Name: complete spinal cord injury and brain dissection protocol for subsequent wholemount in situ hybridization in larval sea lamprey
Uploaded: 2014-10-14T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Complete Spinal Cord Injury and Brain Dissection Protocol for Subsequent Wholemount In Situ Hybridization in Larval Sea Lamprey at JoVE.com

Supported by NIH Grants NS14837, R01 NS38537, R24 HD050838 to Dr. Michael E. Selzer; Shriners Research Grant SHC-85220 to Dr. Michael E Selzer; and Shriners Research Grant SHC-85310 to Dr. Michael I. Shifman. Dr. Ant&#243;n Barreiro-Iglesias was supported by the Fundaci&#243;n Barri&#233; (Spain) and the Xunta de Galicia (Galicia, Spain).

Ver Tabela 1 para todos os materiais utilizados neste protocolo. Os experimentos foram aprovados pelo Comitê de Uso e Cuidado Animal Institucional da Universidade de Temple. 1. Os animais <ol><li> Obter tipo selvagem lampreias marinhas larvais (Petromyzon marinus L.), 10-14 cm de comprimento (4-7 anos) dos córregos que alimentam o Lago Michigan, a partir de afluentes do rio Delaware (Pensilvânia) ou córregos em Maine. </li><li> No ...

<ol>
	<li>Rodicio, M. C., Barreiro-Iglesias, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lampreys+as+an+animal+model+in+regeneration+studies+after+spinal+cord+injury.">Lampreys as an animal model in regeneration studies after spinal cord injury.</a> Rev Neurol. 55, 157-166 (2012).</li><li>Davis, G. R., McClellan, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extent+and+time+course+of+restoration+of+descending+brainstem+projections+in+spinalcord-transected+lamprey.">Extent and time course of restoration of descending brainstem projections in spinalcord-transected lamprey.</a> J Comp Neurol. 344, 65-82 (1994).</li><li>Jacobs, A. J., Swain, G. P., Snedeker, J. A., Pijak, D. S., Gladstone, L. J., Selzer, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recovery+of+neurofilament+expression+selectively+in+regenerating+reticulospinal+neurons.">Recovery of neurofilament expression selectively in regenerating reticulospinal neurons.</a> J Neurosci. 17, 5206-5220 (1997).</li><li>Shifman, M. I., Selzer, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+the+netrin+receptor+UNC-5+in+lamprey+brain+modulation+by+spinal+cord+transection.">Expression of the netrin receptor UNC-5 in lamprey brain modulation by spinal cord transection.</a> Neurorehabil Neural Repair. 14, 49-58 (2000).</li><li>Barreiro-Iglesias, A., Laramore, C., Shifman, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+sea+lamprey+UNC5+receptors+cDNA+cloning,+phylogenetic+analysis+and+expression+in+reticulospinal+neurons+at+larval+and+adult+stages+of+development.">The sea lamprey UNC5 receptors cDNA cloning, phylogenetic analysis and expression in reticulospinal neurons at larval and adult stages of development.</a> J Comp Neurol. 520, 4141-4156 (2012).</li><li>Shifman, M. I., Yumu, l. R. E., Laramore, C., Selzer, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+the+repulsive+guidance+molecule+RGM+and+its+receptor+neogenin+after+spinal+cord+injury+in+sea+lamprey.">Expression of the repulsive guidance molecule RGM and its receptor neogenin after spinal cord injury in sea lamprey.</a> Exp Neurol. 217, 242-251 (2009).</li><li>Busch, D. J., Morgan, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synuclein+accumulation+is+associated+with+cell-specific+neuronal+death+after+spinal+cord+injury.">Synuclein accumulation is associated with cell-specific neuronal death after spinal cord injury.</a> J Comp Neurol. 520, 1751-1771 (2012).</li><li>Shifman, M. I., Zhang, G., Selzer, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delayed+death+of+identified+reticulospinal+neurons+after+spinal+cord+injury+in+lampreys.">Delayed death of identified reticulospinal neurons after spinal cord injury in lampreys.</a> J Comp Neurol. 510, 269-282 (2008).</li><li>Swain, G. P., Jacobs, A. J., Frei, E., Selzer, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+in+situ+hybridization+in+wholemounted+lamprey+brain+neurofilament+expression+in+larvae+and+adults.">A method for in situ hybridization in wholemounted lamprey brain neurofilament expression in larvae and adults.</a> Exp. Neurol. 126, 256-269 (1994).</li><li>Bullock, T. H., Moore, J. K., Fields, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+myelin+sheaths:+both+lamprey+and+hagfish+lack+myelin.">Evolution of myelin sheaths: both lamprey and hagfish lack myelin.</a> Neurosci Lett. 48, 145-148 (1984).</li><li>Cohen, A. H., Kiemel, T., Pate, V., Blinder, J., Guan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temperature+can+alter+the+function+outcome+of+spinal+cord+regeneration+in+larval+lampreys.">Temperature can alter the function outcome of spinal cord regeneration in larval lampreys.</a> Neuroscience. 90, 957-965 (1999).</li></ol>

Aqui apresentamos um protocolo detalhado para executar uma transecção medular completa e dissecção cerebral posterior em lampreias marinhas larvais. Este procedimento permite que as diferenças de análise da expressão gênica entre medula espinhal identificável salientes neurônios após a lesão medular por meio de um cérebro inteiro de montagem de hibridização in situ. O passo crítico no processo é o correcto desempenho de uma completa transecção da medula espinal, o que pode ser controlado através da o...

Nos mamíferos lesão medular (LM) é uma condição devastadora que leva à perda permanente da função abaixo do local da lesão, porque os axônios lesionados não se regeneram através da zona de trauma e se reconectar com suas metas adequadas. Em contraste com os mamíferos, lampreia recuperar locomoção após uma lesão completa da medula espinal. Uma forma interessante, a lampreia tem um conjunto de 36 projectando neurónios da medula espinal que são identificáveis ​​individualmente em conjunto de montagem em preparações de cérebro devido ao seu grande tamanho 2,3 (Figura 1) . Todos esses neurônios espinhais de projeção são axotomizados por um alto nível de transecção completa da medula espinhal. Estudos anteriores de nosso grupo e outros mostraram que, mesmo na presença de recuperação funcional após SCI alguns destes neurónios mostram uma muito baixa capacidade de regeneração (que são considerados &quot;maus regeneradores&quot;), enquanto outros geralmente regenerar seu axónio através do local da lesão (que são consideradas de &quot;gregeneradores ood &quot;). 2,3 Esta característica faz com que as lampreias um modelo vertebrado interessante estudar as diferenças na expressão gênica entre o bem eo mal regenerador neurônios espinhais-projetando que por sua vez levará para as diferenças na capacidade de regeneração intrínseca dos neurônios que tentar regenerar seus axônios no mesmo ambiente extrínseca. 1 Usando esse modelo, já haviam demonstrado que a medula de projeção neurônios com baixa capacidade regenerativa show de expressão de receptores de moléculas orientação axonal como UNC5 4,5 e neogenin 6, que medeiam a ação inibitória da netrin e RGM respectivamente. Além disso, utilizando este método nosso grupo também mostrou que apenas as boas regeneradores mostram uma recuperação da expressão de neurofilamentos após o ferimento e durante o processo de regeneração. Recentemente, Busch e Morgan 7 por imunofluorescência demonstraram que os regeneradores maus mostrará um increased expressão de sinucleína após a lesão, o que tem sido relacionado pelos autores para o fato de que o &quot;mau regenerador&quot; neurônios espinhais-projetando morrer lentamente após um completo medula espinhal transection 5,7,8. Assim, o modelo de lampreia de uma lesão completa da medula espinhal tem emergido como um modelo muito útil para entender o que faz um cordão espinhal neurônio projetando um &quot;mau regenerador&quot; após axotomia. Para realizar os estudos que estão executando um protocolo completo cirurgia espinal medula transecção e uma dissecção cerebral posterior nos pontos de tempo desejado após a lesão para realizar wholemount hibridação in situ. No presente artigo metodológico apresentamos um protocolo detalhado para o bom desempenho de uma medula cirurgia completa lesão da medula em lampreias larvais, a posterior manutenção dos animais ea dissecação cerebral final e preparação do cérebro para uma wholemount hibridização in situ. Um protocolo detalhado para perform o wholemount hibridização in situ no cérebro de lampreias larvais foi relatada anteriormente. 9 Além disso, o protocolo de lesão medular e dissecação do cérebro pode ser usado também para, em seguida, processar os cérebros para imuno-histoquímica ou outros métodos histológicos.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="280">
	<tbody>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:64px;">Name of the reagent</td>
			<td style="width:83px;">Company</td>
			<td style="width:64px;">Catalogue number</td>
			<td style="width:71px;">Comments (optional)</td>
		</tr>
		<tr height="148">
			<td height="148" style="height:148px;width:64px;">Tricaine methane sulfonate</td>
			<td style="width:83px;">Spectrum</td>
			<td style="width:64px;">TR108</td>
			<td style="width:71px;">Benzocaine saturated solution in PBS for sacrifice</td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:64px;">Scalpel #3</td>
			<td style="width:83px;">Fine Science Tools (FST)</td>
			<td style="width:64px;">10003-12</td>
			<td style="width:71px;"></td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:64px;">Blades for scalpel: #11</td>
			<td style="width:83px;">Fine Science Tools&#160;</td>
			<td style="width:64px;">10011-00</td>
			<td style="width:71px;"></td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:64px;">Castroviejo scissors #8</td>
			<td style="width:83px;">Fine Science Tools&#160;</td>
			<td style="width:64px;">15002-08</td>
			<td style="width:71px;"></td>
		</tr>
		<tr height="190">
			<td height="190" style="height:190px;width:64px;">Forceps #4 &#38; #5</td>
			<td style="width:83px;">Dumont, Switzerland</td>
			<td style="width:64px;">Roboz RS4955</td>
			<td style="width:71px;">#4 for dissection of Spinal cord; #5 for stripping menninges</td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:64px;">Dissecting Microscope</td>
			<td style="width:83px;">Olympus</td>
			<td style="width:64px;">SZ51</td>
			<td style="width:71px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="63" rowspan="2" style="height:63px;width:64px;">Sylgard</td>
			<td rowspan="2" style="width:83px;">Dow Corning Co.</td>
			<td rowspan="2" style="width:64px;">184</td>
			<td rowspan="2" style="width:71px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
		</tr>
		<tr height="168">
			<td height="189" rowspan="2" style="height:189px;width:64px;">Insect pins 0.15, 0.20 mm</td>
			<td rowspan="2" style="width:83px;">Austerlitz</td>
			<td rowspan="2" style="width:64px;">No catalogue #</td>
			<td rowspan="2" style="width:71px;">0.15 mm for pinning brain and spinal cord; 0.20 mm for the body</td>
		</tr>
		<tr height="21">
		</tr>
		<tr height="127">
			<td height="127" style="height:127px;width:64px;">7 ml HDPE Scintillation Tubes with Caps</td>
			<td style="width:83px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:64px;">03-337-1</td>
			<td style="width:71px;"></td>
		</tr>
		<tr height="106">
			<td height="106" style="height:106px;width:64px;">Paraformaldehyde 16%</td>
			<td style="width:83px;">Electron Microscopy Science (EMS)</td>
			<td style="width:64px;">19210</td>
			<td style="width:71px;">Dilute to 4% in PBS</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

complete spinal cord injury and brain dissection protocol for subsequent wholemount in situ hybridization in larval sea lamprey

Depois de uma lesão completa da medula espinhal, lampreias marinhas no primeiro estão paralisados ​​abaixo do nível da transecção. No entanto, eles se recuperam locomoção depois de várias semanas, e isso é acompanhado por regeneração curta distância (alguns mm) dos axônios propriospinal e axônios espinal-se projectam a partir do tronco cerebral. Entre os 36 grandes neurônios espinhais-projetando identificáveis, alguns são bons e outros são regeneradores maus regeneradores. Esses neurônios podem ser mais facilmente identificados em preparações wholemount SNC. A fim de compreender os mecanismos neuronais intrínsecos que favorecem ou inibem a regeneração do axônio após a lesão nos vertebrados do SNC, podemos determinar diferenças na expressão gênica entre os bons e maus regeneradores, e como expressão é influenciada pela medula transecção espinhal. Este artigo ilustra as técnicas para larval habitação e lampreias marinhas adultas recentemente transformados em tanques de água, produzindo completos transecções da medula espinhal sob visão microscópica, e preparando brain e wholemounts da medula espinhal para hibridização in situ. Resumidamente, os animais são mantidos em 16 &#160; ° C e anestesiados em 1% benzocaína na lampreia Ringer. A medula espinal é seccionado com tesoura iridectomia através de uma abordagem dorsal e o animal é deixado recuperar em tanques de água a 23 ° C. Para a hibridização in situ, os animais são reanesthetized e o cérebro e medula removido por meio de uma abordagem dorsal.

Como um exemplo dos resultados que podem ser obtidos quando se usa este método, as imagens representativas dos cérebros wholemounted que mostram a expressão dos transcritos neogenin em neurónios projectam-medulares identificáveis ​​de controlo e 2 semanas após a lesão a lampreia mar larvas são mostrados na Figura 2. Os leitores são referidos num estudo anterior 6 relatando a relação entre a expressão de neogenin após uma transecção medular completa ea capacidade de regenera...

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Complete Spinal Cord Injury and Brain Dissection Protocol for Subsequent Wholemount In Situ Hybridization in Larval Sea Lamprey

Spinal Cord Injury completo e Cérebro Dissection Protocolo para Wholemount Subsequente<em&gt; In Situ</em&gt; Hibridização em larval da lampreia de mar

As lampreias recuperar locomoção após uma lesão completa da medula espinhal. No entanto, alguns neurônios espinhais de projeção são bons regeneradores e outros não. Este artigo ilustra as técnicas para larvas de lampreia mar habitação (e adultos recém-transformados), produzindo completos transecções medulares e preparar cérebros wholemount e medulas espinhais de hibridização in situ.

After a complete spinal cord injury, sea lampreys at first are paralyzed below the level of transection. However, they recover locomotion after several ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Complete Spinal Cord Injury and Brain Dissection Protocol for Subsequent Wholemount In Situ Hybridization in Larval Sea Lamprey

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Dissecção e Cultura de Neurônios da Medula Espinhal comissural embrionárias

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Neurociência

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