Name: characterization of g protein-coupled receptors by a fluorescence-based calcium mobilization assay
Uploaded: 2014-07-28T14:00:00
Duration: 11 min 49 s
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Les auteurs remercient la Fondation de recherche Flandre (FWO-Vlaanderen, Belgique, G.0601.11) et la KU Leuven Research Foundation GOA/11/002. IB, TJ et LT bénéficier d&#39;une bourse de la FWO-Vlaanderen.

Remarque: Toutes les actions dans lesquelles les cellules sont impliquées doivent être effectuées dans un environnement stérile en travaillant dans un flux laminaire. 1. Maintien de la HEK293T Cell Line <ol><li> Cultiver les cellules HEK293T dans un flacon T-75 à 37 ° C dans un incubateur à CO2 humidifié à 5%. </li><li> Passage des cellules quand une confluence de 80% soit atteint. Note: Cela prend normalement 3 à 4 jours. Cellules en culture continue permettent 20-25 passages utilisables pour le criblage. <ol><li> Placer tampon phosphate salin de Dulbecco (PBS) sans chlorure de calcium et chlorure de magnésium, du PBS-trypsine-acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) (500 ml de PBS additionné de 10 ml de solution de trypsine-EDTA et 4,5 ml de 4% EDTA) et le milieu de croissance (500 ml le milieu de l&#39;Eagle modifié par Dulbecco - taux élevé de glucose [DMEM] supplémenté avec 10% de sérum bovin fœtal [FBS] et 1 mM de pénicilline-streptomycine [PS]) à la température ambiante une demi-heure d&#39;avance. </li><li> Supprimerl&#39;ancien milieu de culture à partir des cellules. Rincez les cellules mortes avec 3 ml de PBS et de supprimer à nouveau la PBS. </li><li> Ajouter 3 ml de PBS-trypsine-EDTA, incuber pendant 1 min à température ambiante et retirer la solution Note: La morphologie des cellules va changer de forme à sphère en forme d&#39;étoile. </li><li> Desserrer les cellules à partir du fond du flacon en tapotant doucement et collecter les cellules en rinçant les bas plusieurs fois avec 10 ml de milieu de croissance frais. </li><li> Transfert 1 ml de la culture de cellules dans un nouveau T-75 flacon contenant 14 ml de milieu de croissance frais, et incuber à 37 ° C dans un incubateur à CO 2 humidifiée à 5%. </li></ol></li></ol> 2. Transfection transitoire de cellules HEK293T <ol><li> Cultiver les cellules HEK293T dans un flacon T-75 3 jours avant l&#39;essai réel de la mobilisation du calcium a lieu. Assurez-vous d&#39;utiliser trois flacons T-75, un pour la transfection avec la construction du récepteur, un pour la transfection avec un vecteur vide d&#39;expression, de contrôle négatif, et one pour le contrôle de la transfection. Remarque: le repiquage des cellules est effectuée comme décrit à l&#39;étape 1.2. Lorsque plusieurs plaques à 96 puits doivent être examinés, flacons T-150 peuvent être utilisés pour obtenir un rendement plus élevé de cellules (pour ce faire, doubles, toutes quantités indiquées dans les étapes 1.2.5, 2.3, 3.1.3 et 3.1.4) . </li><li> Les flacons sont incubés à 37 ° C dans un incubateur à CO2 humidifié à 5% pendant 20 à 24 heures jusqu&#39;à ce que les cultures de cellules approchent de 50 à 70% de confluence. </li><li> Co-transfecter une population de cellules avec le vecteur d&#39;expression codant pour le GPCR d&#39;intérêt et la construction Ga 16, le deuxième flacon avec le vecteur vide, et le produit d&#39;assemblage 16 Ga, et le troisième avec le contrôle de la transfection et le produit d&#39;assemblage de Ga 16. Remarque: Dans ce protocole, le récepteur Drosophila PFNP a été cloné dans un vecteur d&#39;expression de mammifère pcDNA3.1 13. JetPRIME a été utilisé pour effectuer la transfection, mais d&#39;autres réactifs de transfection peuvent être utilisés aussi bien. <ol><li> Ajouter àotal de 7,8 pg d&#39;ADN (3,9 ug construction de récepteur ou le vecteur vide, et 3,9 ug Ga 16 construction d&#39;expression) à un tube de 1,5 ml à centrifuger et ajouter 500 ul du tampon jetPRIME. Mélangez bien au vortex le tube, et spin bas prochainement. </li><li> Ajouter 37,5 ul de réactif jetPRIME, vortex et centrifuger pendant 1 min à 14 000 x g. Faire incuber le mélange de transfection 10 min à température ambiante. </li><li> Ajouter goutte à goutte transfection de mélange pour le milieu de culture cellulaire et assurez-vous de la pipette directement dans le milieu en évitant le contact avec les parois du flacon de culture. Les flacons sont incubés à 37 ° C dans un incubateur à CO2 humidifié à 5% pendant 20 à 24 h. </li></ol></li></ol> 3. Calcium mobilisation Assay <ol><li> Recueillir les cellules transfectées et épépinez-les dans des plaques à fond transparent noir à paroi de 96 puits. <ol><li> Placer le PBS, PBS-trypsine-EDTA et le support de transfert du DMEM (500 ml de DMEM supplémenté avec 10% de FBS dialyseet 1% de PS) à la température ambiante une demi-heure d&#39;avance. </li><li> Manteau de la 96 puits noires parois, plaques de fond transparent avec 60 pi de PBS avec la fibronectine (0,0025%) par puits (5,85 ml de PBS et 150 pi fibronectine [0,1%] par plaque). Incuber les plaques à température ambiante pendant 1 heure avec le couvercle. Retirer la solution dans les puits et incuber les plaques pendant 1 heure à nouveau, sans le couvercle à la température ambiante. En variante, il est possible d&#39;utiliser des plaques pré-revêtues de renforcer la fixation des cellules. </li><li> Enlevez l&#39;ancien milieu de croissance des cellules et rincer les cellules mortes match avec 3 ml de PBS et supprimer le PBS. </li><li> Ajouter 3 ml de PBS-trypsine-EDTA, incuber pendant 1 min, puis retirer la solution. Remarque: La morphologie des cellules change d&#39;une forme en étoile en forme de sphère à. </li><li> Desserrer les cellules à partir du fond du flacon en tapotant doucement et collecter les rince plusieurs fois avec 10 ml de milieu DMEM de transfert. Transférer les cellules dans un tube Falcon de 50 ml. </li><li> Comptez lenombre de cellules par ml (réalisée avec un NucleoCounter ici, mais la chambre d&#39;un Burker est acceptable). Ajouter 100 ul de la culture de cellules dans un tube de centrifugation de 1,5 ml. Ajouter un tampon de lyse de 100 pi et mélanger en appuyant sur le tube. Ajouter 100 ul de tampon de stabilisation et mélanger en tapotant. </li><li> Remplir une NucleoCassette avec la suspension de cellules et compter les cellules avec le compteur. Multiplier le nombre de cellules par trois, comme les cellules ont été diluées par un facteur trois lors de l&#39;ajout du tampon de lyse et la stabilisation dans l&#39;étape 3.1.6. </li><li> Diluer les cellules à une concentration finale de 600 000 cellules / ml et ensemencer 150 ul de cellules par puits dans des plaques revêtues pour obtenir une densité cellulaire d&#39;environ 90 000 cellules par / puits. Éviter les bulles d&#39;air et appuyez sur la plaque d&#39;étaler les cellules uniformément afin d&#39;obtenir une couche de cellules contiguës. Incuber les plaques à 37 ° C dans un incubateur à CO2 humidifié à 5% pendant 16 à 24 h. </li></ol></li><li> Charger les cellules avec le colorant fluorescent et préparer la coplaque mpound. <ol><li> Préparer une solution saline équilibrée de Hank (HBSS) / HEPES / Ca 2 + / sérum albumine bovine (BSA) tampon: ajouter 165 ul de CaCl2 solution stock (1 M de CaCl2 dans de l&#39;eau distillée [dH 2 O] - magasin à la température ambiante), solution HEPES 500 ul du stock (1 M HEPES en DH 2 O, pH 7,4 - magasin à la température ambiante), et 0,05 g de BSA à 50 ml de HBSS. Notez que la BSA sans acide gras est utilisé pour les dosages du calcium, comme les acides gras peuvent activer des récepteurs spécifiques, altérant le signal de calcium du récepteur d&#39;intérêt. </li><li> Préparer la solution de probénécide (100x, 250 mM): dissoudre 0,71 g de probénécide en NaOH 5 ml (1 M) et ajouter 50 ul HEPES solution mère et 5 ml de la HEPES + tampon HBSS / / Ca 2 / BSA - toujours préparer une solution fraîche. Remarque: Le probénécide inhibe transporteurs d&#39;anions inorganiques qui peuvent déloger Fluo-4 à partir du cytoplasme, ce qui réduit le signal fluorescent. Il est recommandé d&#39;effectuer le chargement de colorant dansla présence et l&#39;absence de probénécide pour déterminer si transporteurs d&#39;anions inorganiques présentent un problème potentiel dans les lignées cellulaires particulières visées par l&#39;enquête, comme le probénécide peut même diminuer le signal d&#39;agoniste à médiation. </li><li> Préparer le tampon de lavage: ajouter 500 ul de solution de 50 ml probénécide HEPES + tampon HBSS / / Ca 2 / BSA, ajuster le pH à 7,4 et filtrer la solution tampon. Toujours préparer tampon frais, et 50 ml de tampon par plaque est nécessaire. </li><li> Préparer une solution d&#39;acide pluronic 10%: mélanger 50 pi acide pluronic (20% p / v dans le diméthylsulfoxyde [DMSO]) avec 50 ul de DMSO - si la cristallisation se produit, la chaleur à 37 ° C et toujours préparer une solution fraîche. </li><li> Préparer la solution Fluo-4 AM (1 mM): ajouter 44 ul solution d&#39;acide pluronic de 10% dans un flacon qui contient 50 ug Fluo-4 AM et vortex jusqu&#39;à ce qu&#39;il soit complètement dissous. Éviter l&#39;exposition à la lumière pour éviter le blanchiment du fluorophore. </li><li> Préparer le tampon de charge: ajouter 8,8 ml de DMEM Supplemented avec 10 mM de HEPES et 2,5 mM de probénécide (pH 7,4) à la solution de Fluo-4 AM (44 ul) et de vortex. Toujours utiliser un tampon frais. </li><li> Jeter milieu des cellules, laver les cellules avec 200 pi de PBS par puits, et enlever PBS. </li><li> Ajouter 55 pi de tampon de chargement par puits et incuber pendant 1 heure à température ambiante. Enveloppez la plaque dans une feuille d&#39;aluminium pour empêcher l&#39;exposition de la plaque à la lumière. </li><li> Assurez-vous de sécher les composés avant l&#39;écran si elles sont dissous dans des solvants qui sont préjudiciables (par exemple, l&#39;acétonitrile) pour le système d&#39;expression cellulaire. </li><li> Solubiliser les peptides dans du tampon de lavage dans des tubes de 1,5 ml à centrifuger siliconés. Préparer une série de dilutions pour effectuer une analyse de concentration-réponse et pour déterminer la valeur CE 50 d&#39;un ligand. Ajouter 70 ul de ligand dans le puits correspondant de la plaque de composé (plaques à 96 puits en forme de V) et que des contrôles positifs (agoniste endogène) et négatifs (tampon de lavage) sur chaque plaque. Pas<html> e: Si un composé n&#39;est pas soluble dans le tampon de lavage, on peut essayer d&#39;autres solvants qui ne sont pas nocifs pour les cellules visées par l&#39;enquête, tels que l&#39;eau ou des solutions qui émulsifient et solubilisent les huiles et autres substances insolubles dans l&#39;eau (par exemple, Kolliphor EL) . </li><li> Mesurer tous les échantillons en triple exemplaire. Garder à l&#39;esprit que 50 pi d&#39;un ligand à partir de la plaque de composé seront transférés dans un puits avec du tampon de lavage de 100 ul de la plaque de cellule au cours de l&#39;essai, de manière à préparer les composés 3 fois la concentration finale désirée. </li><li> Jeter le tampon de charge à partir de la plaque de cellule et ajouter un tampon de lavage de 100 ul dans chaque puits. Incuber la plaque 15 min à température ambiante et d&#39;éviter une exposition à la lumière. </li><li> Jeter le tampon de lavage à partir de la plaque de cellules et ajouter 100 nouveaux pl de tampon de lavage dans chaque puits. </li><li> Incuber la plaque de cellule, la plaque de composé, et un support de pointe (96 puits, embouts de pipette de l&#39;appareil de la station) pendant 15 min à 37 ° C. </li></ol></li></ol>titre &quot;. Assay&gt; 4 sur le périphérique de la station <ol><li> Créer et charger le fichier de protocole souhaité avec le logiciel et activer l&#39;unité de contrôle de la température pour la chambre de lecture. Ici, mesurer les réponses de calcium à 37 ° C pendant 2 min d&#39;une ligne à la fois avec 1,52 sec d&#39;intervalle entre les lectures successives (mesure d&#39;une plaque de 96 puits complète prend environ 25 min) à 525 nm. Réglez l&#39;excitation de Fluo-4 à 488 nm et transférer un volume total de 50 ul de composé à la plaque de cellule, 18 s après le début de la lecture, à la vitesse de distribution fixé à 26 pl / s et d&#39;une hauteur de pipette de 135 pi. </li><li> Placez le composé et la plaque de cellule, et le support de pointe dans les tiroirs appropriés de l&#39;appareil de la station. </li><li> Effectuer une seule lecture de la plaque de cellule à la même excitation et d&#39;émission de longueur d&#39;onde dans le mode ENDPOINT, avant de commencer l&#39;écran réel en mode FLEX. Remarque: Cette mesure donne unité de fluorescence relative (RFU) valeurs et permet de détecter la variabilité entre nouslls de la plaque. Les valeurs comprises entre 20 000 et 40 000 sont considérés comme acceptables. </li><li> Commencer le test et d&#39;analyser les données avec le logiciel. </li></ol>

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Les auteurs n&#39;ont rien à révéler.

L&#39;essai de mobilisation du calcium en fonction de la fluorescence a été appliquée avec succès pour confirmer la caractérisation fonctionnelle du système de signalisation de peptidergic PFNP Drosophila, qui a été déjà réalisé par Mertens et al. avec un dosage de bioluminescence et par Feng et al. avec un test 13,15 électrophysiologique. Les CE 50 valeurs obtenues avec le test de fluorescence dans les cellules HEK293T sont environ 10 fois inférieurs à ceux obtenus avec le dosage de bioluminescence effectué dans des cellules CHO (Drôme-PFNP-1: fluo = 2,04 nM, lumi = 51 nM; Drôme-PFNP- 2: fluo = 5,89 nM, lumi = 42 nM; Drôme-PFNP-3: fluo = 5,55 nM, lumi = 31 nM; Drôme-PFNP-4: fluo = 0,50 nM, lumi = 75 nM). Ces variations peuvent s&#39;expliquer par plusieurs facteurs, notamment le fait que l&#39;un des systèmes d&#39;expression utilisés peut être mieux adapté pour l&#39;expression fonctionnelle d&#39;un récepteur donné, ou le pliage de certains récepteurs peut être moins efficace en ctypes de cellules ertaines. Les valeurs de CE50 de l&#39;ensemble des quatre peptides Drome-PFNP sont dans la gamme nanomolaire lorsqu&#39;ils sont testés sur leur récepteur avec à la fois la fluorescence et l&#39;analyse par bioluminescence, supportant généralement la pertinence physiologique de l&#39;interaction peptide-récepteur in vivo. Notez que pas de contrôle de transfection avec un récepteur pour lequel le ligand activant est connu a été inclus dans l&#39;écran présenté ici, parce que le système de signalisation Drosophila PFNP est normalement le contrôle de transfection dans des configurations expérimentales. Le contrôle positif avec un ligand endogène des cellules HEK293T (PAR 1) et le témoin négatif (tampon de lavage) ont été inclus dans l&#39;écran. Les résultats de PAR 1 ont montré que les cellules étaient en bon état. Le contrôle négatif (tampon de lavage) n&#39;a pas suscité un signal fluorescent, qui indique que le milieu dans lequel les peptides sont dissous était libre de tout contaminant qui pourrait Influence les résultats. Le système de signalisation Drosophila PFNP caractérisé précédemment a été utilisé ici pour expliquer le dosage de mobilisation du calcium à base de fluorescence. A cet effet, des séries de concentration des ligands activateurs ont été testés immédiatement. Cependant, quand un récepteur orphelin est porté à une surexpression dans un essai de criblage pour tester d&#39;une bibliothèque contenant des centaines de composés, il est recommandé au premier écran avec des concentrations finales relativement élevées des ligands (par ex., 10 ou 1 um). À la suite de la détection d&#39;un composé d&#39;activation, une série de dilutions de composé qui peut être criblée afin de composer une courbe concentration-réponse et pour déterminer la valeur CE 50. Une fois que le ligand d&#39;un récepteur d&#39;activation est déterminée, la voie de signalisation intracellulaire peut être étudiée plus en adaptant le protocole. Le dosage peut être effectué comme décrit ci-dessus, mais sans co-transfection de la G ^5, 16 sous-unités. Lorsqu&#39;une réponse de calcium est mesurée, cela signifie que les couples récepteur avec une sous-unité Ga q endogène du système d&#39;expression cellulaire. Si aucun signal fluorescent est observée, les protocoles pour mesurer les changements dans les concentrations d&#39;autres messagers secondaires (p. ex., AMPc) peuvent être appliquées. Relation structure-activité (SAR) études peuvent également être réalisées afin de définir la séquence de base du peptide nécessaire pour l&#39;activation du récepteur. Premièrement, des séquences tronquées sont évalués pour définir la séquence d&#39;acides aminés du peptide minimal qui est encore capable d&#39;activer le récepteur. Ensuite, les peptides peuvent être testés dans lequel systématiquement chaque acide aminé a été remplacé par un résidu alanine. Test de série synthétique alanine-substitution sur le récepteur permet de déterminer l&#39;importance de chacun des acides aminés pour l&#39;activation du récepteur 24,25. Malgré son utilisation fréquente et efficacité prouvéescacité, il doit être souligné que l&#39;essai décrit ici peut avoir besoin de quelques adaptations pour obtenir des résultats optimaux pour les récepteurs spécifiques d&#39;intérêt. La sous-unité Ga 16 a l&#39;avantage qu&#39;il se lie à la plupart des GPCR, mais peut également avoir un effet dominant-négatif sur les récepteurs qui endogène par l&#39;intermédiaire de deux q Ga 22. Dans ce cas, il peut être utile de tester différentes combinaisons de protéines G au cours de l&#39;optimisation d&#39;un nouveau dosage de calcium et de comparer les résultats pour les récepteurs de Ga-q couplé en l&#39;absence ou en présence de Ga 16. Dosages alternatifs qui sont indépendantes de la protéine G interagissant pour détecter l&#39;activation du récepteur peuvent également être effectuées, par exemple la translocation de l&#39;arrestine GFP-étiqueté, ou la détection de changements dans le potentiel de membrane (par exemple,., Par le kit de dosage potentiel FLIPR membrane). Outre le Fluo-quatre heures utilisé ici, un large éventail d&#39;autres fluorophores sensibles au calcium, chacune avec sa propre spectrale et chemicpropriétés al, est disponible. Le fluorophore plus approprié peut être choisi sur la base du type de cellule GPCR et le lecteur de plaque disponible, mais une vérification expérimentale est nécessaire. Les quantités d&#39;ADN transfecté et l&#39;ADN / transfection volume réactif nécessaire de déterminer pour chaque combinaison de ligne-réactif de transfection-récepteur cellulaire. Enfin, il convient de garder à l&#39;esprit que les cellules en culture en continu permettent seulement de 20 à 25 passages utilisables pour effectuer les essais de criblage.

G récepteurs couplés aux protéines (RCPG) constituent l&#39;une des familles les plus importantes et les plus diversifiées entre toutes les protéines de surface cellulaire. Leur présence dans les vertébrés, les invertébrés, les plantes, la levure et moisissure visqueuse, ainsi que dans les protozoaires et les premiers métazoaires diploblastiques indique que les RCPG sont parmi les molécules les plus anciennes liées à la transduction du signal 1. Leurs ligands naturels d&#39;activation comprennent une large diversité de stimuli externes, y compris des peptides, des amines biogènes, des agents odorants, des glycoprotéines, et des photons 2. En tant que tels, ces systèmes de signalisation du récepteur-ligand sont impliquées dans un grand nombre de processus physiologiques. Le large spectre fonctionnel rend idéalement adapté pour le développement de médicaments thérapeutiques qui couvrent un large éventail de maladies humaines. Environ 50-60% des cibles de médicaments courants sont représentés par les RCPG 3,4. Outre leur grande importance dans l&#39;industrie pharmaceutique, les RCPG sont également à l&#39;honneur pour le développement d&#39;unnouvelle génération d&#39;insecticides spécifiques aux espèces 5,6 et pesticides en général. Parce que les ligands naturels de nombreux RCPG sont encore non identifié, ils sont classés comme RCPG orphelins. Le deorphanization de ces récepteurs permettra d&#39;améliorer la compréhension de leurs rôles physiologiques dans les organismes et peut découvrir des cibles potentielles pour de nouveaux médicaments 7. Depuis l&#39;ère de la génomique, la stratégie de la pharmacologie inverse est largement appliquée pour la deorphanization des RCPG 8. L&#39;approche implique qu&#39;un récepteur orphelin est utilisé comme un «crochet» à «poisson hors &#39;de son ligand activant à partir d&#39;un extrait biologique ou à partir d&#39;une bibliothèque de composés synthétiques. Le GPCR d&#39;intérêt est clone et donc ensuite transfecté dans un système d&#39;expression cellulaire. Dans les procédés les plus couramment utilisés, l&#39;activation du récepteur est déterminée par mesure des changements dans la concentration de molécules de deuxième messager 9 </sup&gt;. Les principaux tests de criblage de récepteur comptent sur ​​les protéines bioluminescentes sensibles au calcium (par exemple, l&#39;aequorine) 10 ou des indicateurs de calcium fluorescent (par exemple, Fluo-4) 11. Les analyses basées sur la fluorescence, dans laquelle les cellules exprimant le récepteur sont chargés avec un indicateur de calcium fluorescent avant le criblage de ligands, présentent l&#39;avantage qu&#39;elles permettent le criblage à haut débit en raison de leur facilité d&#39;utilisation, peu de temps de lecture, et la flexibilité de dépistage plusieurs récepteurs orphelins sur une seule plaque 12. Ici, le calcium dosage de mobilisation à base de fluorescence est bien décrite et illustrée par le processus de deorphanization de la Drosophila melanogaster court neuropeptide F (SNPF) récepteur. Ce système de signalisation de neuropeptidergiques a été initialement caractérisée par Mertens et al. en 2002 avec un 13 dosage par bioluminescence de calcium effectué dans ovaire de hamster chinois (CHO)14 et par Feng et al., En 2003 avec un test électrophysiologique utilisant ovocytes de Xenopus 15. La présence du système de signalisation PFNP semble se limiter à l&#39;embranchement des arthropodes de, où il est impliqué dans un large éventail de processus, y compris la réglementation de l&#39;alimentation, la croissance, les réactions de stress, la locomotion et les rythmes circadiens 16. La recherche sur les systèmes de signalisation neuropeptidergiques chez les insectes ne peut que conduire à de nouvelles cibles pour le développement des insecticides, mais la connaissance de leur fonctionnement peut aussi être extrapolée vers d&#39;autres organismes comme de nombreux systèmes de signalisation ont été généralement bien conservées tout au long de l&#39;évolution 17. Dans la dernière décennie, de grands progrès ont été accomplis dans le processus de deorphanization des RCPG de neuropeptides insectes. En dépit de ces efforts, seul un petit nombre de récepteurs ont été appariés à leur ligand apparenté, et de charges de l&#39;information de séquence pournouveaux RCPG orphelins est devenu disponible en raison de l&#39;essor de la génomique 18. La disponibilité du / des approches de criblage à haut débit, comme le moyen de mobilisation du calcium de l&#39;essai à base de fluorescence qui s&#39;est avérée être une technique largement appliqué 9,18, est donc indispensable. L&#39;essai de mobilisation du calcium en fonction de la fluorescence telle que décrite ici est réalisée dans le rein embryonnaire humain 293T (HEK293T) de la lignée cellulaire et utilise une sonde fluorescente pour déterminer les changements dans les concentrations intracellulaires de calcium lors de l&#39;activation du récepteur. Afin de garantir des niveaux de récepteur traduction est une expression élevée et, une séquence consensus de Kozak 19 est ajouté à l&#39;extrémité 5 &#39;de la séquence du récepteur de codage, qui est ensuite clone dans un vecteur d&#39;expression (par exemple pcDNA série de vecteur pour des lignées de cellules de mammifères). Comme il est difficile de prédire le couplage à la protéine G endogène d&#39;un GPCR orphelin à partir des informations séquenceseul, les molécules de second messagers (par exemple, de calcium ou AMPc) qui sont modulés après l&#39;activation du récepteur restent souvent inconnus avant l&#39;identification de ligands. Pour contourner ce problème, les protéines G de promiscuité de la famille q G (par exemple, murin Ga Ga 15 ou 16 humain [utilisé ici]) ou des protéines chimères G (par exemple, Ga qi5) qui interagissent avec la plupart des RCPG et induisent la libération de calcium peut être co-exprimés 20,21,22. Lors de la liaison du ligand à son récepteur, le GPCR subit un changement de conformation qui conduit à l&#39;activation des voies intracellulaires spécifiques. La molécule de guanosine diphosphate (GDP), lié dans des conditions de repos à la sous-unité Ga 16, sera remplacé par une guanosine triphosphate (GTP) de molécule. Ceci provoque la dissociation de la protéine G hétérotrimériques dans une Ga et 16 sous-unités Gßy. La sous-unité Ga 16 active la phospholipase C &amp;# 946; (PLCβ), qui à son tour hydrolyse le phosphatidylinositol bisphosphate liée à la membrane (PIP 2) résultant en diacylglycérol (DAG) et l&#39;inositol triphosphate (IP3). IP 3 se propage dans tout le cytoplasme et active les canaux calciques de PI 3-dépendants présents dans la membrane du reticulum endoplasmique, ce qui induit la libération de calcium dans le cytoplasme. La libération de calcium lors de l&#39;activation du récepteur a lieu en quelques secondes et peut être détecté par le chargement des cellules avant l&#39;essai de dépistage avec un colorant sensible au calcium, Fluo-4 comme acétoxyméthyle (AM) 11. Le groupe ester AM permet au fluorophore de traverser la membrane cellulaire et est clivé par des estérases cytoplasmiques une fois à l&#39;intérieur de la cellule. Par conséquent, les charges négatives du colorant fluorescent sont démasqués, l&#39;empêchant de se diffuser hors de la cellule et lui permettant d&#39;interagir avec les ions calcium. Le signal fluorescent of Fluo-4 est négligeable dans les cellules sous des conditions de repos ne contenant que des concentrations de calcium dans la plage nanomolaire. Toutefois, lorsque le calcium est libéré lors de l&#39;activation du récepteur, le signal peut augmenter la concentration-dépendante de plus d&#39;un facteur 100, en veillant à la présente un grand rapport signal-sur-bruit. Fluo-4 présente également une grande dynamique de rapports [calcium] autour d&#39;un K d (calcium) de 345 nM, ce qui convient pour mesurer les changements de calcium physiologiquement pertinents dans une large gamme de cellules. L&#39;excitation de Fluo-4 se produit à 488 nm et la fluorescence d&#39;émission est mesurée à 525 nm 11. Fluorimètres comme le lecteur de plaque d&#39;imagerie de fluorescence (FLIPR) 23, le NOVOSTAR, ou la FlexStation (dispositif de la station) 12 sont / systèmes à haut débit moyennes qui permettent plus de composé simultanée et la détection du signal Fluo-4 lors de l&#39;activation du récepteur pour chaque bien en une plaque d&#39;essai. L&#39;essai de mobilisation du calcium décrite ici repose sur la stationdispositif système de microplaques de 96 puits. Le logiciel SoftMax Pro (logiciel) est utilisé pour faire fonctionner le dispositif de station ainsi que pour l&#39;analyse des données. Le programme affiche immédiatement les résultats sous forme de graphiques au format 96 puits. Puits multiples peuvent être sélectionnés en même temps à comparer les résultats de ces puits sur le même graphique. L&#39;unité de fluorescence relative (RFU) valeurs de puits dans chaque colonne sont mesurées simultanément pendant une période de deux minutes, en commençant avant l&#39;addition de composés dans les puits et en continuant après la mesure du signal de fluorescence suite à l&#39;activation du récepteur. En général, la tendance d&#39;une courbe d&#39;agoniste s&#39;aligne avec la ligne de base jusqu&#39;à ce qu&#39;un composé d&#39;activation est ajouté aux cellules, ce qui entraîne une augmentation rapide du signal fluorescent. La hauteur du pic est en corrélation avec la concentration de l&#39;agoniste finale dans le puits. Après le pic, le signal fluorescent descend lentement vers le niveau de base. La mesure de RFU can convertir en courbes concentration-réponse pour déterminer la valeur CE50 (concentration efficace demi-maximale) d&#39;un ligand. En général, au moins trois écrans indépendants, chacun comprenant trois répliques d&#39;une série de concentrations, doivent être réalisées pour composer une courbe concentration-réponse fiable. Il est recommandé d&#39;inclure plusieurs témoins positifs et négatifs dans la conception expérimentale. Tout d&#39;abord, un contrôle de la transfection, à savoir la mise en oeuvre d&#39;un récepteur avec un ligand connu, doit être testé. Ceci permet de vérifier si l&#39;agent de transfection était opérationnel. L&#39;incorporation d&#39;une expérience témoin avec un agoniste pour un récepteur endogène de la lignée cellulaire et un témoin négatif (par exemple, un tampon de lavage) sont également recommandés pour surveiller la santé et de la viabilité des cellules et à exclure la possibilité que la mémoire tampon de lavage a été contaminé par un facteur qui pourrait provoquer une auto-fluoreréponse de parfum. Agonistes fréquemment utilisés sont un peptide dérivé de la protease-activated receptor-1 (PAR 1), qui agit comme un agoniste de PAR 1 sélectif, le carbachol ou, ce qui active le récepteur de l&#39;acétylcholine. Les cellules transfectées avec un vecteur d&#39;expression vide devraient également être testés pour exclure que les composés actifs interagissent avec les récepteurs endogènes de la cellule. Optimisation de plusieurs paramètres décrits dans le protocole ci-dessous peut être nécessaire pour des systèmes de signalisation différents. Une figure schématique de l&#39;essai complet calcium mobilisation basée sur la fluorescence est représenté dans la figure 1. <img alt="Figure 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51516/51516fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51516/51516fig1.jpg" /> Figure 1. Schéma d&#39;ensemble du calcium dosage de mobilisation à base de fluorescence. Automatisé de manipulation de liquide et de fluorescence simultanée mesures sont effectuées avec la stationlecteur de microplaques de l&#39;appareil, entraîné par le logiciel. Le dispositif de station contient trois tiroirs: un pour la plaque de cellule, plaque composé et pointe rack. Les composés d&#39;une colonne de la plaque de composé à la colonne correspondante de la plaque de cellule (étape 1) transfère des pipettes de build-in. Chaque puits de la plaque de cellule contient une monocouche de cellules HEK293T qui ont été co-transfectées avec le GPCR d&#39;intérêt et de la sous-unité 16 Ga promiscuous. Quand un composé active le récepteur, le PIB Ga 16 lié est remplacé par GTP. La sous-unité Ga 16 dissocie ensuite à partir du complexe Gßy et active la phospholipase Cß (PLCβ), qui à son tour hydrolyse le phosphatidylinositol bisphosphate (PIP2) en diacylglycérol résultant (DAG) et l&#39;inositol triphosphate (IP3). IP IP 3 active les canaux calciques dépendant trois présents dans la membrane du reticulum endoplasmique, l&#39;induction de la libération d&#39;int de calciumo le cytoplasme. L&#39;interaction de calcium avec du Fluo-4 (avec lequel les cellules sont chargées avant addition du composé) se traduit par un signal fluorescent (étape 2). Le logiciel présente les résultats sous forme de l&#39;unité de fluorescence relative (RFU) des valeurs en fonction du temps, et la hauteur des pics en corrélation avec la concentration de ligand d&#39;une manière dépendante de la concentration. Ces données peuvent ensuite être convertis en une courbe concentration-réponse pour déterminer la valeur CE 50 d&#39;une paire ligand-récepteur (étape 3).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="610">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">HEK293T cells</td>
			<td style="width:109px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td style="width:109px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D8537</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Trypsin-EDTA solution (0.25%)</td>
			<td style="width:109px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">T4049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:215px;">Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA)</td>
			<td style="width:109px;">MP Biomedicals</td>
			<td style="width:119px;">195173</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:215px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium - high glucose&#160; (DMEM)</td>
			<td style="width:109px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D5796</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td style="width:109px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">F7524</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Penicillin-Streptomycin (P-S)</td>
			<td style="width:109px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P4333</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;width:215px;">jetPRIME</td>
			<td style="width:109px;">Polyplus transfection</td>
			<td style="width:119px;">114-01</td>
			<td style="width:167px;">FuGENE HD Transfection Reagent (Promega); Lipofectamine LTX &#38; Plus Reagent (Life technologies)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Dialyzed Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td style="width:109px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">F0392</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Fibronectin from human plasma</td>
			<td style="width:109px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">F0895</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Reagent A100, Lysis buffer</td>
			<td style="width:109px;">Chemometec</td>
			<td style="width:119px;">910-0003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Reagent B, Stabilizing buffer</td>
			<td style="width:109px;">Chemometec</td>
			<td style="width:119px;">910-0002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:215px;">CaCl2</td>
			<td style="width:109px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">C3881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">HEPES</td>
			<td style="width:109px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>H4034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td style="width:109px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">HBSS buffer: Hank&#39;s Balanced Salt Solution</td>
			<td style="width:109px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>H8264</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Probenecid</td>
			<td style="width:109px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P8761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">NaOH (1 M)</td>
			<td>Vel</td>
			<td>2781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Pluronic acid</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P-3000MP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Dimethyl-sulfoxide (DMSO)</td>
			<td style="width:109px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D8418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:215px;">Fluo-4 AM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>F14201</td>
			<td style="width:167px;">Fluo-3, Rhod-2, Fluo-5, Calcium Green-1,.. (Invitorgen)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">TPP tissue culture flasks (T-75 and T-150)</td>
			<td style="width:109px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">Z707503 and Z707554</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:215px;">FlexStation device</td>
			<td style="width:109px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">NOVOstar (BMG Labtechnologies); FLIPR (Fluorometric Imaging Plate Reader) (Molecular Devices)</td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:215px;">Black-walled polystyrene plates (96 wells) with clear bottom</td>
			<td style="width:109px;">Greiner Bio-One</td>
			<td style="width:119px;">655090</td>
			<td style="width:167px;">Corning 96 well flat clear bottom black polystyrene poly-D-lysine coated microplates</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">NucleoCassette</td>
			<td style="width:109px;">Chemometec</td>
			<td style="width:119px;">941-0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">NucleoCounter NC-100</td>
			<td style="width:109px;">Chemometec</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Microcentrifuge tubes, siliconized</td>
			<td style="width:109px;">BioCision</td>
			<td style="width:119px;">BCS-2470</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Polystyrene V-shaped 96-well plates</td>
			<td style="width:109px;">Greiner Bio-One</td>
			<td>651101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">96-Well, FlexStation Pipet Tips</td>
			<td style="width:109px;">Molecular Devices</td>
			<td>9000-0912</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Soft Max Pro software</td>
			<td style="width:109px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

characterization of g protein-coupled receptors by a fluorescence-based calcium mobilization assay

Depuis plus de 20 ans, la pharmacologie inverse a été la stratégie par excellence pour découvrir les ligands activateurs des orphelins G récepteurs couplés aux protéines (RCPG). Le début d&#39;un essai de pharmacologie inverse est le clonage et la transfection ultérieure d&#39;un GPCR d&#39;intérêt dans un système d&#39;expression cellulaire. Le récepteur hétérologue exprimé est alors provoqué avec une bibliothèque de composés de ligands candidats pour identifier le ligand (s) récepteur d&#39;activation. L&#39;activation du récepteur peut être évaluée en mesurant les variations de concentration de deuxième messager molécules rapporteurs, tels que le calcium ou l&#39;AMPc. Le calcium dosage de mobilisation à base de fluorescence décrit ici est un débit moyen fréquemment utilisé inverse essai de pharmacologie. Le GPCR orphelin est exprimée de manière transitoire dans le rein embryonnaire humain 293T (HEK293T) des cellules et une promiscuité Ga 16 construction est co-transfecté. À la suite de la liaison du ligand, l&#39;activation de la sous-unité Ga 16 induit la libération de calcium felon le réticulum endoplasmique. Avant le dépistage de ligand, les cellules exprimant le récepteur sont chargés avec un indicateur de calcium fluorescent, Fluo-4 acétoxyméthyle. Le signal de fluorescence du Fluo-4 est négligeable dans des cellules dans des conditions de repos, mais peut être amplifié plus d&#39;un facteur 100 de l&#39;interaction avec les ions de calcium qui sont libérés après l&#39;activation du récepteur. La technique décrite ne nécessite pas la mise en place de temps de lignées cellulaires transfectées de manière stable dans lequel le matériau génétique transfecté est intégré dans le génome de la cellule hôte. Au lieu de cela, une transfection transitoire, la génération de l&#39;expression temporaire du gène cible, est suffisante pour effectuer l&#39;essai de criblage. L&#39;installation permet le criblage moyen débit de centaines de composés. La co-transfection de la promiscuité Ga 16, qui relie à la plupart des GPCR, permet la voie de signalisation intracellulaire pour être redirigé vers la libération de calcium, indépendamment de la voie de signalisation natif dans Param endogèneréunions. Les cellules HEK293T sont faciles à manipuler et ont prouvé leur efficacité au fil des ans dans des tests de récepteurs deorphanization. Cependant, l&#39;optimisation du dosage des récepteurs spécifiques peut rester nécessaire.

série de concentration allant de 50 uM à 0,001 nM ont été testés pour les quatre peptides Drosophila PFNP (Drôme-PFNP-1: AQRSPSLRLRFamide, Drome-PFNP-2: SPSLRLRFamide, Drome-PFNP-3: PQRLRWamide, Drome-PFNP-4: PMRLRWamide) sur les cellules qui expriment HEK293T transitoirement le récepteur Drosophila PFNP et la promiscuité Ga 16 sous-unité. Le GPCR a été activé par l&#39;ensemble des quatre peptides à des concentrations finales allant jusqu&#39;à 0,1 nM, et l&#39;activation du récepteur a été dépendante de la concentration. Figure 2 illustre les graphes correspondant à l&#39;un des trois répliques de la série de concentrations Drome-PFNP-1. Le contrôle négatif (tampon de lavage) n&#39;a pas induit un signal fluorescent, tandis que le contrôle positif (PAR 1 - 1 uM) a suscité une forte activation de la protéase-activated receptor-1, conduisant à un signal fluorescent élevé (± 30 000 RFU) endogène. Il convient de noter qu&#39;un écart dela courbe caractéristique peut indiquer des anomalies. Par exemple, une augmentation continue de la courbe sans revenir à la ligne de base pourrait être liée à des signaux non médiés par les récepteurs, tels que la présence d&#39;ionophores calciques, ou une bicouche lipidique perturbé provoquant des fuites de calcium. Le logiciel permet d&#39;entrer des formules pour déterminer le pourcentage d&#39;activation ou les erreurs types des concentrations différentes, entre autres. Les données obtenues sont utilisées pour composer courbes concentration-réponse préliminaires pour estimer les valeurs de la CE 50, comme indiqué pour les quatre peptides Drôme-PFNP dans la figure 3. Les courbes de la figure 3 comprennent également les données pour le contrôle négatif où la série de concentrations de les peptides Drôme-PFNP ont été testés sur des cellules HEK293T transfectées avec un vecteur pcDNA3.1 vide. Les résultats indiquent que l&#39;addition des peptides de ces cellules n&#39;ont pas d&#39;effet sur les récepteurs endogènes, mais en effet activmangé le récepteur d&#39;intérêt. Le calcium dosage de mobilisation à base de fluorescence a ensuite été répété trois fois de façon indépendante. Sur la base des courbes de concentration-réponse préliminaire de l&#39;écran initial, les concentrations testées ont été adaptés pour couvrir la plage dynamique de la courbe (figure 4). Les valeurs de CE50 de la Drôme-PFNP-1 (2,04 ± 1,48 nM [Intervalle de confiance à 95%]), Drôme-PFNP-2 (5,89 ± 3,74 nM), Drôme-PFNP-3 (5,55 ± 3,95 nM) et de la Drôme-PFNP- 4 (0,50 ± 1,01 nM) sont similaires, ce qui indique qu&#39;ils sont tout aussi puissant pour activer le récepteur. <img alt="Figure 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51516/51516fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51516/51516fig2.jpg" /> Figure 2. Graphique sortie du logiciel pour une réponse d&#39;une série de concentration. Douze concentrations finales (allant de 50 uM à 0,001 nM) o fluorescence médiée par le récepteurf la Drôme-PFNP-1 peptide ont été testés sur le récepteur Drôme-PFNP. L&#39;activation est exprimé en unité de fluorescence relative (RFU) de valeurs. Le graphique supérieur donne les résultats des six concentrations les plus élevées et le graphique inférieur de six concentrations les plus faibles. Le contrôle positif (+) est PAR 1 (1 M) et le contrôle négatif (-) est un tampon de lavage. <img alt="Figure 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51516/51516fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51516/51516fig3.jpg" /> Figure 3. Des courbes concentration-réponse préliminaires de peptides Drosophila PFNP déterminées par un seul calcium dosage de mobilisation à base de fluorescence. Les courbes du récepteur Drosophila PFNP exprimé de manière transitoire dans les cellules HEK293T pour les quatre peptides Drosophila PFNP concentration-réponse sont représentées en bleu. Pour les contrôles négatifs (en rouge), les peptides ont été testés sur HEK293Tcellules transfectées avec un vecteur pcDNA3.1 vide. Les réponses sont présentées comme fluorescentes relative (%) à la valeur la plus élevée (100% d&#39;activation). Les courbes sont le résultat d&#39;une expérience dans laquelle chaque série de concentration a été mesurée en triple. Les barres verticales représentent les erreurs standard de la moyenne (SEM), qui sont parfois plus petites que les symboles utilisés (dans ce cas, seuls les symboles sont représentés). <img alt="Figure 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51516/51516fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51516/51516fig4.jpg" /> Figure courbes concentration-réponse 4. Et CE 50 des peptides Drosophila PFNP déterminées par trois essais de mobilisation de calcium à base de fluorescence indépendants correspondant. Les courbes de réponse à la concentration du récepteur Drosopihla PFNP exprimés transitoirement dans des cellules HEK293T pour les quatre peptides Drosophila PFNP sont le résultat de trois moi indépendantasurements chacune effectuée en triple exemplaire (n ≥ 9). Les réponses sont présentées comme fluorescentes relative (%) à la valeur la plus élevée (100% d&#39;activation). Les astérisques indiquent les concentrations pour lesquelles barres d&#39;erreur n ≤ 9. Indiquent SEM, qui sont parfois plus petites que les symboles utilisés (dans ce cas, seuls les symboles sont représentés). CE 50 valeurs sont présentés avec leurs intervalles de confiance à 95%.

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Characterization of G Protein-coupled Receptors by a Fluorescence-based Calcium Mobilization Assay

L&#39;essai de mobilisation du calcium par fluorescence ici décrit est un système de criblage inverse pharmacologie à débit moyen pour l&#39;identification de ligand (s) d&#39;activation fonctionnellement G orphelins de récepteurs couplés aux protéines (RCPG).

Caractérisation des récepteurs de protéines G couplées par une mobilisation de calcium dosage à base de fluorescence

For more than 20 years, reverse pharmacology has been the preeminent strategy to discover the activating ligands of orphan G protein-coupled receptors ...

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