Name: characterization of g protein-coupled receptors by a fluorescence-based calcium mobilization assay
Uploaded: 2014-07-28T14:00:00
Duration: 11 min 49 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Characterization of G Protein-coupled Receptors by a Fluorescence-based Calcium Mobilization Assay at JoVE.com

Författarna erkänner Research Foundation Flanders (FWO-Vlaanderen, Belgien, G.0601.11) och KU Leuven Research Foundation GOA/11/002. IB, TJ och LT nytta av ett stipendium från FWO-Vlaanderen.

Obs: Alla åtgärder i vilka celler är involverade bör utföras i en steril miljö genom att arbeta i ett laminärt flöde. 1. Underhåll av HEK293T cellinje <ol><li> Odla HEK293T-celler i en T-75 kolv vid 37 ° C i en 5% CO2 fuktad inkubator. </li><li> Passage cellerna när ett sammanflöde av 80% uppnås. Obs: Det tar normalt 3-4 dagar. Celler i kontinuerlig kultur tillåter 20-25 användbara passager för screening. <ol><li> Placera Dulbeccos fosfatbuffrade saltlösning (PBS) utan kalciumklorid och magnesiumklorid, PBS-trypsin-etylendiamintetraättiksyra (EDTA) (500 ml PBS kompletterad med 10 ml trypsin-EDTA-lösning och 4,5 ml 4% EDTA) och tillväxtmedium (500 ml Dulbeccos modifierade Eagles medium - hög glukos [DMEM], kompletterat med 10% fetalt bovint serum [FBS] och 1 mM penicillin-streptomycin [PS]) vid rumstemperatur i en halvtimme i förväg. </li><li> Ta bortdet gamla odlingsmediet från cellerna. Skölj bort döda celler med 3 ml PBS och ta bort PBS igen. </li><li> Lägg 3 ml PBS-trypsin-EDTA, inkubera under 1 min vid rumstemperatur och avlägsna lösningen Anm Morfologin hos cellerna kommer att ändras från stjärnformade till sfär-formad. </li><li> Lossa cellerna från botten av kolven genom försiktig knackning och samla upp cellerna genom sköljning botten flera gånger med 10 ml färskt tillväxtmedium. </li><li> Överför 1 ml av cellkulturen till en ny T-75-kolv innehållande 14 ml färskt tillväxtmedium och inkubera vid 37 ° C i en 5% CO2 fuktad inkubator. </li></ol></li></ol> 2. Transient transfektion av HEK293T Celler <ol><li> Odla HEK293T-celler i en T-75 kolv, tre dagar före själva kalciummobilisering analysen sker. Se till att använda tre T-75-kolvar, en för transfektion med receptorkonstruktionen, en för transfektion med en tom expressionsvektor, som negativ kontroll, och one för transfektion kontroll. Obs: passage av cellerna utförs som beskrivet i steg 1.2. När flera 96-hålsplattor måste screenas, kan T-150 flaskor användas för att få ett högre utbyte av celler (för att göra detta, dubbelt samtliga noterade mängder i steg 1.2.5, 2.3, 3.1.3 och 3.1.4) . </li><li> Inkubera kolvarna vid 37 ° C i en 5% CO2 fuktad inkubator under 20 till 24 h tills cellkulturerna närma sig 50-70% konfluens. </li><li> Co-transfektera en population av celler med expressionsvektor som kodar för GPCR av intresse och Ga 16 konstruktionen, den andra kolven med den tomma vektorn och Ga 16 konstruktionen, och den tredje med transfektion kontroll och Ga 16 konstruktionen. OBS: I detta protokoll var Drosophila sNPF receptorn klonad i en pcDNA3.1 mammalieexpressionsvektor 13. JetPRIME användes för att utföra transfektionen, men andra transfektionsreagens kan användas också. <ol><li> Lägg påotalt av 7,8 | ig DNA (3,9 pg receptorkonstruktion eller tom vektor, och 3,9 | j, g Ga 16 uttryckskonstruktion) till ett 1,5 ml mikrocentrifugrör och tillsätt 500 pl av JetPRIME buffert. Blanda väl genom att vortexa röret och centrifugera ner inom kort. </li><li> Lägg 37,5 pl av JetPRIME reagens, virvel och spinn ner i 1 min vid 14000 x g.. Inkubera transfektion blandning 10 min vid rumstemperatur. </li><li> Lägg transfektionen blandning droppvis till cellodlingsmediet och se till att pipetteringen direkt in i mediet att undvika kontakt med väggarna i odlingskolv. Inkubera kolvarna vid 37 ° C i en 5% CO2 fuktad inkubator under 20 till 24 timmar. </li></ol></li></ol> 3. Kalciummobilisering Assay <ol><li> Samla de transfekterade cellerna och utsäde dem i 96-brunnars svarta väggar och klara bottnade plattor. <ol><li> Placera PBS, PBS-trypsin-EDTA och DMEM överföringsmedium (500 ml DMEM kompletterat med 10% dialyserat FBSoch 1% PS) vid rumstemperatur i en halvtimme i förväg. </li><li> Coat den 96-väl svart väggar, klara bottenplattor med 60 l PBS med fibronektin (0,0025%) per brunn (5,85 ml PBS och 150 ul fibronektin [0,1%] per platta). Inkubera plattorna vid rumstemperatur i 1 h med locket på. Avlägsna lösningen från brunnarna och inkubera plattorna igen under 1 timme utan lock vid rumstemperatur. Alternativt är det möjligt att använda pre-belagda plattor för förbättrad fastsättning cell. </li><li> Ta bort det gamla odlingsmedium från cellerna och spola döda celler bort med 3 ml PBS och ta bort PBS. </li><li> Tillsätt 3 ml PBS-trypsin-EDTA, inkubera i 1 minut, ta sedan bort lösningen. Obs: cellernas morfologi ändras från stjärnformade till sfär-formad. </li><li> Lossa cellerna från botten av flaskan genom att klappa försiktigt och samla dem genom att skölja flera gånger med 10 ml DMEM överföringsmedium. Överför cellerna i ett 50 ml Falcon-rör. </li><li> Räknaantalet celler per ml (utförs med en NucleoCounter här, men en Burker kammare är acceptabelt). Tillsätt 100 | il av cellkulturen i ett 1,5 ml mikrocentrifugrör. Tillsätt 100 pl lyseringsbuffert och blanda genom att knacka på röret. Tillsätt 100 l stabiliserande buffert och blanda genom att peka. </li><li> Fyll en NucleoCassette med cellsuspensionen och räkna cellerna med räknaren. Multiplicera antalet celler efter tre, som cellerna späddes med en faktor tre vid tillsats av lys och stabiliserande buffert i steg 3.1.6. </li><li> Späd cellerna till en slutkoncentration av 600000 celler / ml och ympa 150 pl av cellerna per brunn i de belagda plattorna för att erhålla en celltäthet av omkring 90000 celler per / brunn. Undvik luftbubblor och knacka på plattan för att sprida cellerna jämnt för att få ett sammanhängande cellager. Inkubera plattorna vid 37 ° C i en 5% CO2 fuktad inkubator under 16 till 24 timmar. </li></ol></li><li> Fyll på cellerna med det fluorescerande färgämnet och förbereda compound plattan. <ol><li> Förbered Hanks balanserade saltlösning (HBSS) / HEPES / Ca2 + / bovint serumalbumin (BSA) buffert: lägga 165 l CaCl2 stamlösning (1 M CaCl2 i destillerat vatten [dH 2 O] - butik i rumstemperatur), 500 pl HEPES stamlösning (1 M HEPES i dH 2 O, pH 7,4 - Förvara i rumstemperatur), och 0,05 g BSA till 50 ml HBSS. Observera att fettsyrafritt BSA används för kalciumanalyser, såsom fettsyror kan aktivera specifika receptorer, vilket försämrar kalciumsignalen av receptorn av intresse. </li><li> Förbered probenecid lösning (100x, 250 mM): lös upp 0,71 g probenecid i 5 ml NaOH (1 M) och tillsätt 50 pl HEPES lager lösning och 5 ml i HBSS / HEPES / Ca2 + / BSA-buffert - alltid bered nya lösning. Anm: Probenecid inhiberar oorganiska anjontransportörer som kan rubba Fluo-4 från cytoplasman, och därigenom minska den fluorescerande signalen. Det rekommenderas att utföra färgen lastning inärvaro och frånvaro av probenecid för att bestämma huruvida oorganiska anjontransportörer utgöra ett potentiellt problem i de speciella cellinjer under utredning, såsom probenecid kan även minska den agonistförmedlade signalen. </li><li> Förbered tvättbuffert: tillsätt 500 l probenecid lösning till 50 ml HBSS / HEPES / Ca2 + / BSA-buffert, justera pH till 7,4 och filtrera buffertlösningen. Alltid förbereda färsk buffert, och 50 ml buffert per platta krävs. </li><li> Förbered 10% pluronsyra lösning: Blanda 50 l pluronsyra (20% vikt / volym i dimetylsulfoxid [DMSO]) med 50 ^ DMSO - om kristallisering inträffar, värm till 37 ° C och alltid förbereda färsk lösning. </li><li> Förbered Fluo-4:00-lösning (1 mM): lägg till 44 l 10% pluronsyra lösning på en flaska som innehåller 50 mikrogram Fluo-4:00 och skaka tills det är helt upplöst. Undvik exponering för ljus för att förhindra blekning av fluoroforen. </li><li> Förbered buffert: till 8,8 ml DMEM supplemented med 10 mM HEPES och 2,5 mM probenecid (pH 7,4) till Fluo-04:00-lösning (44 | il) och skaka. Använd alltid färsk buffert. </li><li> Kasta bort mediet från cellerna, tvätta cellerna med 200 pl PBS per brunn och avlägsna PBS. </li><li> Addera 55 pl laddningsbuffert per brunn och inkubera under 1 timme vid rumstemperatur. Linda in plattan i aluminiumfolie för att undvika exponering av plattan för ljus. </li><li> Se till att torka av föreningarna innan skärmen om de är lösta i lösningsmedel som är skadliga (t.ex. acetonitril) för det cellulära expressionssystem. </li><li> Solubilisera peptiderna i tvättbuffert i silikoniserade 1,5 ml mikrorör. Bered en spädningsserie för att göra en koncentration-respons-analys och för att bestämma EC50-värdet för en ligand. Addera 70 pl av liganden i motsvarande brunn av föreningen plattan (V-formade 96-brunnars plattor) och inkluderar positiva (endogen agonist) och negativa kontroller (tvättbuffert) på varje platta. Inte<html> e: Om en förening inte är löslig i tvättbufferten, kan man prova andra lösningsmedel som inte är skadliga för cellerna som undersöks, till exempel vatten eller lösningar som emulgerar och solubiliserar oljor och andra vattenlösliga ämnen (t.ex. Kolliphor EL) . </li><li> Mät alla prover i tre exemplar. Kom ihåg att 50 | il av en ligand från föreningen plattan kommer att överföras i en brunn med 100 ^ il tvättbuffert av cellplattan under analysen, så framställa föreningarna vid 3x sin önskade slutliga koncentrationen. </li><li> Kassera laddningsbuffert från cellplattan och tillsätt 100 pl tvättbuffert till varje brunn. Inkubera plattan i 15 minuter vid rumstemperatur och förhindra exponering för ljus. </li><li> Kassera tvättlösning från cellplattan och tillsätt 100 | il ny tvättbuffert till varje brunn. </li><li> Inkubera cellplattan föreningen platta, och en spets kuggstång (96 brunnar, stationsanordningen pipettspetsar) under 15 min vid 37 ° C. </li></ol></li></ol>title &quot;&gt; 4. Assay på stationen Device <ol><li> Skapa och ladda önskad protokollfilen med programmet och aktivera temperaturenhet för läsning kammaren. Här mäta kalciumsvar vid 37 ° C under 2 min en rad i taget med 1,52 sek intervall mellan på varandra följande avläsningar (mätning av en fullständig 96-brunnars platta tar cirka 25 min) vid 525 nm. Ställ excitation av Fluo-4 till 488 nm och överföra en total volym av 50 | il av föreningen till cellplattan, 18 sek efter det att behandlingen start med dispenseringshastighet inställd på 26 pl / sek och en pipett höjd av 135 | il. </li><li> Placera föreningen och cellplattan och spetsen kuggstången i lämpliga lådor för stationsanordningen. </li><li> Utför en läsning av cellplattan på samma excitation och emissionsvåglängd i ENDPOINT läget, innan själva skärmen i FLEX-läge. OBS: Denna mätning ger relativ fluorescens enhet (RFU) värden och möjliggör detektion av variabilitet mellan vills av plattan. Värden mellan 20.000 och 40.000 anses vara acceptabelt. </li><li> Starta analysen och analysera data med programvaran. </li></ol>

<ol>
	<li>Bockaert, J., Pin, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+tinkering+of+G+protein-coupled+receptors+an+evolutionary+success.">Molecular tinkering of G protein-coupled receptors an evolutionary success.</a> EMBO J. 18 (7), 1723-1729 (1999).</li><li>Gether, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uncovering+molecular+mechanisms+involved+in+activation+of+G+protein-coupled+receptors.">Uncovering molecular mechanisms involved in activation of G protein-coupled receptors.</a> Endocr Rev. 21 (1), 90-113 (2000).</li><li>Drews, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+discovery+a+historical+perspective.">Drug discovery a historical perspective.</a> Science. 287 (5460), 1960-1964 (2000).</li><li>Marinissen, M. J., Gutkind, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G-protein-coupled+receptors+and+signaling+networks+emerging+paradigms.">G-protein-coupled receptors and signaling networks emerging paradigms.</a> Trends Pharmacol Sci. 22 (7), 368-376 (2001).</li><li>Bendena, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuropeptide+physiology+in+insects.">Neuropeptide physiology in insects.</a> Adv Exp Med Biol. 692, 166-191 (2010).</li><li>Van Hiel, M. . B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuropeptide+receptors+as+possible+targets+for+development+of+insect+pest+control+agents.">Neuropeptide receptors as possible targets for development of insect pest control agents.</a> Adv Exp Med Biol. 692, 211-226 (2010).</li><li>Tang, X. . L., Wang, Y., Li, D. . L., Luo, J., Liu, M. . Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Orphan+G+protein-coupled+receptors+(GPCRs):+biological+functions+and+potential+drug+targets.">Orphan G protein-coupled receptors (GPCRs): biological functions and potential drug targets.</a> Acta Pharmacol Sin. 33 (3), 363-371 (2012).</li><li>Civelli, O., Reinscheid, R. K., Zhang, Y., Wang, Z., Fredriksson, R., Schi&#246;th, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G+protein-coupled+receptor+deorphanizations.">G protein-coupled receptor deorphanizations.</a> Annu Rev Pharmacol Toxicol. 53, 127-146 (2013).</li><li>Mertens, I., Vandingenen, A., Meeusen, T., De Loof, A., Schoofs, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postgenomic+characterization+of+G-protein-coupled+receptors.">Postgenomic characterization of G-protein-coupled receptors.</a> Pharmacogenomics. 5 (6), 657-672 (2004).</li><li>Brough, S. J., Shah, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+aequorin+for+G+protein-coupled+receptor+hit+identification+and+compound+profiling.">Use of aequorin for G protein-coupled receptor hit identification and compound profiling.</a> Methods Mol Biol. 552, 181-198 (2009).</li><li>Gee, K. R., Brown, K. A., Chen, W. N. U., Bishop-Stewart, J., Gray, D., Johnson, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+and+physiological+characterization+of+fluo-4+Ca2+-indicator+dyes.">Chemical and physiological characterization of fluo-4 Ca2+-indicator dyes.</a> Cell Calcium. 27 (2), 97-106 (2000).</li><li>Beets, I., Lindemans, M., Janssen, T., Verleyen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deorphanizing+G+protein-coupled+receptors+by+a+calcium+mobilization+assay.">Deorphanizing G protein-coupled receptors by a calcium mobilization assay.</a> Methods Mol Biol. 789, 377-391 (2011).</li><li>Mertens, I., Meeusen, T., Huybrechts, R., De Loof, A., Schoofs, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+short+neuropeptide+F+receptor+from+Drosophila+melanogaster.">Characterization of the short neuropeptide F receptor from Drosophila melanogaster.</a> Biochem Biophys Res Commun. 297 (5), 1140-1148 (2002).</li><li>Lu, H. -. L., Kersch, C. N., Taneja-Bageshwar, S., Pietrantonio, P. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+calcium+bioluminescence+assay+for+functional+analysis+of+mosquito+(Aedes+aegypti)+and+tick+(Rhipicephalus+microplus)+G+protein-coupled+receptors.">A calcium bioluminescence assay for functional analysis of mosquito (Aedes aegypti) and tick (Rhipicephalus microplus) G protein-coupled receptors.</a> J. Vis. Exp. (50), e2732 (2011).</li><li>Feng, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+characterization+of+a+neuropeptide+F-like+receptor+from+Drosophila+melanogaster.">Functional characterization of a neuropeptide F-like receptor from Drosophila melanogaster.</a> Eur. J. Neurosci. 18 (2), 227-238 (2003).</li><li>N&#228;ssel, D. R., Wegener, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparative+review+of+short+and+long+neuropeptide+F+signaling+in+invertebrates+any+similarities+to+vertebrate+neuropeptide+Y+signaling.">A comparative review of short and long neuropeptide F signaling in invertebrates any similarities to vertebrate neuropeptide Y signaling.</a> Peptides. 32 (6), 1335-1355 (2011).</li><li>Grimmelikhuijzen, C. J. P., Hauser, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mini-review+The+evolution+of+neuropeptide+signaling.">Mini-review The evolution of neuropeptide signaling.</a> Regul Pept. 177, S6-S9 (2012).</li><li>Caers, J., Verlinden, H., Zels, S., Vandersmissen, H. P., Vuerinckx, K., Schoofs, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=More+than+two+decades+of+research+on+insect+neuropeptide+GPCRs+an+overview.">More than two decades of research on insect neuropeptide GPCRs an overview.</a> Front Endocrinol (Lausanne. 3 (151), 1-30 (2012).</li><li>Kozak, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+analysis+of+5&#8217;-noncoding+sequences+from+699+vertebrate+messenger+RNAs).">An analysis of 5&#8217;-noncoding sequences from 699 vertebrate messenger RNAs).</a> Nucleic Acids Res. 15 (20), 8125-8148 (1987).</li><li>Offermanns, S., Simon, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G&#945;15+and+G&#945;16+couple+a+wide+variety+of+receptors+to+phospholipase.">G&#945;15 and G&#945;16 couple a wide variety of receptors to phospholipase.</a> CJ Biol Chem. 270 (25), 15175-15180 (1995).</li><li>Ral Conklin, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Carboxyl-terminal+mutations+of+Gq&#945;+and+Gs&#945;+that+alter+the+fidelity+of+receptor+activation.">Carboxyl-terminal mutations of Gq&#945; and Gs&#945; that alter the fidelity of receptor activation.</a> Mol Pharmacol. 50 (4), 885-890 (1996).</li><li>Kostenis, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Is+G&#945;16+the+optimal+tool+for+fishing+ligands+of+orphan+G-protein-coupled+receptors.">Is G&#945;16 the optimal tool for fishing ligands of orphan G-protein-coupled receptors.</a> Trends Pharmacol Sci. 22 (11), 560-564 (2001).</li><li>Robas, N. M., Fidock, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+orphan+G+protein-coupled+receptor+ligands+using+FLIPR+assays.">Identification of orphan G protein-coupled receptor ligands using FLIPR assays.</a> Methods Mol Biol. 306, 17-26 (2005).</li><li>Caers, J., Peeters, L., Janssen, T., De Haes, W., G&#228;de, G., Schoofs, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure-activity+studies+of+Drosophila+adipokinetic+hormone+(AKH)+by+a+cellular+expression+system+of+dipteran+AKH+receptors.">Structure-activity studies of Drosophila adipokinetic hormone (AKH) by a cellular expression system of dipteran AKH receptors.</a> Gen Comp Endocrinol. 177 (3), 332-337 (2012).</li><li>Peeters, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pharmacological+study+of+NLP-12+neuropeptide+signaling+in+free-living+and+parasitic+nematodes.">A pharmacological study of NLP-12 neuropeptide signaling in free-living and parasitic nematodes.</a> Peptides. 34 (1), 82-87 (2012).</li></ol>

Författarna har ingenting att lämna ut.

Fluorescensbaserade kalciummobilisering analys med framgång tillämpas för att bekräfta den funktionella karakteriseringen av Drosophila sNPF peptiderga signaleringssystem, som redan utfördes genom Mertens et al. med en bioluminescens-analys och av Feng et al. med en elektrofysiologisk analys 13,15. De EG 50 värden som erhålls med fluorescens-analys i HEK293T-celler är omkring 10 gånger lägre än de som erhölls med bioluminescens-analys utförs i CHO-celler (Drome-sNPF-1: fluo = 2,04 nM, lumi = 51 nM; Drome-sNPF- 2: fluo = 5.89 nM, lumi = 42 nM, Drome-sNPF-3: fluo = 5,55 nM, lumi = 31 nM, Drome-sNPF-4: fluo = 0,50 nM, lumi = 75 nM). Dessa variationer kan förklaras av flera faktorer, inklusive det faktum att en av de använda expressionssystem kan vara bättre lämpade för funktionell expression av en given receptor eller vikningen av vissa receptorer kan vara mindre effektiva i cissa celltyper. De EC 50-värden för alla fyra Drome-sNPF peptider är i nanomolarområdet vid prov på sin receptor med både fluorescens och mareld analysen, i allmänhet stöder den fysiologiska relevansen av sin peptid-receptor interaktion in vivo. Observera att ingen transfektion kontroll med en receptor för vilken den aktiverande liganden är känd ingick i skärm som presenteras här, eftersom signaleringssystemet Drosophila sNPF normalt transfektionen kontroll i experimentella uppställningar. Den positiva kontrollen med en endogen ligand av HEK293T cellerna (PAR 1) och den negativa kontroll (tvättbuffert) inkluderades i skärmen. Resultaten från PAR 1 visade att cellerna var i ett gott skick. Den negativa kontrollen (tvättbuffert) framkallade inte en fluorescerande signal, som indikerar att det medium i vilket peptiderna upplöses var fri från eventuella föroreningar som skulle kunna influence resultaten. Den tidigare karakteriserats Drosophila sNPF signaleringssystem användes här för att förklara den fluorescensbaserad kalciummobiliseringsanalys. För detta ändamål var koncentrationsserie av de aktiverande ligander testades omedelbart. När emellertid en föräldralös receptor bringas till överexpression i en screeningsanalys för att testa ett bibliotek som innehåller hundratals av föreningar, är det rekommenderat att första skärmen med relativt höga slutkoncentrationer av liganderna (t.ex.., 10 eller 1 | iM). Efter detektering av en aktiverande förening, kan en utspädningsserie av att föreningen som skall screenas för att komponera en koncentration-responskurva och för att bestämma EC50-värde. När den aktiverande liganden hos en receptor som är bestämd, kan den intracellulära signaleringsvägen att undersökas ytterligare genom en anpassning av protokollet. Analysen kan utföras såsom beskrivits ovan, men utan att samtransfektera G ^5, 16-subenheten. När ett kalciumsvar mäts, betyder det att receptorn par med en endogen Ga q-subenheten av det cellulära expressionssystemet. När ingen fluorescerande signal observeras, kan protokoll för att mäta förändringar i koncentrationer av andra sekundära budbärare (t.ex.., CAMP) tillämpas. Struktur-aktivitetssamband (SAR) studier kan även utföras för att definiera peptidens kärnsekvensen som krävs för aktivering av receptorn. Först är stympade sekvenser utvärderas för att definiera den minimala aminosyrasekvensen för den peptid som fortfarande kan aktivera receptorn. Därefter kan peptider testas i vilken systematiskt varje aminosyra har ersatts med en alaninrest. Testning syntetisk alaninsubstitutionsserie på receptorn tillåter att bestämma vikten av var och en av aminosyrorna för receptoraktivering 24,25. Trots dess allmänna användning och bevisade effekkans, måste det understrykas att den analys som beskrivs här kan behöva några anpassningar för att få optimala resultat för specifika receptorer av intresse. The Ga 16 subenheten har den fördelen att den binder till de flesta GPCR: er, men kan också ha en dominant-negativ effekt på receptorer som endogent par via Ga q 22. I detta fall kan det vara bra att testa olika kombinationer av G-proteiner under optimeringen av en kalciumanalys roman och att jämföra resultaten för Ga q kopplade receptorer i frånvaro eller närvaro av Ga 16. Alternativa analyser som är oberoende av den samverkande G-protein för att upptäcka receptoraktivering kan också utföras, såsom translokation av GFP-märkta arrestin, eller att upptäcka förändringar i membranpotential (t ex., Av FLIPR Membrane Potential Assay Kit). Förutom använde Fluo-4:00 här, ett brett utbud av andra kalciumkänsliga fluoroforer, alla med sin egen spektral och chemical egenskaper, finns tillgänglig. Den lämpligaste fluorofor kan väljas baserat på den GPCR, celltyp och den tillgängliga plattläsare, men experimentell verifiering är nödvändig. Mängderna transfekterade DNA och DNA / transfektionsreagens förhållande behov att bestämmas för varje receptor-transfektion reagens-cellinje kombination. Slutligen bör det hållas i minnet att celler i kontinuerlig kultur tillåter endast 20-25 användbara passager för att utföra screeningsanalyserna.

G-proteinkopplade receptorer (GPCR) utgör en av de största och mest diversifierade familjerna bland alla cellytan proteiner. Deras närvaro i ryggradsdjur, ryggradslösa djur, växter, jäst och slemsvamp, samt i protozoer och den tidigaste diploblastic Metazoa visar att GPCRs är bland de äldsta molekylerna är kopplade med signaltransduktion 1. Deras naturliga aktiverande ligander omfattar en stor mångfald av yttre stimuli, inklusive peptider, biogena aminer, luktämnen, glykoproteiner och fotoner 2. Som sådana är dessa receptor-ligand signalsystem inblandad i ett stort antal olika fysiologiska processer. Det breda funktionella spektrum gör dem idealiska för utveckling av terapeutiska läkemedel som täcker ett brett spektrum av mänskliga sjukdomar. Om 50-60% av de nuvarande läkemedelsmål representeras av GPCRs 3,4. Förutom deras stora betydelse inom läkemedelsindustrin, GPCRs är också i fokus för utvecklingen av enny generation av artspecifika insekts 5,6 och bekämpningsmedel i allmänhet. Eftersom de naturliga ligander av många GPCRs är fortfarande oidentifierad, klassificeras de som föräldralösa GPCRs. Den deorphanization av dessa receptorer kommer att förbättra förståelsen för deras fysiologiska roller i organismer och kan avslöja förmodade mål för nya läkemedelsansökningar 7. Eftersom den genomiska eran, är det omvända farmakologi strategi i stor utsträckning för deorphanization av GPCRs 8. Ansatsen innebär att en föräldralös receptor används som en &quot;krok&quot; till &quot;fiska ut&quot; sin aktiverande ligand från ett biologiskt extrakt eller från ett bibliotek av syntetiska ämnen. Den GPCR av intresse därför klonas och därefter transfekteras i ett cellulärt expressionssystem. I de mest vanligen använda metoderna är receptoraktivering bestämmas genom mätning av förändringar i koncentrationen av den andra budbärarmolekyler 9 </sup&gt;. De huvudsakliga receptorscreeninganalyser är beroende av kalciumkänsliga självlysande proteiner (t.ex. aequorin) 10 eller fluorescerande kalcium indikatorer (t.ex. Fluo-4) 11. De fluorescensbaserade analyser, där receptoruttryckande celler är laddade med en fluorescerande indikator kalcium före ligand screening, har den fördelen att de tillåter high-throughput screening på grund av sin användarvänlighet, kort tid att läsa, och flexibiliteten i screening flera föräldralösa receptorer på en enda platta 12. Här är den fluorescensbaserad kalciummobilisering assay noggrant beskrivas och illustreras genom deorphanization förfarandet enligt Drosophila melanogaster korta neuropeptid F (sNPF) receptorn. Denna neuropeptidergic signalsystem ursprungligen präglats av Mertens et al. 2002 13 med en kalcium mareld analys utförs i kinesisk hamster äggstock (CHO)14 och av Feng et al. 2003 med en elektrofysiologisk analys med hjälp av Xenopus oocyter 15. Närvaron av signalsystemet sNPF tycks vara begränsat till phylum av Arthropoda, där den är inblandad i ett stort antal processer inklusive regleringen av matning, tillväxt, stressreaktioner, locomotion och dygnsrytm 16. Forskning om neuropeptidergic signalsystem i insekter kan inte bara leda till nya mål för utvecklingen av insektsmedel, men kunskapen om deras funktion kan också extrapoleras till andra organismer så många signalsystem har i allmänhet väl bevarade genom evolutionen 17. Under det senaste decenniet har stora framsteg gjorts i deorphanization processen av insektsneuropeptid GPCRs. Trots dessa ansträngningar har bara ett litet antal receptorer matchats till sin tillhörande ligand, och massor av sekvensinformation förnya föräldralösa GPCRs har blivit tillgängliga på grund av den blomstrande av genomik 18. Tillgången på medium / high-throughput screening metoder, såsom fluorescensbaserade kalciummobilisering analys som har visat sig vara en stor utsträckning teknik 9,18, är därför ovärderlig. Fluorescensbaserade kalciummobilisering analys såsom beskrivits här utförs i humana embryonala njur 293T (HEK293T) cellinjen och använder en fluorescerande prob för att fastställa förändringar i intracellulära kalciumkoncentrationer på receptoraktivering. För att garantera hög expression och nivåer av receptorn översättnings är en Kozak konsensussekvens 19 sattes till 5&#39;-änden av den receptorkodningssekvensen, som därefter klonas i en expressionsvektor (t.ex. pcDNA vector serie för däggdjurscellinjer). Eftersom det är svårt att förutsäga den endogena G-protein-koppling av en föräldralös GPCR baserat på sekvensinformationensam, den andra budbärarmolekyler (t.ex. kalcium-eller cAMP) som moduleras efter receptoraktivering förblir ofta okänd före ligand identifiering. För att kringgå detta problem, promiscuous G-proteiner i Gq familj (t.ex. murina Ga-15 eller human Ga 16 [används här]) eller chimära G-proteiner (t.ex. Ga qi5) som interagerar med de flesta GPCR: er och inducerar frisättningen av kalcium kan samuttryckas 20,21,22. Vid bindning av liganden till dess receptor undergår GPCR en konformationsförändring som leder till aktivering av specifika intracellulära signalvägar. Den guanosin difosfat (GDP) molekyl, bunden inom ramen vilande betingelser till Ga-16-subenhet, kommer att ersättas av en guanosin-trifosfat (GTP)-molekyl. Detta framkallar dissociationen av det heterotrimera G-proteinet i en Ga-16 och Gβγ subenheten. Den Ga 16 subenheten aktiverar fosfolipas C &amp;# 946; (PLCβ), vilket i sin tur hydrolyserar den membranbundna fosfatidylinositol bisfosfat (PIP2) vilket resulterar i diacylglycerol (DAG) och inositol-trifosfat (IP3). IP 3 kommer att spridas över hela cytoplasman och aktiverar IP-3-beroende kalciumkanaler som är närvarande i membranet i det endoplasmatiska retiklet, vilket inducerar frisättningen av kalcium i cytoplasman. Kalcium frisättning vid receptoraktivering inträffar inom några sekunder och kan detekteras genom laddning av celler före screeningsanalys med ett kalciumkänsligt färgämne, som Fluo-4 acetoximetyl (AM) 11. AM estergruppen möjliggör fluoroforen att passera cellmembranet och spjälkas av genom cytoplasmatiska esteraser en gång inne i cellen. Följaktligen är de negativa laddningarna i det fluorescerande färgämnet omaskerad, hindrar den från att diffundera ut ur cellen och låta det interagera med kalciumjoner. Den fluorescerande signal of Fluo-4 är försumbar i celler under vila förhållanden endast innehåller kalciumkoncentrationer i nanomolarområdet. Emellertid, när kalcium frigöres vid receptoraktivering, kan signalen öka koncentrationsberoende till mer än en 100-faldig, härmed att säkerställa ett stort signal-till-brusförhållande. Fluo-4 uppvisar också ett stort dynamiskt omfång för att rapportera [kalcium] runt ett Kd (kalcium) på 345 nM, vilket gör den lämplig för att mäta fysiologiskt relevanta kalcium förändringar i en rad olika celler. Exciteringen av Fluo-4 uppträder vid 488 nm och fluorescensemissionen mäts vid 525 nm 11. Fluorimeters såsom fluorescens avbildningsplattläsare (FLIPR) 23, den Novostar eller FlexStation (stationsanordningen) 12 är medium / high-throughput system som tillåter samtidig förening addition och detekteringen av Fluo-4 signal vid receptoraktivering för varje brunn i en analysplatta. Den kalciummobilisering analysen beskriven här förlitar sig på stationenenheten 96-brunnars mikrosystemet. Den SoftMax Pro (mjukvara) används för att driva stationen enheten samt för analys av data. Programmet visar omedelbart resultatet som diagram i 96-brunnsformat. Flera brunnar kan väljas samtidigt för att jämföra resultaten av dessa brunnar i samma diagram. Den relativa fluorescerande enhet (RFU)-värden för brunnar i varje kolumn samtidigt mäts under en period av två minuter, med början före tillsatsen av föreningarna till brunnarna och fortsätter efter mätning av den fluorescerande signalen följande receptoraktivering. Typiskt, utvecklingen av en agonist kurvan sammanfaller med baslinje tills en aktiverande förening sättes till cellerna, vilket resulterar i en snabb ökning av fluorescenssignalen. Den topphöjden är korrelerad med den slutliga agonistkoncentrationen i brunnen. Efter toppen, droppar den fluorescerande signalen långsamt mot baslinjenivån. Det RFU mätningar can omvandlas till koncentration-responskurvor för att bestämma EC50-värdet (halva maximala effektiva koncentrationen) av en ligand. I allmänhet är åtminstone tre oberoende skärmar, var och en innefattar tre kopior av en koncentrationsserie, ska utföras för att komponera en tillförlitlig koncentration-responskurva. Det rekommenderas att inkludera flera positiva och negativa kontroller i experimentell design. Först av allt, en transfektion kontroll, dvs genomförande av en receptor med en känd ligand, bör testas. Detta gör det möjligt att kontrollera om den transfektion agenten var i drift. Inkorporering av ett kontrollförsök med en agonist för en endogen receptor av cellinjen och en negativ kontroll (t.ex. tvättbuffert) rekommenderas också för att övervaka hälsan och livskraften hos cellerna och för att utesluta möjligheten att tvättbufferten var kontaminerad med en faktor som skulle kunna framkalla ett auto fluoredoft svar. Ofta använda agonister är en peptid härledd från det proteas-aktiverad receptor-1 (PAR 1), som verkar som en PAR en selektiv agonist, eller karbakol, som aktiverar den acetylkolinreceptorn. Celler transfekterade med en tom expressionsvektor bör också testas för att utesluta att aktiva föreningar interagerar med cellens endogena receptorer. Optimering av flera parametrar som beskrivs i protokollet nedan kan krävas för olika signalsystem. En schematisk figur av den fullständiga fluorescensbaserad kalciummobilisering analysen visas i Figur 1. <img alt="Figur 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51516/51516fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51516/51516fig1.jpg" /> Figur 1. Övergripande schema över fluorescensbaserade kalciummobilisering analys. Automatiserad vätskehantering och samtidig fluorescensmätningar utförs med stationenenhet mikroplattläsare, som drivs av programvaran. Stationen enheten innehåller tre lådor, en för cellplattan, förening plattan och dricks rack. Utbyggnaden i pipett överför föreningar från en kolumn av föreningen plattan till motsvarande kolumnen i cellplattan (steg 1). Varje brunn av cellplattan innehåller ett monolager av HEK293T celler som har co-transfekterade med GPCR av intresse och den promiskuösa Ga 16 subenhet. När en förening som aktiverar receptorn, är Ga-16-bunden BNP ersättas av GTP. The Ga 16 subenhet dissocierar därefter från Gβγ komplexet och aktiverar fosfolipas Cp (PLCβ), vilket i sin tur hydrolyserar fosfatidylinositol bisfosfat (PIP2) vilket resulterar i diacylglycerol (DAG) och inositol-trifosfat (IP3). IP 3 aktiverar IP-3-beroende kalciumkanaler som är närvarande i membranet i det endoplasmatiska retiklet, vilket inducerar frisättningen av kalcium into cytoplasman. Interaktionen av kalcium med Fluo-4 (med vilket cellerna lagras inför till förening addition) resulterar i en fluorescenssignal (steg 2). Programmet presenteras resultaten som relativa fluorescerande enhet (RFU)-värden som funktion av tiden, och topphöjderna korrelerar med liganden koncentration på ett koncentrationsberoende sätt. Dessa data kan sedan omvandlas till en koncentration-responskurva för att bestämma EC50-värdet på ett ligand-receptorparet (steg 3).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="610">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">HEK293T cells</td>
			<td style="width:109px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td style="width:109px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D8537</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Trypsin-EDTA solution (0.25%)</td>
			<td style="width:109px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">T4049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:215px;">Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA)</td>
			<td style="width:109px;">MP Biomedicals</td>
			<td style="width:119px;">195173</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:215px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium - high glucose&#160; (DMEM)</td>
			<td style="width:109px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D5796</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td style="width:109px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">F7524</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Penicillin-Streptomycin (P-S)</td>
			<td style="width:109px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P4333</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;width:215px;">jetPRIME</td>
			<td style="width:109px;">Polyplus transfection</td>
			<td style="width:119px;">114-01</td>
			<td style="width:167px;">FuGENE HD Transfection Reagent (Promega); Lipofectamine LTX &#38; Plus Reagent (Life technologies)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Dialyzed Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td style="width:109px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">F0392</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Fibronectin from human plasma</td>
			<td style="width:109px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">F0895</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Reagent A100, Lysis buffer</td>
			<td style="width:109px;">Chemometec</td>
			<td style="width:119px;">910-0003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Reagent B, Stabilizing buffer</td>
			<td style="width:109px;">Chemometec</td>
			<td style="width:119px;">910-0002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:215px;">CaCl2</td>
			<td style="width:109px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">C3881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">HEPES</td>
			<td style="width:109px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>H4034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td style="width:109px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">HBSS buffer: Hank&#39;s Balanced Salt Solution</td>
			<td style="width:109px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>H8264</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Probenecid</td>
			<td style="width:109px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P8761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">NaOH (1 M)</td>
			<td>Vel</td>
			<td>2781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Pluronic acid</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P-3000MP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Dimethyl-sulfoxide (DMSO)</td>
			<td style="width:109px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D8418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:215px;">Fluo-4 AM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>F14201</td>
			<td style="width:167px;">Fluo-3, Rhod-2, Fluo-5, Calcium Green-1,.. (Invitorgen)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">TPP tissue culture flasks (T-75 and T-150)</td>
			<td style="width:109px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">Z707503 and Z707554</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:215px;">FlexStation device</td>
			<td style="width:109px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">NOVOstar (BMG Labtechnologies); FLIPR (Fluorometric Imaging Plate Reader) (Molecular Devices)</td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:215px;">Black-walled polystyrene plates (96 wells) with clear bottom</td>
			<td style="width:109px;">Greiner Bio-One</td>
			<td style="width:119px;">655090</td>
			<td style="width:167px;">Corning 96 well flat clear bottom black polystyrene poly-D-lysine coated microplates</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">NucleoCassette</td>
			<td style="width:109px;">Chemometec</td>
			<td style="width:119px;">941-0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">NucleoCounter NC-100</td>
			<td style="width:109px;">Chemometec</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Microcentrifuge tubes, siliconized</td>
			<td style="width:109px;">BioCision</td>
			<td style="width:119px;">BCS-2470</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Polystyrene V-shaped 96-well plates</td>
			<td style="width:109px;">Greiner Bio-One</td>
			<td>651101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">96-Well, FlexStation Pipet Tips</td>
			<td style="width:109px;">Molecular Devices</td>
			<td>9000-0912</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Soft Max Pro software</td>
			<td style="width:109px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

characterization of g protein-coupled receptors by a fluorescence-based calcium mobilization assay

För mer än 20 år, har omvänd farmakologi varit den mest framstående strategi för att upptäcka de aktiverande ligander av föräldralösa G-proteinkopplade receptorer (GPCRs). Uppkomsten av en omvänd farmakologi analysen är kloningen och efterföljande transfektion av en GPCR av intresse i ett cellulärt expressionssystem. Den heterologa uttryckta receptorn utmanades sedan med en förening bibliotek av kandidatligander för att identifiera receptor-aktiverande ligand (er). Receptoraktivering kan bedömas genom mätning av förändringar i koncentrationen av andra budbärare reportermolekyler, såsom kalcium-eller cAMP. Den fluorescens-baserade kalciummobilisering analys som beskrivs här är en ofta använd medel genomströmning vända farmakologi analys. Den anonyma GPCR transient uttryckt i humana embryonala njur-293T (HEK293T)-celler och en promiscuous Ga-16-konstruktionen samtransfekteras. Efter ligandbindning, aktivering av Ga-16-subenheten inducerar frisättningen av kalcium firom det endoplasmatiska retiklet. Före ligand screening, är receptoruttryckande celler laddade med en fluorescerande indikator kalcium, Fluo-4 acetoximetyl. Fluorescenssignalen av Fluo-4 är försumbar i celler under vilande betingelser men kan amplifieras mer än en 100-faldig vid interaktionen med kalciumjoner som frisätts efter receptoraktivering. Den beskrivna tekniken kräver inte den tidskrävande etablering av stabilt transfekterade cellinjer i vilka den transfekterade genetiska materialet är integrerat i värdcellgenomet. Istället kan en transient transfektion, generera tillfälligt uttryck av målgenen, är tillräcklig för att utföra screeningsanalys. Installationen gör mellan throughput screening av hundratals föreningar. Co-transfektion av promiscuous Ga-16, som är kopplad till de flesta GPCR: er, ger den intracellulära signaleringsvägen som skall omriktas mot frisättningen av kalcium, oberoende av den nativa signalväg i endogen instningar. De HEK293T cellerna är lätta att hantera och har bevisat sin effektivitet genom åren i receptor deorphanization analyser. Emellertid kan en optimering av analysen för specifika receptorer förblir nödvändigt.

Koncentration serien sträcker sig från 50 ^ M till 0,001 nM testades för alla fyra Drosophila sNPF peptider (Drome-sNPF-1: AQRSPSLRLRFamide, Drome-sNPF-2: SPSLRLRFamide, Drome-sNPF-3: PQRLRWamide, Drome-sNPF-4: PMRLRWamide) på HEK293T celler som övergående uttrycker Drosophila sNPF receptorn och promiskuösa Ga 16 subenhet. The GPCR aktiverades genom alla fyra peptider i slutkoncentrationer på upp till 0,1 nM och receptoraktivering var koncentrationsberoende. Figur 2 visar grafer som motsvarar en av tre kopior av den Drome-sNPF-en koncentrationsserie. Den negativa kontrollen (tvättbuffert) inducerade inte en fluorescerande signal, medan den positiva kontrollen (PAR 1 - 1 pM) framkallade en stark aktivering av det endogena proteaset-aktiverad receptor-1, vilket leder till en hög fluorescenssignal (± 30000 RFU). Det bör noteras att en avvikelse avden typiska kurvan kan indikera avvikelser. Till exempel kan en pågående ökning av kurvan utan att återvända till baslinjen vara relaterade till icke-receptor-medierade signaler, såsom förekomsten av kalciumjonoforer, eller en störd membranet orsakar kalciumläckage. Mjukvaran gör det möjligt att skriva in formler för att bestämma den andel av aktivering eller standardfelen för de olika koncentrationer bland annat. De resulterande data används för att komponera preliminära koncentration-responskurvor för att beräkna EC50-värden, såsom visas för de fyra Drome-sNPF peptider i Fig. 3. Kurvorna i Figur 3 inkluderar även data för den negativa kontrollen där koncentrationen serie de Drome-sNPF peptider testades på HEK293T celler transfekterade med en tom pcDNA3.1 vektor. Resultaten indikerar att tillsatsen av peptiderna till dessa celler har ingen effekt på endogena receptorer, men sannerligen activåt receptorn av intresse. Fluorescensbaserade kalciummobilisering analysen upprepades sedan tre gånger oberoende av varandra. På grundval av de preliminära koncentration-responskurvor för den första skärmen, de testade koncentrationerna anordnat att täcka det dynamiska området hos kurvan (fig. 4). EC50-värdena för Drome-sNPF-1 (2,04 ± 1,48 nM [95% konfidens-intervall]), Rhone-sNPF-2 (5,89 ± 3,74 nM), Rhone-sNPF-3 (5,55 ± 3,95 nM) och Drome-sNPF- 4 (0,50 ± 1,01 nM) är liknande, vilket indikerar att de är lika potenta att aktivera receptorn. <img alt="Figur 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51516/51516fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51516/51516fig2.jpg" /> Figur 2. Grafisk produktion av programvaran för en receptor-medierad fluorescens respons av en koncentration serie. Tolv slutliga koncentrationer (från 50 ^ M till 0,001 nM) of Drome-sNPF-1-peptid testades på Drome-sNPF receptorn. Aktivering uttrycks i relativa fluorescerande enhet (RFU) värden. Den övre grafen ger resultaten av de sex högsta koncentrationerna och den undre kurvan i de sex lägsta koncentrationerna. Den positiva kontrollen (+) är PAR 1 (1 M) och den negativa kontrollen (-) är tvättbuffert. <img alt="Figur 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51516/51516fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51516/51516fig3.jpg" /> Figur 3. Inledande koncentration-responskurvor för Drosophila sNPF peptider bestäms av en enda fluorescensbaserad kalciummobiliseringsanalys. De koncentration-responskurvor för Drosophila sNPF receptor uttrycktes transient i HEK293T celler för de fyra Drosophila sNPF peptider visas i blått. För de negativa kontrollerna (visas i rött), ades peptider testades på HEK293Tceller som transfekterats med en tom pcDNA3.1 vektor. De fluorescerande svaren visas som relativa (%) till det högsta värdet (100% aktivitet). Kurvorna är resultatet av ett experiment i vilket varje koncentrationsserie mättes i triplikat. De vertikala staplarna representerar standardfel av medelvärdet (SEM), som ibland är mindre än de som används symboler (i det fallet är det endast de symboler som avbildas). <img alt="Figur 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51516/51516fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51516/51516fig4.jpg" /> Figur 4. Koncentration-responskurvor och motsvarande EG-50 värden av Drosophila sNPF peptider bestäms av tre oberoende fluorescensbaserad kalciummobiliseringsanalyser. Koncentrations-responskurvor för Drosopihla sNPF receptorn transient uttryckta i HEK293T celler för de fyra Drosophila sNPF peptider är resultatet av tre oberoende migasurements varje utförd i tre exemplar (n ≥ 9). De fluorescerande svaren visas som relativa (%) till det högsta värdet (100% aktivitet). Asterisker indikerar koncentrationer för vilka n ≤ 9. Felstaplar visar SEM, som ibland är mindre än de som används symboler (i det fallet, bara de symboler som avbildas). EC 50-värden visas med deras 95% konfidensintervall.

Watch this Scientific Journal Video about Characterization of G Protein-coupled Receptors by a Fluorescence-based Calcium Mobilization Assay at JoVE.com

Characterization of G Protein-coupled Receptors by a Fluorescence-based Calcium Mobilization Assay

Den här beskrivna fluorescens-baserade kalciummobilisering analysen är en medel genomströmning omvänd farmakologi screening system för identifiering av funktionellt aktiverande ligand (er) av föräldralösa G-proteinkopplade receptorer (GPCRs).

Karaktärisering av G-proteinkopplade receptorer av en fluorescensbaserad kalciummobilisering Assay

For more than 20 years, reverse pharmacology has been the preeminent strategy to discover the activating ligands of orphan G protein-coupled receptors ...

Education

Research

JoVE Core

JoVE Journal

Cell Biology

Molecular Biology

Biology

Unit 2

Unit 1

Cell Signaling Pathways

Signaling Networks of G Protein-coupled Receptors

SCIENTISTS IN ACTION

In vivo Quantification of G Protein Coupled Receptor Interactions using Spectrally Resolved Two-photon Microscopy

In vivo Quantification of G Protein Coupled Receptor Interactions using Spectrally Resolved Two-photon Microscopy

In vivo Kvantifiering av G Tillsammans Interaktioner protein receptor med spektralt korrigerats inom två-photon Mikroskopi

The study of protein interactions in living cells is an important area of research because the information accumulated both benefits industrial ...

Imaging G-protein Coupled Receptor (GPCR)-mediated Signaling Events that Control Chemotaxis of Dictyostelium Discoideum

Imaging G-protein Coupled Receptor GPCR-mediated Signaling Events that Control Chemotaxis of Dictyostelium Discoideum

Imaging G-proteinkopplade receptor (GPCR)-medierad signalering Händelser som Kontroll chemotaxis av Dictyostelium Discoideum</em

Many eukaryotic cells can detect gradients of chemical signals in their environments and migrate accordingly 1.  This guided cell migration is referred as ...

Quantifying Agonist Activity at G Protein-coupled Receptors

Kvantifiera agonist vid G-protein-kopplade receptorer

When an agonist activates a population of G protein-coupled receptors (GPCRs), it elicits a signaling pathway that culminates in the response of the cell ...

Fluorescence-based Measurement of Store-operated Calcium Entry in Live Cells: from Cultured Cancer Cell to Skeletal Muscle Fiber

Fluorescens-baserad Mätning av Store-drivs kalcium Entry i levande celler: från odlade Cancer Cell till skelettmuskulatur Fiber

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to ...

Genetically-encoded Molecular Probes to Study G Protein-coupled Receptors

Genetiskt kodade molekylära sonder för att studera G-proteinkopplade receptorer

To facilitate structural and dynamic studies of G protein-coupled receptor (GPCR) signaling complexes, new approaches are required to introduce ...

A Fluorescence-based Exonuclease Assay to Characterize DmWRNexo, Orthologue of Human Progeroid WRN Exonuclease, and Its Application to Other Nucleases

WRN exonuclease is involved in resolving DNA damage that occurs either during DNA replication or following exposure to endogenous or exogenous genotoxins. ...

Visualizing Clathrin-mediated Endocytosis of G Protein-coupled Receptors at Single-event Resolution via TIRF Microscopy

Visualisera clathrin medierad endocytos av G-proteinkopplade receptorer på Single-event upplösning via TIRF Mikroskopi

Many important signaling receptors are internalized through the well-studied process of clathrin-mediated endocytosis (CME). Traditional cell biological ...

Imaging G Protein-coupled Receptor-mediated Chemotaxis and its Signaling Events in Neutrophil-like HL60 Cells

Imaging G-proteinkopplad receptor-medierad kemotaxi och dess signaleringshändelser i neutrofil-liknande HL60-celler

Eukaryotic cells sense and move towards a chemoattractant gradient, a cellular process referred as chemotaxis. Chemotaxis plays critical roles in many ...

G Protein-selective GPCR Conformations Measured Using FRET Sensors in a Live Cell Suspension Fluorometer Assay

G-protein-selektiva GPCR konforma mäts med hjälp av FRET sensorer i en levande cell Suspension Fluorometer analys

F&#1255;rster resonance energy transfer (FRET)-based studies have become increasingly common in the investigation of GPCR signaling. Our research group ...

Detection of Ligand-activated G Protein-coupled Receptor Internalization by Confocal Microscopy

Detektering av ligand-aktiverade G-proteinkopplade receptorer Interna genom konfokalmikroskopi

Confocal laser scanning microscopy (CLSM) is an optical imaging technique for high-contrast imaging. It is a powerful approach to visualize fluorescent ...