px;width:64px;">Paraformaldehyde 16%</td>
			<td style="width:83px;">Electron Microscopy Science (EMS)</td>
			<td style="width:64px;">19210</td>
			<td style="width:71px;">Dilute to 4% in PBS</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

complete spinal cord injury and brain dissection protocol for subsequent wholemount in situ hybridization in larval sea lamprey

完全な脊髄損傷後、最初は海のヤツメウナギは離断のレベル以下に麻痺している。しかし、これらは数週間後に歩行をリカバリし、これを脊髄固有の軸索および脳幹から脊髄に突出する軸索の短い距離再生（数mm）を伴う。 36大の識別可能脊髄投射ニューロンの中には、優れた再生器であり、他は悪い再生器である。これらのニューロンは、最も容易にホールマウントCNS調製物中で同定することができる。有利ニューロン固有のメカニズムを理解または脊椎動物CNSにおける損傷後の軸索再生を阻害するためには、良い、悪い再生器との間の遺伝子発現の相違を決定する方法、および発現は、脊髄切断によって影響される。本稿では、顕微鏡のビジョンの下で、完全な脊髄離断を生産、住宅幼虫のための技術と新鮮な水タンク内の最近変換された大人の海のヤツメウナギを示しており、BRの準備AINおよびin situハイブリダイゼーションのための脊髄wholemounts。簡単に述べると、動物を16に維持される&#160; C°、ヤツメウナギリンガーで1％ベンゾカインで麻酔し。脊髄は背側アプローチを介して、虹彩切除鋏で切開され、動物は23℃の真水タンクに回復させる。 in situハイブリダイゼーションのために、動物を再麻酔され、脳と脊髄は背側アプローチを介して除去。

この方法を使用するときに得られる結果は、識別可能な脊髄突出におけるネオゲニン転写物の発現を示すwholemounted脳の代表画像の一例として、制御のニューロンおよび2週間後の病変幼虫海ヤツメウナギは、 図2に示されている。読者は、完全な脊髄離断および完全な詳細については、海のヤツメウナギの神経細胞を投影する識別可能な脊髄の再生能力の後ネオゲニンの発現との?...

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Complete Spinal Cord Injury and Brain Dissection Protocol for Subsequent Wholemount In Situ Hybridization in Larval Sea Lamprey

その後のホールマウントのための完全な脊髄損傷や脳解剖プロトコル<em&gt;その場で</em&gt;幼虫海ヤツメウナギにおけるハイブリダイゼーション

ヤツメウナギは、完全な脊髄損傷後の運動を回復する。しかし、いくつかの脊髄投射ニューロンが良い再生器であり、そうでないものもあります。本稿では、完全な脊髄離断を生成し、in situハイブリダイゼーションのためのホールマウントの脳や脊髄の準備、住宅海ヤツメウナギの幼生（最近変換された大人）のための手法を例示する。

After a complete spinal cord injury, sea lampreys at first are paralyzed below the level of transection. However, they recover locomotion after several ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Complete Spinal Cord Injury and Brain Dissection Protocol for Subsequent Wholemount In Situ Hybridization in Larval Sea Lamprey

Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

胚の脊髄から交連ニューロンの解剖と文化

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

Double Fluorescence in situ Hybridization in Fresh Brain Sections

Double Fluorescence in situ Hybridization in Fresh Brain Sections

二重蛍光その場で</em新鮮な脳切片における>ハイブリダイゼーション

Here we describe a modified version of a double fluorescence in situ hybridization (dFISH) method optimized for detecting two mRNAs of interest in fresh ...

Lateral Fluid Percussion: Model of Traumatic Brain Injury in Mice

横方向の流体のパーカッション：マウスにおける外傷性脳損傷のモデル

Traumatic brain injury (TBI) research has attained renewed momentum due to the increasing awareness of head injuries, which result in morbidity and ...

Spinal Cord Transection in the Larval Zebrafish

幼虫のゼブラフィッシュにおける脊髄切断

Mammals fail in sensory and motor recovery following spinal cord injury due to lack of axonal regrowth below the level of injury as well as an inability ...

An Ex Vivo Laser-induced Spinal Cord Injury Model to Assess Mechanisms of Axonal Degeneration in Real-time

An Ex Vivo Laser-induced Spinal Cord Injury Model to Assess Mechanisms of Axonal Degeneration in Real-time

アン<em&gt;エクスビボ</em&gt;レーザー誘起脊髄損傷モデルがリアルタイムで軸索変性のメカニズムを評価するために

Injured CNS axons fail to regenerate and often retract away from the injury site. Axons spared from the initial injury may later undergo secondary axonal ...

Zebrafish In Situ Spinal Cord Preparation for Electrophysiological Recordings from Spinal Sensory and Motor Neurons

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ゼブラフィッシュ<em&gt;その場での</em&gt;脊髄脊髄感覚運動ニューロンからの電気生理学的記録のための準備

Zebrafish, first introduced as a developmental model, have gained popularity in many other fields. The ease of rearing large numbers of rapidly developing ...

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

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Thy1を用いた一次体性感覚野における神経活動のイメージング-GCaMP6s トランスジェニック マウス

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in ...

An In Vivo Duo-color Method for Imaging Vascular Dynamics Following Contusive Spinal Cord Injury

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In Vivoデュオ カラー霊長類脊髄損傷血管動態のイメージング手法

Spinal cord injury (SCI) causes significant vascular disruption at the site of injury. Vascular pathology occurs immediately after SCI and continues ...

Intra-Arterial Delivery of Neural Stem Cells to the Rat and Mouse Brain: Application to Cerebral Ischemia

ラットおよびマウス脳への神経幹細胞の動脈内デリバリー:脳虚血への応用

Neural stem cell (NSC) therapy is an emerging innovative treatment for stroke, traumatic brain injury and neurodegenerative disorders. As compared to ...

Induction of Complete Transection-Type Spinal Cord Injury in Mice

マウスにおける完全なトランセクション型脊髄損傷の誘導

Spinal cord injury (SCI) largely leads to irreversible and permanent loss of function, most commonly as a result of trauma. Several treatment options, ...