Name: complete spinal cord injury and brain dissection protocol for subsequent wholemount in situ hybridization in larval sea lamprey
Uploaded: 2014-10-14T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Complete Spinal Cord Injury and Brain Dissection Protocol for Subsequent Wholemount In Situ Hybridization in Larval Sea Lamprey at JoVE.com

Supported by NIH Grants NS14837, R01 NS38537, R24 HD050838 to Dr. Michael E. Selzer; Shriners Research Grant SHC-85220 to Dr. Michael E Selzer; and Shriners Research Grant SHC-85310 to Dr. Michael I. Shifman. Dr. Ant&#243;n Barreiro-Iglesias was supported by the Fundaci&#243;n Barri&#233; (Spain) and the Xunta de Galicia (Galicia, Spain).

Ver Tabla 1 para todos los materiales utilizados en este protocolo. Los experimentos fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales Institucional de la Universidad de Temple. 1. Animales <ol><li> Obtener wildtype lampreas marinas larvales (Petromyzon marinus L.), 10 - 14 cm de largo (4-7 años) de los arroyos que alimentan el lago Michigan, a partir de afluentes del río Delaware (Pennsylvania) o arroyos en Maine. </li><l...

<ol>
	<li>Rodicio, M. C., Barreiro-Iglesias, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lampreys+as+an+animal+model+in+regeneration+studies+after+spinal+cord+injury.">Lampreys as an animal model in regeneration studies after spinal cord injury.</a> Rev Neurol. 55, 157-166 (2012).</li><li>Davis, G. R., McClellan, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extent+and+time+course+of+restoration+of+descending+brainstem+projections+in+spinalcord-transected+lamprey.">Extent and time course of restoration of descending brainstem projections in spinalcord-transected lamprey.</a> J Comp Neurol. 344, 65-82 (1994).</li><li>Jacobs, A. J., Swain, G. P., Snedeker, J. A., Pijak, D. S., Gladstone, L. J., Selzer, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recovery+of+neurofilament+expression+selectively+in+regenerating+reticulospinal+neurons.">Recovery of neurofilament expression selectively in regenerating reticulospinal neurons.</a> J Neurosci. 17, 5206-5220 (1997).</li><li>Shifman, M. I., Selzer, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+the+netrin+receptor+UNC-5+in+lamprey+brain+modulation+by+spinal+cord+transection.">Expression of the netrin receptor UNC-5 in lamprey brain modulation by spinal cord transection.</a> Neurorehabil Neural Repair. 14, 49-58 (2000).</li><li>Barreiro-Iglesias, A., Laramore, C., Shifman, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+sea+lamprey+UNC5+receptors+cDNA+cloning,+phylogenetic+analysis+and+expression+in+reticulospinal+neurons+at+larval+and+adult+stages+of+development.">The sea lamprey UNC5 receptors cDNA cloning, phylogenetic analysis and expression in reticulospinal neurons at larval and adult stages of development.</a> J Comp Neurol. 520, 4141-4156 (2012).</li><li>Shifman, M. I., Yumu, l. R. E., Laramore, C., Selzer, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+the+repulsive+guidance+molecule+RGM+and+its+receptor+neogenin+after+spinal+cord+injury+in+sea+lamprey.">Expression of the repulsive guidance molecule RGM and its receptor neogenin after spinal cord injury in sea lamprey.</a> Exp Neurol. 217, 242-251 (2009).</li><li>Busch, D. J., Morgan, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synuclein+accumulation+is+associated+with+cell-specific+neuronal+death+after+spinal+cord+injury.">Synuclein accumulation is associated with cell-specific neuronal death after spinal cord injury.</a> J Comp Neurol. 520, 1751-1771 (2012).</li><li>Shifman, M. I., Zhang, G., Selzer, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delayed+death+of+identified+reticulospinal+neurons+after+spinal+cord+injury+in+lampreys.">Delayed death of identified reticulospinal neurons after spinal cord injury in lampreys.</a> J Comp Neurol. 510, 269-282 (2008).</li><li>Swain, G. P., Jacobs, A. J., Frei, E., Selzer, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+in+situ+hybridization+in+wholemounted+lamprey+brain+neurofilament+expression+in+larvae+and+adults.">A method for in situ hybridization in wholemounted lamprey brain neurofilament expression in larvae and adults.</a> Exp. Neurol. 126, 256-269 (1994).</li><li>Bullock, T. H., Moore, J. K., Fields, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+myelin+sheaths:+both+lamprey+and+hagfish+lack+myelin.">Evolution of myelin sheaths: both lamprey and hagfish lack myelin.</a> Neurosci Lett. 48, 145-148 (1984).</li><li>Cohen, A. H., Kiemel, T., Pate, V., Blinder, J., Guan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temperature+can+alter+the+function+outcome+of+spinal+cord+regeneration+in+larval+lampreys.">Temperature can alter the function outcome of spinal cord regeneration in larval lampreys.</a> Neuroscience. 90, 957-965 (1999).</li></ol>

Aquí presentamos un protocolo detallado para realizar un corte transversal de la médula espinal completa y la disección del cerebro posterior en las lampreas marinas larvales. Este procedimiento permite analizar las diferencias en la expresión génica entre identificable de la médula espinal que se proyectan neuronas después de la lesión de la médula espinal por medio de un cerebro todo el montaje hibridación in situ. El paso crítico en el procedimiento es el correcto funcionamiento de una transección complet...

En los mamíferos lesión de la médula espinal (SCI) es una enfermedad devastadora que conduce a la pérdida permanente de la función por debajo del sitio de la lesión, porque los axones lesionados no se regeneran a través de la zona de trauma y se vuelven a conectar a sus objetivos adecuados. En contraste con los mamíferos, lampreas recuperar la locomoción después de una lesión completa de la médula espinal. 1 Curiosamente, lampreas tienen un conjunto de 36 neuronas de la médula espinal que se proyecta que son individualmente identificable en todo el montaje preparaciones cerebrales debido a su gran tamaño 2,3 (Figura 1) . Todas estas neuronas espinales están proyectando axotomizadas por transección de la médula espinal completa de alto nivel. Estudios anteriores de nuestro grupo y otros han demostrado que, incluso en la presencia de la recuperación funcional después de SCI algunas de estas neuronas muestran una capacidad regenerativa muy bajo (se consideran &quot;malos regeneradores&quot;), mientras que otros por lo general se regeneran su axón a través del sitio de la lesión (se consideran &quot;gregeneradores ood &quot;). 2,3 Esta característica hace que las lampreas un modelo vertebrado interesante estudiar las diferencias en la expresión génica entre el bien y el mal regenerador neuronas espinales que se proyecta que a su vez dará lugar a las diferencias en la capacidad regenerativa intrínseca de las neuronas que intentan regenerar sus axones en el mismo entorno extrínseca. 1 El uso de este modelo que hemos demostrado anteriormente que-espinal proyectando las neuronas con baja capacidad regenerativa muestran la expresión de los receptores de moléculas guía axonal como UNC5 4,5 y neogenin, 6 que median la acción inhibitoria de netrina y RGM respectivamente. Además, mediante el uso de este método nuestro grupo ha demostrado también que sólo las buenas regeneradores muestran una recuperación de la expresión de neurofilamentos después de la lesión y durante el proceso de regeneración. Recientemente, Busch y Morgan 7 han demostrado por inmunofluorescencia que los malos regeneradores muestran un increasexpresión ed de sinucleína después de la lesión, que se ha relacionado por los autores sobre el hecho de que las &quot;malas regenerador&quot; neuronas espinales proyectar mueren lentamente después de una médula espinal transección completa 5,7,8. Así, el modelo de la lamprea de una lesión completa de la médula espinal se ha convertido en un modelo muy útil para entender lo que hace que un cable de la proyección de las neuronas de la médula de un &quot;mal regenerador&quot; después de axotomía. Para llevar a cabo nuestros estudios estamos llevando a cabo un protocolo completo de la médula espinal y cirugía transección una disección del cerebro posterior en los momentos deseados después de la lesión para realizar wholemount hibridación in situ. En el presente artículo metodológico se presenta un protocolo detallado para el correcto cumplimiento de la cirugía de lesión medular completa en las lampreas de larvas, el mantenimiento posterior de los animales y la disección del cerebro final y preparación del cerebro para una wholemount hibridación in situ. Un protocolo detallado a performa la wholemount hibridación in situ en el cerebro de las lampreas de larvas ha sido informado previamente. 9 Además, este protocolo para la lesión de la médula espinal y la disección del cerebro puede también ser utilizado entonces para procesar los cerebros de inmunohistoquímica u otros métodos histológicos.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="280">
	<tbody>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:64px;">Name of the reagent</td>
			<td style="width:83px;">Company</td>
			<td style="width:64px;">Catalogue number</td>
			<td style="width:71px;">Comments (optional)</td>
		</tr>
		<tr height="148">
			<td height="148" style="height:148px;width:64px;">Tricaine methane sulfonate</td>
			<td style="width:83px;">Spectrum</td>
			<td style="width:64px;">TR108</td>
			<td style="width:71px;">Benzocaine saturated solution in PBS for sacrifice</td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:64px;">Scalpel #3</td>
			<td style="width:83px;">Fine Science Tools (FST)</td>
			<td style="width:64px;">10003-12</td>
			<td style="width:71px;"></td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:64px;">Blades for scalpel: #11</td>
			<td style="width:83px;">Fine Science Tools&#160;</td>
			<td style="width:64px;">10011-00</td>
			<td style="width:71px;"></td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:64px;">Castroviejo scissors #8</td>
			<td style="width:83px;">Fine Science Tools&#160;</td>
			<td style="width:64px;">15002-08</td>
			<td style="width:71px;"></td>
		</tr>
		<tr height="190">
			<td height="190" style="height:190px;width:64px;">Forceps #4 &#38; #5</td>
			<td style="width:83px;">Dumont, Switzerland</td>
			<td style="width:64px;">Roboz RS4955</td>
			<td style="width:71px;">#4 for dissection of Spinal cord; #5 for stripping menninges</td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:64px;">Dissecting Microscope</td>
			<td style="width:83px;">Olympus</td>
			<td style="width:64px;">SZ51</td>
			<td style="width:71px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="63" rowspan="2" style="height:63px;width:64px;">Sylgard</td>
			<td rowspan="2" style="width:83px;">Dow Corning Co.</td>
			<td rowspan="2" style="width:64px;">184</td>
			<td rowspan="2" style="width:71px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
		</tr>
		<tr height="168">
			<td height="189" rowspan="2" style="height:189px;width:64px;">Insect pins 0.15, 0.20 mm</td>
			<td rowspan="2" style="width:83px;">Austerlitz</td>
			<td rowspan="2" style="width:64px;">No catalogue #</td>
			<td rowspan="2" style="width:71px;">0.15 mm for pinning brain and spinal cord; 0.20 mm for the body</td>
		</tr>
		<tr height="21">
		</tr>
		<tr height="127">
			<td height="127" style="height:127px;width:64px;">7 ml HDPE Scintillation Tubes with Caps</td>
			<td style="width:83px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:64px;">03-337-1</td>
			<td style="width:71px;"></td>
		</tr>
		<tr height="106">
			<td height="106" style="height:106px;width:64px;">Paraformaldehyde 16%</td>
			<td style="width:83px;">Electron Microscopy Science (EMS)</td>
			<td style="width:64px;">19210</td>
			<td style="width:71px;">Dilute to 4% in PBS</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

complete spinal cord injury and brain dissection protocol for subsequent wholemount in situ hybridization in larval sea lamprey

Después de una lesión completa de la médula espinal, las lampreas de mar en primera están paralizados por debajo del nivel de corte transversal. Sin embargo, se recuperan locomoción después de varias semanas, y esto se acompaña de la regeneración corta distancia (unos pocos mm) de los axones propioespinal y axones-espinales que se proyecta desde el tronco cerebral. Entre los 36 grandes neuronas espinales proyectar identificables, algunos son buenos y otros son regeneradores malas regeneradores. Estas neuronas pueden ser más fáciles de identificar en las preparaciones del SNC wholemount. Con el fin de comprender los mecanismos de las neuronas intrínsecas que favorecen o inhiben la regeneración de axones después de la lesión del SNC en los vertebrados, determinamos diferencias en la expresión génica entre los regeneradores buenas y malas, y cómo la expresión es influenciada por transección de la médula espinal. Este documento ilustra las técnicas de larvas vivienda y recientemente transformado lampreas marinas adultas en depósitos de agua potable, la producción de transección medular completa bajo visión microscópica, y la preparación brain y wholemounts médula espinal para la hibridación in situ. En pocas palabras, los animales se mantienen a 16 &#160; ° C y anestesiado en el 1% de benzocaína en Ringer lamprea. La médula espinal se secciona con tijeras de iridectomía a través de un enfoque dorsal y se permite que el animal pueda recuperarse en depósitos de agua potable a 23 ° C. Para la hibridación in situ, los animales se reanesthetized y el cerebro y el cordón removidos a través de un enfoque dorsal.

Como ejemplo de los resultados que se pueden obtener cuando se utiliza este método, las imágenes representativas de cerebros wholemounted que muestran la expresión de las transcripciones neogenin en neuronas de la médula espinal identificables de proyección del control y 2 semanas después de la lesión de larvas lampreas de mar se muestran en la Figura 2. Los lectores pueden consultar a un estudio previo 6 informar de la relación entre la expresión de neogenin después de una transecc...

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Complete Spinal Cord Injury and Brain Dissection Protocol for Subsequent Wholemount In Situ Hybridization in Larval Sea Lamprey

Lesiones de la Médula Espinal completo y Protocolo Disección del cerebro por Wholemount posterior<em&gt; In Situ</em&gt; La hibridación en larvas lamprea de mar

Las lampreas recuperan locomoción después de una lesión completa de la médula espinal. Sin embargo, algunas neuronas espinales-proyectar regeneradores son buenos y otros no lo son. Este documento ilustra las técnicas de larvas de lamprea de mar vivienda (y adultos recientemente transformadas), la producción de transección completa de la médula espinal y la preparación de los cerebros y las médulas espinales wholemount para la hibridación in situ.

After a complete spinal cord injury, sea lampreys at first are paralyzed below the level of transection. However, they recover locomotion after several ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Complete Spinal Cord Injury and Brain Dissection Protocol for Subsequent Wholemount In Situ Hybridization in Larval Sea Lamprey

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La disección y la Cultura de las neuronas comisurales de médula espinal embrionaria

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