Name: complete spinal cord injury and brain dissection protocol for subsequent wholemount in situ hybridization in larval sea lamprey
Uploaded: 2014-10-14T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Complete Spinal Cord Injury and Brain Dissection Protocol for Subsequent Wholemount In Situ Hybridization in Larval Sea Lamprey at JoVE.com

Supported by NIH Grants NS14837, R01 NS38537, R24 HD050838 to Dr. Michael E. Selzer; Shriners Research Grant SHC-85220 to Dr. Michael E Selzer; and Shriners Research Grant SHC-85310 to Dr. Michael I. Shifman. Dr. Ant&#243;n Barreiro-Iglesias was supported by the Fundaci&#243;n Barri&#233; (Spain) and the Xunta de Galicia (Galicia, Spain).

Se tabell 1 for alle materialer som brukes i denne protokollen. Forsøkene ble godkjent av Institutional Animal Care og bruk komité ved Temple University. 1. Dyr <ol><li> Skaff villtype larve sjøen lampreys (Petromyzon marinus L.), 10 - 14 cm i lengde (4 - 7 år) fra bekker fôring Lake Michigan, fra sideelver til Delaware River (Pennsylvania) eller bekker i Maine. </li><li> I laboratoriet opprett larver i grupper på 50 - 100 dyr i ...

<ol>
	<li>Rodicio, M. C., Barreiro-Iglesias, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lampreys+as+an+animal+model+in+regeneration+studies+after+spinal+cord+injury.">Lampreys as an animal model in regeneration studies after spinal cord injury.</a> Rev Neurol. 55, 157-166 (2012).</li><li>Davis, G. R., McClellan, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extent+and+time+course+of+restoration+of+descending+brainstem+projections+in+spinalcord-transected+lamprey.">Extent and time course of restoration of descending brainstem projections in spinalcord-transected lamprey.</a> J Comp Neurol. 344, 65-82 (1994).</li><li>Jacobs, A. J., Swain, G. P., Snedeker, J. A., Pijak, D. S., Gladstone, L. J., Selzer, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recovery+of+neurofilament+expression+selectively+in+regenerating+reticulospinal+neurons.">Recovery of neurofilament expression selectively in regenerating reticulospinal neurons.</a> J Neurosci. 17, 5206-5220 (1997).</li><li>Shifman, M. I., Selzer, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+the+netrin+receptor+UNC-5+in+lamprey+brain+modulation+by+spinal+cord+transection.">Expression of the netrin receptor UNC-5 in lamprey brain modulation by spinal cord transection.</a> Neurorehabil Neural Repair. 14, 49-58 (2000).</li><li>Barreiro-Iglesias, A., Laramore, C., Shifman, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+sea+lamprey+UNC5+receptors+cDNA+cloning,+phylogenetic+analysis+and+expression+in+reticulospinal+neurons+at+larval+and+adult+stages+of+development.">The sea lamprey UNC5 receptors cDNA cloning, phylogenetic analysis and expression in reticulospinal neurons at larval and adult stages of development.</a> J Comp Neurol. 520, 4141-4156 (2012).</li><li>Shifman, M. I., Yumu, l. R. E., Laramore, C., Selzer, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+the+repulsive+guidance+molecule+RGM+and+its+receptor+neogenin+after+spinal+cord+injury+in+sea+lamprey.">Expression of the repulsive guidance molecule RGM and its receptor neogenin after spinal cord injury in sea lamprey.</a> Exp Neurol. 217, 242-251 (2009).</li><li>Busch, D. J., Morgan, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synuclein+accumulation+is+associated+with+cell-specific+neuronal+death+after+spinal+cord+injury.">Synuclein accumulation is associated with cell-specific neuronal death after spinal cord injury.</a> J Comp Neurol. 520, 1751-1771 (2012).</li><li>Shifman, M. I., Zhang, G., Selzer, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delayed+death+of+identified+reticulospinal+neurons+after+spinal+cord+injury+in+lampreys.">Delayed death of identified reticulospinal neurons after spinal cord injury in lampreys.</a> J Comp Neurol. 510, 269-282 (2008).</li><li>Swain, G. P., Jacobs, A. J., Frei, E., Selzer, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+in+situ+hybridization+in+wholemounted+lamprey+brain+neurofilament+expression+in+larvae+and+adults.">A method for in situ hybridization in wholemounted lamprey brain neurofilament expression in larvae and adults.</a> Exp. Neurol. 126, 256-269 (1994).</li><li>Bullock, T. H., Moore, J. K., Fields, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+myelin+sheaths:+both+lamprey+and+hagfish+lack+myelin.">Evolution of myelin sheaths: both lamprey and hagfish lack myelin.</a> Neurosci Lett. 48, 145-148 (1984).</li><li>Cohen, A. H., Kiemel, T., Pate, V., Blinder, J., Guan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temperature+can+alter+the+function+outcome+of+spinal+cord+regeneration+in+larval+lampreys.">Temperature can alter the function outcome of spinal cord regeneration in larval lampreys.</a> Neuroscience. 90, 957-965 (1999).</li></ol>

Her presenterer vi en detaljert protokoll for å utføre en komplett ryggmargstran og posterior hjernen disseksjon i larve sjøen lampreys. Denne prosedyren kan analysere forskjeller i genuttrykk mellom identifiserbare ryggmargsutstikk nevroner etter ryggmargsskade ved hjelp av en hel-mount hjernen in situ hybridisering. Det kritiske trinnet i fremgangsmåten er den riktige utførelse av en komplett ryggmargstranseksjon, som kan styres ved å observere de kappede ender av ryggmargen under stereomicrocope og bekreftet 24...

Hos pattedyr ryggmargsskade (SCI) er en ødeleggende tilstand som fører til permanent tap av funksjon under skadestedet fordi skadde axoner ikke regenerere gjennom traumer sonen og koble til sine respektive mål. I motsetning til pattedyr, lampreys gjenopprette bevegelse etter en fullstendig ryggmargsskade. Ett Interessant lampreys har et sett av 36 ryggmargen som rager nevroner som er enkeltvis identifiserbare i hel-montere hjerne preparater på grunn av deres store størrelse 2,3 (figur 1) . Alle disse spinal-neuroner blir utragende axotomized ved et høyt nivå komplett ryggmargstranseksjon. Tidligere studier av vår gruppe, og andre har vist at selv i nærvær av funksjonell restitusjon etter SCI noen av disse neuroner viser en svært lav evne til reproduksjon (de anses som &quot;dårlig regeneratorer&quot;), mens andre vanligvis regenerere deres axon gjennom skadestedet (de regnes som &quot;good regenerators &quot;). 2,3 Denne egenskapen gjør lampreys en interessant virveldyr modell for å studere forskjeller i genuttrykk mellom gode og dårlige regenerator spinal-projisere nevroner som i sin tur vil føre til forskjeller i den iboende regenererende evne nevroner som forsøker å regenerering av aksoner i den samme ytre miljø. ett Ved hjelp av denne modellen vi har tidligere vist at spinal-projisere nevroner med lav regenerativ evne vis uttrykk for aksonale veiledning molekyl reseptorer som UNC5 4,5 og neogenin, 6 som medierer den hemmende virkningen av netrin og RGM hhv. I tillegg, ved å bruke denne metoden vår gruppe har også vist at bare de gode regeneratorer viser en gjenvinning av ekspresjonen av neurofilaments etter skaden, og i løpet av regenereringen. Nylig, Busch og Morgan 7 har vist ved immunfluorescens at de dårlige regenerators viser en increased ekspresjon av synuclein etter skade, som har vært knyttet av forfatterne til det faktum at den &quot;dårlige&quot; regenerator spinal-neuroner som rager langsomt dø etter en fullstendig ryggmargstran 5,7,8. Så har niøyemodell av et komplett ryggmargsskade dukket opp som en svært nyttig modell for å forstå hva som gjør en ryggmarg projisere nevron en &quot;dårlig regenerator&quot; etter axotomy. For å gjennomføre våre studier vi utfører en komplett ryggmargstran kirurgi protokoll og en posterior hjernen disseksjon på de ønskede tidspunkter etter skade til å utføre wholemount in situ hybridisering. I den foreliggende metodiske artikkelen presenterer vi en detaljert protokoll for en forsvarlig saksbehandling i en komplett ryggmargsskade kirurgi i larve lampreys, den påfølgende vedlikehold av dyrene og den endelige hjernen disseksjon og forberedelse av hjernen for en wholemount in situ hybridisering. En detaljert protokoll til PErform den wholemount in situ hybridisering i hjernen av larver lampreys tidligere er blitt rapportert. 9. I tillegg har denne protokoll for ryggmargsskade og hjerne disseksjon kan også brukes til å behandle deretter hjernene for immunohistokjemi eller andre histologiske metoder.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="280">
	<tbody>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:64px;">Name of the reagent</td>
			<td style="width:83px;">Company</td>
			<td style="width:64px;">Catalogue number</td>
			<td style="width:71px;">Comments (optional)</td>
		</tr>
		<tr height="148">
			<td height="148" style="height:148px;width:64px;">Tricaine methane sulfonate</td>
			<td style="width:83px;">Spectrum</td>
			<td style="width:64px;">TR108</td>
			<td style="width:71px;">Benzocaine saturated solution in PBS for sacrifice</td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:64px;">Scalpel #3</td>
			<td style="width:83px;">Fine Science Tools (FST)</td>
			<td style="width:64px;">10003-12</td>
			<td style="width:71px;"></td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:64px;">Blades for scalpel: #11</td>
			<td style="width:83px;">Fine Science Tools&#160;</td>
			<td style="width:64px;">10011-00</td>
			<td style="width:71px;"></td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:64px;">Castroviejo scissors #8</td>
			<td style="width:83px;">Fine Science Tools&#160;</td>
			<td style="width:64px;">15002-08</td>
			<td style="width:71px;"></td>
		</tr>
		<tr height="190">
			<td height="190" style="height:190px;width:64px;">Forceps #4 &#38; #5</td>
			<td style="width:83px;">Dumont, Switzerland</td>
			<td style="width:64px;">Roboz RS4955</td>
			<td style="width:71px;">#4 for dissection of Spinal cord; #5 for stripping menninges</td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:64px;">Dissecting Microscope</td>
			<td style="width:83px;">Olympus</td>
			<td style="width:64px;">SZ51</td>
			<td style="width:71px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="63" rowspan="2" style="height:63px;width:64px;">Sylgard</td>
			<td rowspan="2" style="width:83px;">Dow Corning Co.</td>
			<td rowspan="2" style="width:64px;">184</td>
			<td rowspan="2" style="width:71px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
		</tr>
		<tr height="168">
			<td height="189" rowspan="2" style="height:189px;width:64px;">Insect pins 0.15, 0.20 mm</td>
			<td rowspan="2" style="width:83px;">Austerlitz</td>
			<td rowspan="2" style="width:64px;">No catalogue #</td>
			<td rowspan="2" style="width:71px;">0.15 mm for pinning brain and spinal cord; 0.20 mm for the body</td>
		</tr>
		<tr height="21">
		</tr>
		<tr height="127">
			<td height="127" style="height:127px;width:64px;">7 ml HDPE Scintillation Tubes with Caps</td>
			<td style="width:83px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:64px;">03-337-1</td>
			<td style="width:71px;"></td>
		</tr>
		<tr height="106">
			<td height="106" style="height:106px;width:64px;">Paraformaldehyde 16%</td>
			<td style="width:83px;">Electron Microscopy Science (EMS)</td>
			<td style="width:64px;">19210</td>
			<td style="width:71px;">Dilute to 4% in PBS</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

complete spinal cord injury and brain dissection protocol for subsequent wholemount in situ hybridization in larval sea lamprey

Etter en komplett ryggmargsskade, er havet lampreys på første lammet under nivået for tran. Men gjenopprette de locomotion etter flere uker, og dette er ledsaget av kort avstand regenerering (noen mm) av propriospinal axoner og spinal-projisere axoner fra hjernestammen. Blant de 36 store identifiserbare spinal-projisere nevroner, noen er gode regenerators og andre er dårlige regenerators. Disse nevronene lettest kan identifiseres i wholemount CNS forberedelser. For å forstå nervecellen-iboende mekanismer som favoriserer eller hemme axon regenerering etter skade i virveldyr CNS, avgjør vi forskjeller i genuttrykk mellom de gode og dårlige regenerators, og hvordan uttrykket påvirkes av ryggmargen tran. Denne artikkelen illustrerer teknikker for boliger larve og voksen nylig forvandlet sjøen lampreys i ferskvannstanker, som produserer komplette ryggmargs transections henhold mikroskopisk syn, og forbereder brain og ryggmargs wholemounts for in situ hybridisering. Kort, blir dyrene holdt ved 16 &#160; ° C og bedøvet i 1% Benzokain i niøye Ringer. Ryggmargen er transektert med iridectomy saks via en rygg tilnærming og dyret er lov til å komme i ferskvannstanker ved 23 ° C. For in situ hybridisering, blir dyrene reanesthetized og hjernen og ledningen fjernes via en dorsal tilnærming.

Som et eksempel på hvilke resultater som kan oppnås ved bruk av denne metoden, representative bilder av wholemounted hjerner viser uttrykk for neogenin transkripsjoner i identifiserbare ryggmargs-projisere nevroner av kontroll og 2 uker etter lesjon larve sjøen lampreys er vist i figur 2. De leserne blir henvist til en tidligere studie 6 rapporterer forholdet mellom ekspresjonen av neogenin etter en fullstendig ryggmargstranseksjon og den regenererende evne til identifiserbare ryggmargs ra...

Watch this Scientific Journal Video about Complete Spinal Cord Injury and Brain Dissection Protocol for Subsequent Wholemount In Situ Hybridization in Larval Sea Lamprey at JoVE.com

Complete Spinal Cord Injury and Brain Dissection Protocol for Subsequent Wholemount In Situ Hybridization in Larval Sea Lamprey

Komplett ryggmargsskade og Brain Dissection Protokoll for Følgende Wholemount<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisering i Larve Sea Lamprey

Lampreys gjenopprette bevegelse etter en komplett ryggmargsskade. Men noen spinal-projisere nevroner er gode regenerators og andre ikke. Denne artikkelen illustrerer teknikker for boliger havet lamprett larver (og nylig forvandlet voksne), som produserer komplette ryggmargs transections og forbereder wholemount hjerne og ryggmargen for in situ hybridisering.

After a complete spinal cord injury, sea lampreys at first are paralyzed below the level of transection. However, they recover locomotion after several ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Complete Spinal Cord Injury and Brain Dissection Protocol for Subsequent Wholemount In Situ Hybridization in Larval Sea Lamprey

Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

Double Fluorescence in situ Hybridization in Fresh Brain Sections

Double Fluorescence in situ Hybridization in Fresh Brain Sections

Here we describe a modified version of a double fluorescence in situ hybridization (dFISH) method optimized for detecting two mRNAs of interest in fresh ...

Lateral Fluid Percussion: Model of Traumatic Brain Injury in Mice

Traumatic brain injury (TBI) research has attained renewed momentum due to the increasing awareness of head injuries, which result in morbidity and ...

Spinal Cord Transection in the Larval Zebrafish

Spinal Cord tran i Larve Sebrafisk

Mammals fail in sensory and motor recovery following spinal cord injury due to lack of axonal regrowth below the level of injury as well as an inability ...

An Ex Vivo Laser-induced Spinal Cord Injury Model to Assess Mechanisms of Axonal Degeneration in Real-time

An Ex Vivo Laser-induced Spinal Cord Injury Model to Assess Mechanisms of Axonal Degeneration in Real-time

En<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Laser-indusert ryggmargsskade Model å vurdere Mekanismer av aksonal degenerasjon i sanntid

Injured CNS axons fail to regenerate and often retract away from the injury site. Axons spared from the initial injury may later undergo secondary axonal ...

Zebrafish In Situ Spinal Cord Preparation for Electrophysiological Recordings from Spinal Sensory and Motor Neurons

Zebrafish In Situ Spinal Cord Preparation for Electrophysiological Recordings from Spinal Sensory and Motor Neurons

sebrafisk<em&gt; In Situ</em&gt; Spinal Cord Forberedelse til Elektrofysiologiske Opptak fra Spinal sensoriske og motoriske nevroner

Zebrafish, first introduced as a developmental model, have gained popularity in many other fields. The ease of rearing large numbers of rapidly developing ...

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

Imaging nevrale aktivitet i primære Somatosensory Cortex ved hjelp av Thy1-GCaMP6s transgene mus

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in ...

An In Vivo Duo-color Method for Imaging Vascular Dynamics Following Contusive Spinal Cord Injury

An In Vivo Duo-color Method for Imaging Vascular Dynamics Following Contusive Spinal Cord Injury

En i Vivo Duo-farge metode for Imaging vaskulær Dynamics etter Contusive ryggmargsskade

Spinal cord injury (SCI) causes significant vascular disruption at the site of injury. Vascular pathology occurs immediately after SCI and continues ...

Intra-Arterial Delivery of Neural Stem Cells to the Rat and Mouse Brain: Application to Cerebral Ischemia

Intraarteriell levering av nevrale stamceller til rotte- og mushjernen: Søknad om cerebral iskemi

Neural stem cell (NSC) therapy is an emerging innovative treatment for stroke, traumatic brain injury and neurodegenerative disorders. As compared to ...

Induction of Complete Transection-Type Spinal Cord Injury in Mice

Induksjon av fullstendig transeksjon-type ryggmargsskade hos mus

Spinal cord injury (SCI) largely leads to irreversible and permanent loss of function, most commonly as a result of trauma. Several treatment options, ...