Name: characterization of g protein-coupled receptors by a fluorescence-based calcium mobilization assay
Uploaded: 2014-07-28T14:00:00
Duration: 11 min 49 s
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लेखकों रिसर्च फाउंडेशन फ़्लैंडर्स (FWO-Vlaanderen, बेल्जियम, G.0601.11) और यू लोवेन रिसर्च फाउंडेशन GOA/11/002 को स्वीकार करते हैं. FWO-Vlaanderen से एक फैलोशिप से आईबी, टी जे और लेफ्टिनेंट लाभ.

<ol>
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लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

प्रतिदीप्ति आधारित कैल्शियम जुटाना परख सफलतापूर्वक पहले से ही Mertens एट अल द्वारा किया गया था जो ड्रोसोफिला sNPF पेप्टिडर्जिक सिगनल प्रणाली के कार्यात्मक विशेषता पुष्टि करने के लिए लागू किया गया था. एक bioluminescence परख के साथ और फेंग एट अल द्वारा. एक electrophysiological परख 13,15 साथ. Drome-sNPF-; Fluo = 2.04 एनएम, LUMI = 51 एनएम: HEK293T कोशिकाओं में प्रतिदीप्ति परख के साथ प्राप्त की चुनाव आयोग 50 मूल्यों के बारे में चो कोशिकाओं (Drome-sNPF -1 में प्रदर्शन bioluminescence परख के साथ प्राप्त की तुलना में कम से कम 10 गुना कर रहे हैं 2: Fluo = 5.89 एनएम, LUMI = 42 एनएम; Drome-sNPF-3: Fluo = 5.55 एनएम, LUMI = 31 एनएम; Drome-sNPF-4: Fluo = 0.50 एनएम, LUMI = 75 एनएम). इन बदलावों का इस्तेमाल किया अभिव्यक्ति प्रणालियों में से एक एक दिया रिसेप्टर के कार्यात्मक अभिव्यक्ति के लिए बेहतर अनुकूल हो सकता है, या कुछ रिसेप्टर्स की तह सी में कम कुशल हो सकता है कि तथ्य यह सहित कई कारकों से समझाया जा सकता हैertain प्रकार की कोशिकाओं. आम तौर पर इन विवो में उनके पेप्टाइड रिसेप्टर बातचीत की शारीरिक प्रासंगिकता समर्थन, प्रतिदीप्ति और bioluminescence परख दोनों के साथ उनके रिसेप्टर पर परीक्षण किया जब सभी चार Drome-sNPF पेप्टाइड्स के चुनाव आयोग 50 मूल्यों nanomolar रेंज में हैं. ड्रोसोफिला sNPF सिगनल प्रणाली सामान्य रूप से प्रयोगात्मक setups में अभिकर्मक नियंत्रण है क्योंकि सक्रिय करने ligand में जाना जाता है, जिसके लिए एक रिसेप्टर के साथ कोई अभिकर्मक नियंत्रण, यहाँ प्रस्तुत स्क्रीन में शामिल किया गया था कि ध्यान दें. HEK293T कोशिकाओं (PAR 1) और नकारात्मक नियंत्रण (धोने बफर) के एक अंतर्जात ligand के साथ सकारात्मक नियंत्रण स्क्रीन में शामिल थे. PAR 1 के परिणामों कोशिकाओं को एक अच्छी हालत में थे कि पता चला है. नकारात्मक नियंत्रण (बफर धोने) पेप्टाइड्स भंग कर रहे हैं, जिसमें मध्यम inf सकता है कि किसी भी contaminants से मुक्त किया गया है कि जो इंगित करता है, एक फ्लोरोसेंट संकेत नहीं बटोरपरिणाम luence. पहले से विशेषता ड्रोसोफिला sNPF सिगनल प्रणाली प्रतिदीप्ति आधारित कैल्शियम जुटाना परख की व्याख्या करने के लिए यहां इस्तेमाल किया गया था. इस प्रयोजन के लिए सक्रिय करने ligands की एकाग्रता श्रृंखला तुरंत परीक्षण किया गया. एक अनाथ रिसेप्टर यौगिकों के सैकड़ों युक्त एक पुस्तकालय का परीक्षण करने के लिए एक स्क्रीनिंग परख में overexpression लिए लाया जाता है हालांकि, जब यह ligands (जैसे., 10 या 1 माइक्रोन) के अपेक्षाकृत उच्च अंतिम सांद्रता के साथ पहली बार परदे की सिफारिश की है. एक सक्रिय यौगिक का पता लगाने के बाद, कि परिसर के एक कमजोर पड़ने श्रृंखला एक एकाग्रता प्रतिक्रिया वक्र रचना करने और चुनाव आयोग 50 मूल्य निर्धारित करने के लिए जांच की जा सकती है. एक रिसेप्टर की सक्रिय करने ligand निर्धारित किया जाता है एक बार, intracellular संकेतन मार्ग आगे प्रोटोकॉल आदत डाल द्वारा जांच की जा सकती है. परख ऊपर वर्णित के रूप में प्रदर्शन किया, लेकिन जी सह transfecting बिना ^ जा सकता है5, 16 सबयूनिट. एक कैल्शियम प्रतिक्रिया मापा जाता है, तो इसका मतलब है कि रिसेप्टर सेलुलर अभिव्यक्ति प्रणाली का एक अंतर्जात Gα क्ष सबयूनिट के साथ जोड़े. कोई फ्लोरोसेंट संकेत मनाया जाता है, अन्य माध्यमिक दूत (जैसे., शिविर) की सांद्रता में परिवर्तन को मापने के लिए प्रोटोकॉल लागू किया जा सकता है. संरचना गतिविधि संबंध (एसएआर) पढ़ाई भी रिसेप्टर सक्रियण के लिए आवश्यक पेप्टाइड के मुख्य अनुक्रम को परिभाषित करने के लिए किया जा सकता है. पहला, छोटा दृश्यों अभी भी रिसेप्टर को सक्रिय करने में सक्षम है कि पेप्टाइड का न्यूनतम अमीनो एसिड अनुक्रम को परिभाषित करने के लिए मूल्यांकन कर रहे हैं. अगला, पेप्टाइड्स व्यवस्थित ढंग से हर एमिनो एसिड एक alanine अवशेषों के लिए प्रतिस्थापित किया गया है जो में परीक्षण किया जा सकता है. रिसेप्टर पर सिंथेटिक alanine प्रतिस्थापन श्रृंखला का परीक्षण रिसेप्टर सक्रियण 24,25 के लिए अमीनो एसिड में से प्रत्येक के महत्व को निर्धारित करने के लिए अनुमति देता है. इसके लगातार उपयोग और साबित effi के बावजूदcacy, यह यहाँ वर्णित परख हित के विशिष्ट रिसेप्टर्स के लिए अधिकतम परिणाम हासिल करने के लिए कुछ रूपांतरों की आवश्यकता हो सकती है कि बल दिया जाना है. Gα 16 सबयूनिट यह सबसे GPCRs को बांधता है कि लाभ दिया है, लेकिन यह भी रिसेप्टर्स पर एक प्रमुख नकारात्मक प्रभाव हो सकता है कि endogenously Gα क्यू 22 के माध्यम से जोड़े. इस मामले में, यह एक उपन्यास कैल्शियम परख के अनुकूलन के दौरान जी प्रोटीन के विभिन्न संयोजनों का परीक्षण करने और Gα 16 की अनुपस्थिति या उपस्थिति में Gα क्ष युग्मित रिसेप्टर्स के लिए परिणामों की तुलना करने के लिए उपयोगी हो सकता है. रिसेप्टर सक्रियण पता लगाने के लिए बातचीत जी प्रोटीन से सम्बंधित वैकल्पिक assays भी ऐसी GFP लेबल arrestin के स्थानान्तरण, या झिल्ली क्षमता (उदाहरण., FLIPR झिल्ली क्षमता परख किट द्वारा) में परिवर्तन का पता लगाने के रूप में, प्रदर्शन किया जा सकता है. Fluo 4 बजे, यहाँ अन्य कैल्शियम के प्रति संवेदनशील fluorophores की एक विस्तृत सरणी, अपने स्वयं के वर्णक्रमीय और chemic के साथ प्रत्येक प्रयोग किया जाता है इसके अलावाअल गुण, उपलब्ध है. सबसे उपयुक्त फ्लोरोफोरे GPCR, सेल प्रकार और उपलब्ध प्लेट रीडर के आधार पर चुना जा सकता है, लेकिन प्रयोगात्मक सत्यापन आवश्यक है. ट्रांसफ़ेक्ट डीएनए और प्रत्येक रिसेप्टर अभिकर्मक अभिकर्मक सेल लाइन संयोजन के लिए निर्धारित किया जा करने के लिए डीएनए / अभिकर्मक अभिकर्मक अनुपात की जरूरत के बराबर है. अंत में, यह निरंतर संस्कृति में कोशिकाओं केवल 20-25 प्रयोग करने योग्य मार्ग स्क्रीनिंग assays प्रदर्शन करने की अनुमति है कि ध्यान में रखा जाना चाहिए.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="610">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">HEK293T cells</td>
			<td style="width:109px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td style="width:109px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D8537</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Trypsin-EDTA solution (0.25%)</td>
			<td style="width:109px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">T4049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:215px;">Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA)</td>
			<td style="width:109px;">MP Biomedicals</td>
			<td style="width:119px;">195173</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:215px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium - high glucose&#160; (DMEM)</td>
			<td style="width:109px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D5796</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td style="width:109px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">F7524</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Penicillin-Streptomycin (P-S)</td>
			<td style="width:109px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P4333</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;width:215px;">jetPRIME</td>
			<td style="width:109px;">Polyplus transfection</td>
			<td style="width:119px;">114-01</td>
			<td style="width:167px;">FuGENE HD Transfection Reagent (Promega); Lipofectamine LTX &#38; Plus Reagent (Life technologies)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Dialyzed Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td style="width:109px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">F0392</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Fibronectin from human plasma</td>
			<td style="width:109px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">F0895</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Reagent A100, Lysis buffer</td>
			<td style="width:109px;">Chemometec</td>
			<td style="width:119px;">910-0003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Reagent B, Stabilizing buffer</td>
			<td style="width:109px;">Chemometec</td>
			<td style="width:119px;">910-0002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:215px;">CaCl2</td>
			<td style="width:109px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">C3881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">HEPES</td>
			<td style="width:109px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>H4034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td style="width:109px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">HBSS buffer: Hank&#39;s Balanced Salt Solution</td>
			<td style="width:109px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>H8264</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Probenecid</td>
			<td style="width:109px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P8761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">NaOH (1 M)</td>
			<td>Vel</td>
			<td>2781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Pluronic acid</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P-3000MP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Dimethyl-sulfoxide (DMSO)</td>
			<td style="width:109px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D8418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:215px;">Fluo-4 AM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>F14201</td>
			<td style="width:167px;">Fluo-3, Rhod-2, Fluo-5, Calcium Green-1,.. (Invitorgen)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">TPP tissue culture flasks (T-75 and T-150)</td>
			<td style="width:109px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">Z707503 and Z707554</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:215px;">FlexStation device</td>
			<td style="width:109px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">NOVOstar (BMG Labtechnologies); FLIPR (Fluorometric Imaging Plate Reader) (Molecular Devices)</td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:215px;">Black-walled polystyrene plates (96 wells) with clear bottom</td>
			<td style="width:109px;">Greiner Bio-One</td>
			<td style="width:119px;">655090</td>
			<td style="width:167px;">Corning 96 well flat clear bottom black polystyrene poly-D-lysine coated microplates</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">NucleoCassette</td>
			<td style="width:109px;">Chemometec</td>
			<td style="width:119px;">941-0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">NucleoCounter NC-100</td>
			<td style="width:109px;">Chemometec</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Microcentrifuge tubes, siliconized</td>
			<td style="width:109px;">BioCision</td>
			<td style="width:119px;">BCS-2470</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Polystyrene V-shaped 96-well plates</td>
			<td style="width:109px;">Greiner Bio-One</td>
			<td>651101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">96-Well, FlexStation Pipet Tips</td>
			<td style="width:109px;">Molecular Devices</td>
			<td>9000-0912</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Soft Max Pro software</td>
			<td style="width:109px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

characterization of g protein-coupled receptors by a fluorescence-based calcium mobilization assay

20 से अधिक वर्षों के लिए, रिवर्स औषध अनाथ जी प्रोटीन युग्मित रिसेप्टर्स (GPCRs) के सक्रिय करने ligands को खोजने के लिए preeminent रणनीति रही है. एक रिवर्स औषध विज्ञान परख की शुरुआत एक सेलुलर अभिव्यक्ति प्रणाली में ब्याज की एक GPCR की क्लोनिंग और बाद अभिकर्मक है. heterologous व्यक्त रिसेप्टर तो रिसेप्टर को सक्रिय ligand (ओं) की पहचान करने के लिए उम्मीदवार ligands की एक यौगिक पुस्तकालय के साथ चुनौती दी है. रिसेप्टर सक्रियण कैल्शियम या शिविर की तरह दूसरा दूत संवाददाता अणुओं की एकाग्रता में परिवर्तन को मापने के द्वारा मूल्यांकन किया जा सकता है. यहाँ वर्णित प्रतिदीप्ति आधारित कैल्शियम जुटाना परख एक बार इस्तेमाल मध्यम throughput के औषध विज्ञान परख रिवर्स है. अनाथ GPCR transiently मानव भ्रूण गुर्दे 293T (HEK293T) कोशिकाओं में व्यक्त की है और एक अनेक Gα 16 निर्माण सह ट्रांसफ़ेक्ट है. Ligand बाध्यकारी बाद, Gα 16 सबयूनिट की सक्रियता कैल्शियम च की रिहाई लातीजालिका रोम. पिछले ligand स्क्रीनिंग के लिए, रिसेप्टर व्यक्त कोशिकाओं एक फ्लोरोसेंट कैल्शियम सूचक, Fluo 4 acetoxymethyl से भरी हुई हैं. Fluo 4 के फ्लोरोसेंट संकेत विश्राम परिस्थितियों में कोशिकाओं में नगण्य है, लेकिन रिसेप्टर सक्रियण के बाद जारी किए हैं कि कैल्शियम आयनों के साथ बातचीत पर एक 100 गुना से भी अधिक परिलक्षित किया जा सकता. वर्णित तकनीक ट्रांसफ़ेक्ट आनुवंशिक सामग्री मेजबान सेल जीनोम में एकीकृत है जिसमें stably ट्रांसफ़ेक्ट सेल लाइनों का समय लेने वाली स्थापना की आवश्यकता नहीं है. इसके बजाय, एक क्षणिक अभिकर्मक, लक्ष्य जीन की अस्थायी अभिव्यक्ति, सृजन स्क्रीनिंग परख करने के लिए पर्याप्त है. सेटअप यौगिकों के सैकड़ों के मध्यम throughput प्रदर्शन की अनुमति देता है. सबसे GPCRs के लिए जोड़े, चाहे अंतर्जात SETT में देशी संकेतन मार्ग की, intracellular संकेतन मार्ग कैल्शियम की रिहाई की दिशा में निर्देशित कर दिये जाने की अनुमति देता है, जो अनेक Gα 16, सह अभिकर्मकबैठकों. HEK293T कोशिकाओं को संभालना आसान कर रहे हैं और रिसेप्टर deorphanization assays में साल भर में अपनी क्षमता को साबित किया है. हालांकि, विशिष्ट रिसेप्टर्स के लिए परख का अनुकूलन आवश्यक रह सकती है.

50 माइक्रोन से 0,001 एनएम को लेकर एकाग्रता श्रृंखला सभी चार ड्रोसोफिला sNPF पेप्टाइड्स (: AQRSPSLRLRFamide, Drome-sNPF-2: SPSLRLRFamide, Drome-sNPF-3: PQRLRWamide, Drome-sNPF-4: PMRLRWamide Drome-sNPF -1) के लिए परीक्षण किया गया क्षणिक ड्रोसोफिला sNPF रिसेप्टर और अनेक Gα 16 सबयूनिट व्यक्त कि HEK293T कोशिकाओं पर. GPCR 0.1 एनएम अप करने के लिए अंतिम सांद्रता में सभी चार पेप्टाइड्स से सक्रिय है, और रिसेप्टर सक्रियण एकाग्रता पर निर्भर था. चित्रा 2 Drome-sNPF -1 एकाग्रता श्रृंखला की तीन प्रतिकृतियां में से एक के लिए इसी रेखांकन को दर्शाया गया है. (- 1 माइक्रोन PAR 1) के मजबूत सक्रियण हासिल अंतर्जात प्रोटीज सक्रिय (30,000 RFU ±) एक उच्च फ्लोरोसेंट संकेत करने के लिए अग्रणी, रिसेप्टर 1 नकारात्मक नियंत्रण (बफर धोने) सकारात्मक नियंत्रण है, जबकि एक फ्लोरोसेंट संकेत प्रेरित नहीं किया. यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि की एक विचलनठेठ वक्र असामान्यताओं का संकेत हो सकता. उदाहरण के लिए, आधारभूत पर लौटने के बिना वक्र की एक सतत वृद्धि जैसे कैल्शियम ionophores की उपस्थिति, या कैल्शियम लीक के कारण एक बाधित लिपिड bilayer के रूप में गैर रिसेप्टर की मध्यस्थता का संकेत है, से संबंधित हो सकता है. सॉफ्टवेयर सक्रियण के प्रतिशत या अन्य लोगों के अलावा विभिन्न सांद्रता के मानक त्रुटियों को निर्धारित करने के फार्मूले में प्रवेश करने की अनुमति देता है. चित्रा 3 में चार Drome-sNPF पेप्टाइड्स के लिए दिखाया के रूप में परिणामी डेटा, चुनाव आयोग 50 मूल्यों अनुमान लगाने के लिए प्रारंभिक एकाग्रता प्रतिक्रिया घटता शांत करने के लिए उपयोग किया जाता है. चित्रा 3 से घटता भी नकारात्मक नियंत्रण जहां एकाग्रता श्रृंखला के लिए डेटा शामिल Drome-sNPF पेप्टाइड्स एक खाली pcDNA3.1 वेक्टर साथ ट्रांसफ़ेक्ट HEK293T कोशिकाओं पर परीक्षण किया गया. परिणाम है कि इन कोशिकाओं को पेप्टाइड्स के अलावा अंतर्जात रिसेप्टर्स पर कोई प्रभाव नहीं है कि संकेत मिलता है, लेकिन वास्तव में activब्याज की रिसेप्टर खा लिया. प्रतिदीप्ति आधारित कैल्शियम जुटाना परख तो तीन बार स्वतंत्र रूप से दोहराया गया था. प्रारंभिक स्क्रीन के प्रारंभिक एकाग्रता प्रतिक्रिया घटता के आधार पर परीक्षण किया सांद्रता वक्र के गतिशील रेंज (चित्रा 4) को कवर करने के लिए अनुकूलित किया गया. Drome-sNPF -1 (2.04 ± 1.48 NM [95% विश्वास अंतराल]), Drome-sNPF -2 (5.89 ± 3.74 एनएम), Drome-sNPF -3 (5.55 ± 3.95 एनएम) और Drome-sNPF के EC50 मूल्यों 4 (0.50 ± 1.01 एनएम) वे रिसेप्टर को सक्रिय करने के लिए समान रूप से शक्तिशाली हैं यह दर्शाता है कि इसी तरह के हैं. <img alt="चित्रा 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51516/51516fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51516/51516fig2.jpg" /> एक एकाग्रता श्रृंखला (50 माइक्रोन से 0,001 एनएम को लेकर). बारह अंतिम सांद्रता ओ की एक रिसेप्टर की मध्यस्थता प्रतिदीप्ति प्रतिक्रिया के लिए सॉफ्टवेयर की चित्रा 2. ग्राफिकल उत्पादनच Drome-sNPF -1 पेप्टाइड Drome-sNPF रिसेप्टर पर परीक्षण किया गया. सक्रियण सापेक्ष फ्लोरोसेंट इकाई (RFU) मूल्यों में व्यक्त किया है. ऊपरी ग्राफ छह उच्चतम सांद्रता के परिणामों और छह सबसे कम सांद्रता के निचले ग्राफ देता है. (-) धोने बफर है सकारात्मक नियंत्रण (+) PAR 1 (1 माइक्रोन) और नकारात्मक नियंत्रण है. <img alt="चित्रा 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51516/51516fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51516/51516fig3.jpg" /> चित्रा 3. एक एकल प्रतिदीप्ति आधारित कैल्शियम जुटाना परख द्वारा निर्धारित ड्रोसोफिला sNPF पेप्टाइड्स की प्रारंभिक एकाग्रता प्रतिक्रिया घटता. Transiently चार ड्रोसोफिला sNPF पेप्टाइड्स के लिए HEK293T कोशिकाओं में व्यक्त ड्रोसोफिला sNPF रिसेप्टर की एकाग्रता प्रतिक्रिया घटता नीले रंग में दिखाया गया है. (लाल रंग में दिखाया गया है) नकारात्मक नियंत्रण के लिए, पेप्टाइड्स HEK293T पर परीक्षण किया गयाएक खाली pcDNA3.1 वेक्टर साथ ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं. फ्लोरोसेंट प्रतिक्रियाओं उच्चतम मूल्य (100% सक्रियण) के सापेक्ष (%) के रूप में दिखाया गया है. घटता प्रत्येक एकाग्रता श्रृंखला तीन प्रतियों में मापा गया था जिसमें एक प्रयोग के परिणाम हैं. ऊर्ध्वाधर सलाखों (उस मामले में, केवल चिह्न चित्रित कर रहे हैं) कभी कभी प्रयोग किया जाता चिह्न से छोटे हैं जो मतलब (SEM), के मानक त्रुटियों का प्रतिनिधित्व करते हैं. <img alt="चित्रा 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51516/51516fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51516/51516fig4.jpg" /> चित्रा 4. एकाग्रता प्रतिक्रिया घटता है और तीन स्वतंत्र प्रतिदीप्ति आधारित कैल्शियम जुटाना assays के द्वारा निर्धारित ड्रोसोफिला sNPF पेप्टाइड्स के चुनाव आयोग 50 मूल्यों के इसी. Transiently चार ड्रोसोफिला sNPF पेप्टाइड्स के लिए HEK293T कोशिकाओं में व्यक्त Drosopihla sNPF रिसेप्टर की एकाग्रता प्रतिक्रिया घटता परिणाम हैं तीन स्वतंत्र मुझे काasurements प्रत्येक तीन प्रतियों में प्रदर्शन (एन ≥ 9). फ्लोरोसेंट प्रतिक्रियाओं उच्चतम मूल्य (100% सक्रियण) के सापेक्ष (%) के रूप में दिखाया गया है. सितारे n ≤ 9. त्रुटि सलाखों कभी कभी (उस मामले में, केवल चिह्न चित्रित कर रहे हैं) का इस्तेमाल किया प्रतीकों से छोटे हैं जो SEM, संकेत मिलता है जिसके लिए सांद्रता संकेत मिलता है. चुनाव आयोग 50 मानों उनके 95% विश्वास अंतराल के साथ दिखाया गया है.

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Characterization of G Protein-coupled Receptors by a Fluorescence-based Calcium Mobilization Assay

यहाँ वर्णित प्रतिदीप्ति आधारित कैल्शियम जुटाना परख अनाथ जी प्रोटीन युग्मित रिसेप्टर्स (GPCRs) के कार्यात्मक को सक्रिय ligand (ओं) की पहचान के लिए एक मध्यम throughput रिवर्स औषध विज्ञान स्क्रीनिंग प्रणाली है.

एक प्रतिदीप्ति आधारित कैल्शियम अभिप्रेरण परख द्वारा जी प्रोटीन युग्मित रिसेप्टर्स की विशेषता

For more than 20 years, reverse pharmacology has been the preeminent strategy to discover the activating ligands of orphan G protein-coupled receptors ...

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In vivo Quantification of G Protein Coupled Receptor Interactions using Spectrally Resolved Two-photon Microscopy

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Fluorescence-based Measurement of Store-operated Calcium Entry in Live Cells: from Cultured Cancer Cell to Skeletal Muscle Fiber

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आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग आण्विक जांच जी प्रोटीन युग्मित रिसेप्टर्स अध्ययन करने के लिए

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TIRF माइक्रोस्कोपी के माध्यम से एकल घटना के प्रस्ताव पर जी प्रोटीन युग्मित रिसेप्टर्स की क्लैथ्रिन की मध्यस्थता endocytosis Visualizing

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इमेजिंग जी प्रोटीन युग्मित न्युट्रोफिल की तरह HL60 कोशिकाओं में रिसेप्टर की मध्यस्थता chemotaxis और इसके संकेत घटनाओं

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Detection of Ligand-activated G Protein-coupled Receptor Internalization by Confocal Microscopy

Confocal माइक्रोस्कोपी द्वारा लिगेंड सक्रिय जी प्रोटीन युग्मित रिसेप्टर internalization की जांच

Confocal laser scanning microscopy (CLSM) is an optical imaging technique for high-contrast imaging. It is a powerful approach to visualize fluorescent ...