Name: complete spinal cord injury and brain dissection protocol for subsequent wholemount in situ hybridization in larval sea lamprey
Uploaded: 2014-10-14T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Complete Spinal Cord Injury and Brain Dissection Protocol for Subsequent Wholemount In Situ Hybridization in Larval Sea Lamprey at JoVE.com

Supported by NIH Grants NS14837, R01 NS38537, R24 HD050838 to Dr. Michael E. Selzer; Shriners Research Grant SHC-85220 to Dr. Michael E Selzer; and Shriners Research Grant SHC-85310 to Dr. Michael I. Shifman. Dr. Ant&#243;n Barreiro-Iglesias was supported by the Fundaci&#243;n Barri&#233; (Spain) and the Xunta de Galicia (Galicia, Spain).

Se tabell 1 för alla material som används i detta protokoll. Experiment godkändes av Institutional Animal Care och användning kommittén vid Temple University. 1. Djur <ol><li> Skaffa vildtyp larver havet nejonöga (Petromyzon marinus L.), 10-14 cm i längd (4-7 år) från bäckar utfodring Lake Michigan, från biflöden till Delawarefloden (Pennsylvania) eller strömmar i Maine. </li><li> I laboratoriet, underhålla larver i grupp...

<ol>
	<li>Rodicio, M. C., Barreiro-Iglesias, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lampreys+as+an+animal+model+in+regeneration+studies+after+spinal+cord+injury.">Lampreys as an animal model in regeneration studies after spinal cord injury.</a> Rev Neurol. 55, 157-166 (2012).</li><li>Davis, G. R., McClellan, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extent+and+time+course+of+restoration+of+descending+brainstem+projections+in+spinalcord-transected+lamprey.">Extent and time course of restoration of descending brainstem projections in spinalcord-transected lamprey.</a> J Comp Neurol. 344, 65-82 (1994).</li><li>Jacobs, A. J., Swain, G. P., Snedeker, J. A., Pijak, D. S., Gladstone, L. J., Selzer, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recovery+of+neurofilament+expression+selectively+in+regenerating+reticulospinal+neurons.">Recovery of neurofilament expression selectively in regenerating reticulospinal neurons.</a> J Neurosci. 17, 5206-5220 (1997).</li><li>Shifman, M. I., Selzer, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+the+netrin+receptor+UNC-5+in+lamprey+brain+modulation+by+spinal+cord+transection.">Expression of the netrin receptor UNC-5 in lamprey brain modulation by spinal cord transection.</a> Neurorehabil Neural Repair. 14, 49-58 (2000).</li><li>Barreiro-Iglesias, A., Laramore, C., Shifman, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+sea+lamprey+UNC5+receptors+cDNA+cloning,+phylogenetic+analysis+and+expression+in+reticulospinal+neurons+at+larval+and+adult+stages+of+development.">The sea lamprey UNC5 receptors cDNA cloning, phylogenetic analysis and expression in reticulospinal neurons at larval and adult stages of development.</a> J Comp Neurol. 520, 4141-4156 (2012).</li><li>Shifman, M. I., Yumu, l. R. E., Laramore, C., Selzer, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+the+repulsive+guidance+molecule+RGM+and+its+receptor+neogenin+after+spinal+cord+injury+in+sea+lamprey.">Expression of the repulsive guidance molecule RGM and its receptor neogenin after spinal cord injury in sea lamprey.</a> Exp Neurol. 217, 242-251 (2009).</li><li>Busch, D. J., Morgan, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synuclein+accumulation+is+associated+with+cell-specific+neuronal+death+after+spinal+cord+injury.">Synuclein accumulation is associated with cell-specific neuronal death after spinal cord injury.</a> J Comp Neurol. 520, 1751-1771 (2012).</li><li>Shifman, M. I., Zhang, G., Selzer, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delayed+death+of+identified+reticulospinal+neurons+after+spinal+cord+injury+in+lampreys.">Delayed death of identified reticulospinal neurons after spinal cord injury in lampreys.</a> J Comp Neurol. 510, 269-282 (2008).</li><li>Swain, G. P., Jacobs, A. J., Frei, E., Selzer, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+in+situ+hybridization+in+wholemounted+lamprey+brain+neurofilament+expression+in+larvae+and+adults.">A method for in situ hybridization in wholemounted lamprey brain neurofilament expression in larvae and adults.</a> Exp. Neurol. 126, 256-269 (1994).</li><li>Bullock, T. H., Moore, J. K., Fields, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+myelin+sheaths:+both+lamprey+and+hagfish+lack+myelin.">Evolution of myelin sheaths: both lamprey and hagfish lack myelin.</a> Neurosci Lett. 48, 145-148 (1984).</li><li>Cohen, A. H., Kiemel, T., Pate, V., Blinder, J., Guan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temperature+can+alter+the+function+outcome+of+spinal+cord+regeneration+in+larval+lampreys.">Temperature can alter the function outcome of spinal cord regeneration in larval lampreys.</a> Neuroscience. 90, 957-965 (1999).</li></ol>

Här presenterar vi ett detaljerat protokoll för att genomföra en fullständig ryggmärgstransektion och bakre hjärn dissektion i larv havet nejonöga. Detta förfarande gör det möjligt att analysera skillnader i genuttryck mellan identifierbara ryggmärg utskjutande nervceller efter ryggmärgsskada med hjälp av en hel-mount hjärnan in situ hybridisering. Det kritiska steget i förfarandet är rätt prestanda för en komplett ryggmärgstransektion, som kan styras genom att observera de skurna ändarna av ryggmär...

I däggdjur ryggmärgsskada (SCI) är ett förödande tillstånd som leder till permanent förlust av funktion nedanför skadeplatsen, eftersom skadade axoner inte regenerera igenom traumat zonen och återkoppla till sina lämpliga mål. Till skillnad från däggdjur, nejonöga återställa rörelseförmåga efter en fullständig ryggmärgsskada. 1 Intressant nejonöga har en uppsättning 36 ryggmärgen utskjutande nervceller som är individuellt identifierbar hela montering hjärnpreparat på grund av deras stora storlek 2,3 (figur 1) . Alla dessa spinal-utskjutande nervceller är axotomiserade genom en högnivå komplett ryggmärgen transektion. Tidigare studier i vår grupp och andra har visat att även i närvaro av funktionell återhämtning efter SCI vissa av dessa neuroner visar en mycket låg förnyelseförmåga (de anses &quot;dåliga regeneratorer&quot;), medan andra regenerera brukar deras axon genom webbplatsen för skada (de anses &quot;good regeneratorer &quot;). 2,3 Denna egenskap gör nejonöga en intressant ryggradsdjur modell för att studera skillnaderna i genuttryck mellan bra och dåliga regenerator- spinal utskjutande nervceller som i sin tur leder till skillnaderna i den inneboende regenerativ förmåga nervceller som försöker förnya sina axoner i samma yttre miljön. 1 Med hjälp av denna modell har vi tidigare visat att spinal utskjutande nervceller med låg regenerativ förmåga show uttryck för axonal vägledning molekyl receptorer som UNC5 4,5 och neogenin, 6 som förmedlar den hämmande verkan av netrin och RGM respektive. Dessutom, genom att använda denna metod vår grupp har också visat att endast de goda regeneratorerna visar en återhämtning av uttrycket av neurofilament efter skadan och under regenereringsprocessen. Nyligen, Busch och Morgan 7 har visat genom immunofluorescens att de dåliga regeneratorerna visar en increased uttryck för synuklein efter skada, som har samband med författarna på det faktum att de &quot;dåliga regenerator-&quot; spinal utskjutande nervceller långsamt dör efter en fullständig ryggmärgstransection 5,7,8. Så har nejonöga modell av en komplett ryggmärgsskada uppstått som en mycket användbar modell för att förstå vad som gör en ryggmärgs utskjutande neuron en &quot;dålig regenerator&quot; efter axotomy. För att genomföra våra studier vi utför en komplett ryggmärgstransection kirurgi protokoll och en bakre hjärn dissektion vid önskade tidpunkter efter skada för att utföra wholemount in situ hybridisering. I det aktuella metod artikeln presenterar vi ett detaljerat protokoll för att kunna utföra en komplett ryggmärgsskada kirurgi i larv nejonöga, den efterföljande underhåll av djuren och den slutliga hjärnan dissekering och förberedelse av hjärnan för ett wholemount in situ hybridisering. Ett detaljerat protokoll för att peR formwholemount in situ hybridisering i hjärnan hos larv nejonöga har tidigare rapporterats. 9 Dessutom detta protokoll för ryggmärgsskador och hjärn dissektion kan också användas för att därefter behandla hjärnan för immunohistokemi eller andra histologiska metoder.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="280">
	<tbody>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:64px;">Name of the reagent</td>
			<td style="width:83px;">Company</td>
			<td style="width:64px;">Catalogue number</td>
			<td style="width:71px;">Comments (optional)</td>
		</tr>
		<tr height="148">
			<td height="148" style="height:148px;width:64px;">Tricaine methane sulfonate</td>
			<td style="width:83px;">Spectrum</td>
			<td style="width:64px;">TR108</td>
			<td style="width:71px;">Benzocaine saturated solution in PBS for sacrifice</td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:64px;">Scalpel #3</td>
			<td style="width:83px;">Fine Science Tools (FST)</td>
			<td style="width:64px;">10003-12</td>
			<td style="width:71px;"></td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:64px;">Blades for scalpel: #11</td>
			<td style="width:83px;">Fine Science Tools&#160;</td>
			<td style="width:64px;">10011-00</td>
			<td style="width:71px;"></td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:64px;">Castroviejo scissors #8</td>
			<td style="width:83px;">Fine Science Tools&#160;</td>
			<td style="width:64px;">15002-08</td>
			<td style="width:71px;"></td>
		</tr>
		<tr height="190">
			<td height="190" style="height:190px;width:64px;">Forceps #4 &#38; #5</td>
			<td style="width:83px;">Dumont, Switzerland</td>
			<td style="width:64px;">Roboz RS4955</td>
			<td style="width:71px;">#4 for dissection of Spinal cord; #5 for stripping menninges</td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:64px;">Dissecting Microscope</td>
			<td style="width:83px;">Olympus</td>
			<td style="width:64px;">SZ51</td>
			<td style="width:71px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="63" rowspan="2" style="height:63px;width:64px;">Sylgard</td>
			<td rowspan="2" style="width:83px;">Dow Corning Co.</td>
			<td rowspan="2" style="width:64px;">184</td>
			<td rowspan="2" style="width:71px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
		</tr>
		<tr height="168">
			<td height="189" rowspan="2" style="height:189px;width:64px;">Insect pins 0.15, 0.20 mm</td>
			<td rowspan="2" style="width:83px;">Austerlitz</td>
			<td rowspan="2" style="width:64px;">No catalogue #</td>
			<td rowspan="2" style="width:71px;">0.15 mm for pinning brain and spinal cord; 0.20 mm for the body</td>
		</tr>
		<tr height="21">
		</tr>
		<tr height="127">
			<td height="127" style="height:127px;width:64px;">7 ml HDPE Scintillation Tubes with Caps</td>
			<td style="width:83px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:64px;">03-337-1</td>
			<td style="width:71px;"></td>
		</tr>
		<tr height="106">
			<td height="106" style="height:106px;width:64px;">Paraformaldehyde 16%</td>
			<td style="width:83px;">Electron Microscopy Science (EMS)</td>
			<td style="width:64px;">19210</td>
			<td style="width:71px;">Dilute to 4% in PBS</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

complete spinal cord injury and brain dissection protocol for subsequent wholemount in situ hybridization in larval sea lamprey

Efter en fullständig ryggmärgsskada, är havs nejonöga vid första paralyserad under nivån för transektion. Men de återhämta locomotion efter flera veckor, och detta åtföljs av kort avstånd regenerering (några mm) av propriospinal axoner och spinal utskjutande axoner från hjärnstammen. Bland de 36 stora identifierbara spinal utskjutande nervceller, vissa är bra regeneratorer och andra är dåliga regeneratorer. Dessa nervceller kan lättast identifieras i wholemount CNS preparat. För att förstå de neuron inneboende mekanismer som gynnar eller hämmar Axon förnyelse efter skada i ryggradsdjur CNS, vi bestämmer skillnader i genuttryck mellan de goda och dåliga regeneratorer, och hur uttrycket påverkas av ryggmärgstransektion. Denna uppsats belyser tekniker för bostäder larver och nyligen omvandlade vuxna nejonöga havet i färskvattentankar, producerar kompletta ryggmärgs transections enligt mikroskopisk syn och förbereda brain och ryggmärgs wholemounts för in situ hybridisering. I korthet är djur som hålls vid 16 &#160; ° C och sövdes i 1% Benzocaine i nejonöga Ringer. Ryggmärgen är transected med iridektomi sax via ett rygg strategi och djuret får återhämta sig i färskvattentankar vid 23 ° C. För in situ hybridisering, djuren reanesthetized och hjärnan och rep avlägsnas via en rygg strategi.

Som ett exempel på de resultat som kan erhållas vid användning av denna metod, representativa bilder av wholemounted hjärnor visar uttrycket av de neogenin transkript i identifierbara ryggmärgs-utskjutande neuroner i kontroll och två veckor efter lesion larvhavs nejonöga visas i figur 2. Läsarna hänvisas till en tidigare studie 6 rapporterar sambandet mellan uttrycket av neogenin efter en fullständig ryggmärgstransektion och regenerativ förmåga identifierbara ryggmärgen utskjuta...

Watch this Scientific Journal Video about Complete Spinal Cord Injury and Brain Dissection Protocol for Subsequent Wholemount In Situ Hybridization in Larval Sea Lamprey at JoVE.com

Complete Spinal Cord Injury and Brain Dissection Protocol for Subsequent Wholemount In Situ Hybridization in Larval Sea Lamprey

Komplett ryggmärgsskada och Brain Dissection protokoll för Efterföljande Wholemount<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisering i Larvernas havsnejonöga

Lampreys återvinna locomotion efter en fullständig ryggmärgsskada. Men vissa ryggrads utskjutande nervceller är bra regeneratorer och andra inte. Denna uppsats belyser tekniker för bostäder havsnejonöga larver (och nyligen omvandlade vuxna), som producerar kompletta ryggmärgs transections och förbereda wholemount hjärnor och ryggmärg för in situ hybridisering.

After a complete spinal cord injury, sea lampreys at first are paralyzed below the level of transection. However, they recover locomotion after several ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Complete Spinal Cord Injury and Brain Dissection Protocol for Subsequent Wholemount In Situ Hybridization in Larval Sea Lamprey

Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

Dissektion och kultur commissural neuroner från embryonala ryggmärg

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

Double Fluorescence in situ Hybridization in Fresh Brain Sections

Double Fluorescence in situ Hybridization in Fresh Brain Sections

Dubbel Fluorescens På plats Hybridisering i Fresh Brain § §

Here we describe a modified version of a double fluorescence in situ hybridization (dFISH) method optimized for detecting two mRNAs of interest in fresh ...

Lateral Fluid Percussion: Model of Traumatic Brain Injury in Mice

Lateral Fluid slagverk: Modell av traumatisk hjärnskada hos möss

Traumatic brain injury (TBI) research has attained renewed momentum due to the increasing awareness of head injuries, which result in morbidity and ...

Spinal Cord Transection in the Larval Zebrafish

Spinal Cord transection i Larvernas Zebrafish

Mammals fail in sensory and motor recovery following spinal cord injury due to lack of axonal regrowth below the level of injury as well as an inability ...

An Ex Vivo Laser-induced Spinal Cord Injury Model to Assess Mechanisms of Axonal Degeneration in Real-time

An Ex Vivo Laser-induced Spinal Cord Injury Model to Assess Mechanisms of Axonal Degeneration in Real-time

En<em&gt; Ex vivo</em&gt; Laser-inducerad ryggmärgsskada modell för bedömning Mekanismer axonal degeneration i realtid

Injured CNS axons fail to regenerate and often retract away from the injury site. Axons spared from the initial injury may later undergo secondary axonal ...

Zebrafish In Situ Spinal Cord Preparation for Electrophysiological Recordings from Spinal Sensory and Motor Neurons

Zebrafish In Situ Spinal Cord Preparation for Electrophysiological Recordings from Spinal Sensory and Motor Neurons

zebrafisk<em&gt; In Situ</em&gt; Spinal Cord Förberedelse för elektrofysiologiska inspelningar från Spinal sensoriska och motoriska nervceller

Zebrafish, first introduced as a developmental model, have gained popularity in many other fields. The ease of rearing large numbers of rapidly developing ...

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

Imaging Neural aktivitet i den primära somatosensoriska Cortex med Thy1-GCaMP6s transgena möss

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in ...

An In Vivo Duo-color Method for Imaging Vascular Dynamics Following Contusive Spinal Cord Injury

An In Vivo Duo-color Method for Imaging Vascular Dynamics Following Contusive Spinal Cord Injury

En In Vivo Duo-färg metod för Imaging vaskulär Dynamics efter Contusive ryggmärgsskada

Spinal cord injury (SCI) causes significant vascular disruption at the site of injury. Vascular pathology occurs immediately after SCI and continues ...

Intra-Arterial Delivery of Neural Stem Cells to the Rat and Mouse Brain: Application to Cerebral Ischemia

Intra-arteriell leverans av neurala stamceller till råtta och mus hjärnan: Ansökan till cerebral ischemi

Neural stem cell (NSC) therapy is an emerging innovative treatment for stroke, traumatic brain injury and neurodegenerative disorders. As compared to ...

Induction of Complete Transection-Type Spinal Cord Injury in Mice

Induktion av Komplett Transection-Typ ryggmärgsskada hos möss

Spinal cord injury (SCI) largely leads to irreversible and permanent loss of function, most commonly as a result of trauma. Several treatment options, ...