Name: complete spinal cord injury and brain dissection protocol for subsequent wholemount in situ hybridization in larval sea lamprey
Uploaded: 2014-10-14T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Complete Spinal Cord Injury and Brain Dissection Protocol for Subsequent Wholemount In Situ Hybridization in Larval Sea Lamprey at JoVE.com

Supported by NIH Grants NS14837, R01 NS38537, R24 HD050838 to Dr. Michael E. Selzer; Shriners Research Grant SHC-85220 to Dr. Michael E Selzer; and Shriners Research Grant SHC-85310 to Dr. Michael I. Shifman. Dr. Ant&#243;n Barreiro-Iglesias was supported by the Fundaci&#243;n Barri&#233; (Spain) and the Xunta de Galicia (Galicia, Spain).

Bu protokolde kullanılan tüm malzemeler için Tablo 1&#39;e bakınız. Deneyler Temple Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından kabul edildi. 1. Hayvanlar <ol><li> Yabanitip larva deniz lamprey balıklarının (Petromyzon marinus L.) elde, 10 - Maine Delaware Nehri (Pennsylvania) veya akışları yan kolları, Michigan Gölü besleyen derelerden - (7 yaşında 4) uzunluğu 14 cm. </li><li> 16 ° C&#39;de 5...

<ol>
	<li>Rodicio, M. C., Barreiro-Iglesias, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lampreys+as+an+animal+model+in+regeneration+studies+after+spinal+cord+injury.">Lampreys as an animal model in regeneration studies after spinal cord injury.</a> Rev Neurol. 55, 157-166 (2012).</li><li>Davis, G. R., McClellan, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extent+and+time+course+of+restoration+of+descending+brainstem+projections+in+spinalcord-transected+lamprey.">Extent and time course of restoration of descending brainstem projections in spinalcord-transected lamprey.</a> J Comp Neurol. 344, 65-82 (1994).</li><li>Jacobs, A. J., Swain, G. P., Snedeker, J. A., Pijak, D. S., Gladstone, L. J., Selzer, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recovery+of+neurofilament+expression+selectively+in+regenerating+reticulospinal+neurons.">Recovery of neurofilament expression selectively in regenerating reticulospinal neurons.</a> J Neurosci. 17, 5206-5220 (1997).</li><li>Shifman, M. I., Selzer, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+the+netrin+receptor+UNC-5+in+lamprey+brain+modulation+by+spinal+cord+transection.">Expression of the netrin receptor UNC-5 in lamprey brain modulation by spinal cord transection.</a> Neurorehabil Neural Repair. 14, 49-58 (2000).</li><li>Barreiro-Iglesias, A., Laramore, C., Shifman, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+sea+lamprey+UNC5+receptors+cDNA+cloning,+phylogenetic+analysis+and+expression+in+reticulospinal+neurons+at+larval+and+adult+stages+of+development.">The sea lamprey UNC5 receptors cDNA cloning, phylogenetic analysis and expression in reticulospinal neurons at larval and adult stages of development.</a> J Comp Neurol. 520, 4141-4156 (2012).</li><li>Shifman, M. I., Yumu, l. R. E., Laramore, C., Selzer, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+the+repulsive+guidance+molecule+RGM+and+its+receptor+neogenin+after+spinal+cord+injury+in+sea+lamprey.">Expression of the repulsive guidance molecule RGM and its receptor neogenin after spinal cord injury in sea lamprey.</a> Exp Neurol. 217, 242-251 (2009).</li><li>Busch, D. J., Morgan, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synuclein+accumulation+is+associated+with+cell-specific+neuronal+death+after+spinal+cord+injury.">Synuclein accumulation is associated with cell-specific neuronal death after spinal cord injury.</a> J Comp Neurol. 520, 1751-1771 (2012).</li><li>Shifman, M. I., Zhang, G., Selzer, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delayed+death+of+identified+reticulospinal+neurons+after+spinal+cord+injury+in+lampreys.">Delayed death of identified reticulospinal neurons after spinal cord injury in lampreys.</a> J Comp Neurol. 510, 269-282 (2008).</li><li>Swain, G. P., Jacobs, A. J., Frei, E., Selzer, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+in+situ+hybridization+in+wholemounted+lamprey+brain+neurofilament+expression+in+larvae+and+adults.">A method for in situ hybridization in wholemounted lamprey brain neurofilament expression in larvae and adults.</a> Exp. Neurol. 126, 256-269 (1994).</li><li>Bullock, T. H., Moore, J. K., Fields, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+myelin+sheaths:+both+lamprey+and+hagfish+lack+myelin.">Evolution of myelin sheaths: both lamprey and hagfish lack myelin.</a> Neurosci Lett. 48, 145-148 (1984).</li><li>Cohen, A. H., Kiemel, T., Pate, V., Blinder, J., Guan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temperature+can+alter+the+function+outcome+of+spinal+cord+regeneration+in+larval+lampreys.">Temperature can alter the function outcome of spinal cord regeneration in larval lampreys.</a> Neuroscience. 90, 957-965 (1999).</li></ol>

Burada larva deniz lamprey balıklarının tam bir omurilik kesiye ve arka beyin diseksiyon gerçekleştirmek için detaylı bir protokol mevcut. Bu prosedür in situ hibridizasyon bir bütün-montaj beyin vasıtasıyla omurilik yaralanması sonrası tanımlanabilir omurilik çıkıntı nöronlar arasında gen ifadesinde analiz farklılıkları sağlar. Prosedürdeki kritik aşama hafifçe bir çift larva burun dokunarak 24 saat sonra stereomicrocope altında omurilik kesilmiş uçlara gözlemleyerek kontrol edilebilir ...

Memelilerde spinal kord yaralanması (SKY) yaralandı aksonlar travma bölgesi üzerinden yeniden ve uygun hedefler yeniden çünkü yaralanma sitenin altındaki fonksiyonlarda kalıcı kaybına yol açan yıkıcı bir durumdur. Memelilerde aksine, lampreys tam omurilik hasarı sonrası lokomosyonu kurtarmak. 1 İlginçtir, lampreys çünkü onların büyük boy 2,3 (Şekil 1) beyin hazırlıklarını monte bütün 36 omurilik ayrı ayrı tanımlanabilir nöronların çıkıntı bir dizi var . Bu omurga verme nöronların tüm üst düzey bir tam omurilik transeksiyonu ile axotomized edilir. Grubumuzun ve diğerleri daha önceki çalışmalar, diğerleri genellikle yaralanma sitesi aracılığıyla akson yeniden ederken bile bu nöronların bazı çok düşük bir rejeneratif kapasitesini göstermek SKY sonrası fonksiyonel iyileşme varlığında, (onlar &quot;kötü rejenatörler&quot; olarak kabul edilir) olduğunu göstermiştir (onlar kabul edilir &quot;gOOD rejeneratörler &quot;). 2,3 Bu özellik Lamprey da girişimi nöronların içsel rejeneratif yeteneği farklılıklara yol açacaktır iyi ve kötü yenileyici spinal çıkıntı nöronlar arasındaki gen ifadesinde farklılıkları incelemek için ilginç bir omurgalı model yapar Aynı dış ortamda aksonlar rejenere. 1 Daha önce göstermiştir ki, bu modeli kullanarak, spinal-projelendirme sırasıyla netrin ve RGM inhibitör eylemi aracılık UNC5 4,5 ve neogenin, 6 gibi akson rehberlik molekül reseptörlerinin düşük rejeneratif yeteneği gösteri ifade ile nöronlar. Buna ek olarak, bu yöntem kullanılarak grup, aynı zamanda, sadece iyi bir rejeneratörler yaralanma sonrası ve yenilenme sürecinde nörofilament ekspresyonunun bir toparlanma göstermektedir göstermiştir. Son zamanlarda, Busch ve Morgan 7 kötü rejeneratörler bir arttırmaya göstermektedir ki, bağışıklık fluorışıması yoluyla göstermiştir&quot;kötü yenileyici&quot; spinal çıkıntı nöronlar yavaş yavaş tam bir omurilik kesisi 5,7,8 sonra ölmek gerçeğine yazarlar tarafından ilgili olmuştur yaralanma sonrası sinüklein ed ifade. Yani, tam bir omurilik yaralanmasının taşemen modeli omurilik çıkıntı nöron axotomy sonra &quot;kötü rejeneratörün&quot; kılan anlamak için çok kullanışlı bir model olarak ortaya çıkmıştır. In situ hibridizasyon Wholemount gerçekleştirmek için yaralanmadan sonra istenilen zaman noktalarında tam bir spinal kord kesisi ameliyat protokolü ve arka beyin diseksiyonu gerçekleştirirken bizim çalışmalar yapmak. Bu yöntem makalede larva Lamprey tam bir omurilik yaralanması cerrahi uygun performansı için detaylı bir protokol mevcut, hayvanların daha sonraki bakım ve in situ melezleme için bir wholemount nihai beyin diseksiyon ve beyin hazırlanması. Ayrıntılı bir protokol pelarva Lamprey beyninde in situ hibridizasyon wholemount rform daha önce rapor edilmiştir. 9 ek olarak, omurilik yaralanması, beyin diseksiyon Bu protokol, aynı zamanda daha sonra imünohistokimya ya da diğer yöntemler için histolojik beyinleri işlemek için kullanılabilir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="280">
	<tbody>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:64px;">Name of the reagent</td>
			<td style="width:83px;">Company</td>
			<td style="width:64px;">Catalogue number</td>
			<td style="width:71px;">Comments (optional)</td>
		</tr>
		<tr height="148">
			<td height="148" style="height:148px;width:64px;">Tricaine methane sulfonate</td>
			<td style="width:83px;">Spectrum</td>
			<td style="width:64px;">TR108</td>
			<td style="width:71px;">Benzocaine saturated solution in PBS for sacrifice</td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:64px;">Scalpel #3</td>
			<td style="width:83px;">Fine Science Tools (FST)</td>
			<td style="width:64px;">10003-12</td>
			<td style="width:71px;"></td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:64px;">Blades for scalpel: #11</td>
			<td style="width:83px;">Fine Science Tools&#160;</td>
			<td style="width:64px;">10011-00</td>
			<td style="width:71px;"></td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:64px;">Castroviejo scissors #8</td>
			<td style="width:83px;">Fine Science Tools&#160;</td>
			<td style="width:64px;">15002-08</td>
			<td style="width:71px;"></td>
		</tr>
		<tr height="190">
			<td height="190" style="height:190px;width:64px;">Forceps #4 &#38; #5</td>
			<td style="width:83px;">Dumont, Switzerland</td>
			<td style="width:64px;">Roboz RS4955</td>
			<td style="width:71px;">#4 for dissection of Spinal cord; #5 for stripping menninges</td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:64px;">Dissecting Microscope</td>
			<td style="width:83px;">Olympus</td>
			<td style="width:64px;">SZ51</td>
			<td style="width:71px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="63" rowspan="2" style="height:63px;width:64px;">Sylgard</td>
			<td rowspan="2" style="width:83px;">Dow Corning Co.</td>
			<td rowspan="2" style="width:64px;">184</td>
			<td rowspan="2" style="width:71px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
		</tr>
		<tr height="168">
			<td height="189" rowspan="2" style="height:189px;width:64px;">Insect pins 0.15, 0.20 mm</td>
			<td rowspan="2" style="width:83px;">Austerlitz</td>
			<td rowspan="2" style="width:64px;">No catalogue #</td>
			<td rowspan="2" style="width:71px;">0.15 mm for pinning brain and spinal cord; 0.20 mm for the body</td>
		</tr>
		<tr height="21">
		</tr>
		<tr height="127">
			<td height="127" style="height:127px;width:64px;">7 ml HDPE Scintillation Tubes with Caps</td>
			<td style="width:83px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:64px;">03-337-1</td>
			<td style="width:71px;"></td>
		</tr>
		<tr height="106">
			<td height="106" style="height:106px;width:64px;">Paraformaldehyde 16%</td>
			<td style="width:83px;">Electron Microscopy Science (EMS)</td>
			<td style="width:64px;">19210</td>
			<td style="width:71px;">Dilute to 4% in PBS</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

complete spinal cord injury and brain dissection protocol for subsequent wholemount in situ hybridization in larval sea lamprey

Tam bir omurilik yaralanması sonrası, ilk deniz lampreys kesisi seviyesinin altında felç. Ancak, birkaç hafta sonra lokomosyonu kurtarmak ve bu propriyospinal akson ve beyin sapından spinal çıkıntı akson kısa mesafe rejenerasyon (birkaç mm) eşlik ediyor. 36 büyük tanımlanabilir spinal çıkıntı nöronlar arasında, bazı iyi rejeneratörler ve diğerleri kötü rejeneratörler vardır. Bu nöronlar en kolay Wholemount MSS hazırlıkları tespit edilebilir. Lehine nöron-iç mekanizmaları anlamak veya omurgalıların MSS yaralanmadan sonra akson rejenerasyonu inhibe etmek için, biz iyi ve kötü rejeneratörlerde arasında gen ifadesinde farklılıkları belirlemek ve nasıl ifade omurilik transection etkilenir. Bu kağıt mikroskopik görüş altında tam omurilik kesilerde üreten ve br hazırlama, tatlı su tankları konut larva teknikleri ve son zamanlarda dönüştürülmüş yetişkin deniz lamprey balıklarının göstermektedirain ve in situ melezleme için omurilik wholemounts. Kısacası, hayvanlar 16 tutulmaktadır &#160; C ° ve taşemen Ringer% 1 Benzokain anastezi. Omurilik bir dorsal yaklaşım ile iridektomi makas ile nakledilmiştir ve hayvan 23 ° C&#39;de tatlı su tanklarında kurtarmak için izin verilir. In situ hibridizasyon için, hayvanlar tekrar uyutuldu ve beyin ve kord dorsal yaklaşım ile kaldırıldı.

Bu yöntemi kullanarak elde edilebilir sonuçlarından bir örnek olarak, tanımlanabilir omurilik verme kontrolü, nöronlar ve 2 hafta içinde neogenin transkriptlerinin ekspresyonunu gösteren wholemounted beyinleri temsili görüntüleri lezyon larva deniz lampreys Şekil 2&#39;de gösterilmiştir sonrası. okuyucular tam omurilik transection ve tüm ayrıntılar için deniz lamprey nöronları çıkıntı tanımlanabilir omurilik rejeneratif yeteneği sonra neogenin ifade arasındaki ilişkiyi bild...

Watch this Scientific Journal Video about Complete Spinal Cord Injury and Brain Dissection Protocol for Subsequent Wholemount In Situ Hybridization in Larval Sea Lamprey at JoVE.com

Complete Spinal Cord Injury and Brain Dissection Protocol for Subsequent Wholemount In Situ Hybridization in Larval Sea Lamprey

Sonradan wholemount için komple Omurilik Yaralanmalı ve Beyin Diseksiyon Protokolü<em&gt; Yerinde</em&gt; Larva Deniz taşemen içinde Hibritleşme

Lamprey tam omurilik hasarı sonrası lokomosyonu kurtarmak. Ancak, bazı spinal çıkıntı nöronlar iyi rejeneratörler ve diğerleri değildir. Bu kağıt tam omurilik kesilerde üreten ve in situ hibridizasyon için Wholemount beyinleri ve omurilik hazırlama, konut deniz taşemen larvaları (ve son zamanlarda dönüştürülmüş yetişkinler) için teknikleri göstermektedir.

After a complete spinal cord injury, sea lampreys at first are paralyzed below the level of transection. However, they recover locomotion after several ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Complete Spinal Cord Injury and Brain Dissection Protocol for Subsequent Wholemount In Situ Hybridization in Larval Sea Lamprey

Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

Embriyonik Omurilik Commissural Nöronlar Diseksiyon ve Kültür

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

Double Fluorescence in situ Hybridization in Fresh Brain Sections

Double Fluorescence in situ Hybridization in Fresh Brain Sections

Çift Floresans In situ Taze Beyin Bölüm Hibridizasyon

Here we describe a modified version of a double fluorescence in situ hybridization (dFISH) method optimized for detecting two mRNAs of interest in fresh ...

Lateral Fluid Percussion: Model of Traumatic Brain Injury in Mice

Yanal Akışkan Perküsyon: Travmatik Beyin Hasarı Farelerde Modeli

Traumatic brain injury (TBI) research has attained renewed momentum due to the increasing awareness of head injuries, which result in morbidity and ...

Spinal Cord Transection in the Larval Zebrafish

Larva Zebra balığı Omurilik Kesisi

Mammals fail in sensory and motor recovery following spinal cord injury due to lack of axonal regrowth below the level of injury as well as an inability ...

An Ex Vivo Laser-induced Spinal Cord Injury Model to Assess Mechanisms of Axonal Degeneration in Real-time

An Ex Vivo Laser-induced Spinal Cord Injury Model to Assess Mechanisms of Axonal Degeneration in Real-time

Bir<em&gt; Ex vivo</em&gt; Lazer kaynaklı Omurilik Felçlileri Modeli Gerçek zamanlı aksonal Dejenerasyon mekanizmaları değerlendirmek için

Injured CNS axons fail to regenerate and often retract away from the injury site. Axons spared from the initial injury may later undergo secondary axonal ...

Zebrafish In Situ Spinal Cord Preparation for Electrophysiological Recordings from Spinal Sensory and Motor Neurons

Zebrafish In Situ Spinal Cord Preparation for Electrophysiological Recordings from Spinal Sensory and Motor Neurons

Zebra balığı<em&gt; Situ</em&gt; Omurilik Omurilik duyusal ve motor nöronlar gelen Elektrofizyolojik Recordings Hazırlık

Zebrafish, first introduced as a developmental model, have gained popularity in many other fields. The ease of rearing large numbers of rapidly developing ...

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

Sinirsel aktivite Thy1kullanarak birincil somatosensor kortekste Imaging-GCaMP6s transgenik fareler

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in ...

An In Vivo Duo-color Method for Imaging Vascular Dynamics Following Contusive Spinal Cord Injury

An In Vivo Duo-color Method for Imaging Vascular Dynamics Following Contusive Spinal Cord Injury

İçinde bir Vivo Vasküler Dynamics Contusive Medulla Spinalis Yaralanmalarında takip görüntüleme için duo-renk yöntemi

Spinal cord injury (SCI) causes significant vascular disruption at the site of injury. Vascular pathology occurs immediately after SCI and continues ...

Intra-Arterial Delivery of Neural Stem Cells to the Rat and Mouse Brain: Application to Cerebral Ischemia

Nöral Kök Hücrelerin Sıçan ve Fare Beynine İntra-Arteriyel Teslimatı: Serebral İskemiye Uygulama

Neural stem cell (NSC) therapy is an emerging innovative treatment for stroke, traumatic brain injury and neurodegenerative disorders. As compared to ...

Induction of Complete Transection-Type Spinal Cord Injury in Mice

Farelerde Tam Traneksiyon Tipi Spinal Kord Yaralanması İndüksiyonu

Spinal cord injury (SCI) largely leads to irreversible and permanent loss of function, most commonly as a result of trauma. Several treatment options, ...