Name: an efficient method for quantitative, single-cell analysis of chromatin modification and nuclear architecture in whole-mount ovules in arabidopsis
Uploaded: 2014-06-19T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Efficient Method for Quantitative, Single-cell Analysis of Chromatin Modification and Nuclear Architecture in Whole-mount Ovules in Arabidopsis at JoVE.com

We thank Ueli Grossniklaus (University of Z&#252;rich) for technical and financial support. We are thankful to Valeria Gagliardini, Christof Eichenberger, Arturo Bolanos and Peter Kopf for general lab support. This research was funded by the University of Z&#252;rich, grants from the Swiss National Foundation to CB (31003A_130722) and Ueli Grossniklaus (31003A_141245 and 31003AB-126006), and the Agence Nationale de la Recherche to DG (Programme ANR-BLANC-2012).

ההליך מתואר בזרימת העבודה באיור 1, וההתקנה לנתיחה והטבעה של רקמות מוצגות באיור 2. 1. קיבוע רקמות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף 20-30 carpels בצינור microfuge המכיל חיץ מקבע BVO טרי על קרח. </li><li style=";text...

<ol>
	<li>Maheshwari, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> An introduction to the embryology of angiosperms. , (1950).</li><li>Schmidt, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptome+analysis+of+the+Arabidopsis+megaspore+mother+cell+uncovers+the+importance+of+RNA+helicases+for+plant+germline+development.">Transcriptome analysis of the Arabidopsis megaspore mother cell uncovers the importance of RNA helicases for plant germline development.</a> PLoS Biol. 9 (9), (2011).</li><li>Schmidt, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+powerful+method+for+transcriptional+profiling+of+specific+cell+types+in+eukaryotes:+laser-assisted+microdissection+and+RNA+Sequencing.">A powerful method for transcriptional profiling of specific cell types in eukaryotes: laser-assisted microdissection and RNA Sequencing.</a> PLoS One. 7 (1), (2012).</li><li>Wuest, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arabidopsis+female+gametophyte+gene+expression+map+reveals+similarities+between+plant+and+animal+gametes.">Arabidopsis female gametophyte gene expression map reveals similarities between plant and animal gametes.</a> Curr Biol. 20 (6), 506-512 (2010).</li><li>Koornneef, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytogenetic+tools+for+Arabidopsis+thaliana.">Cytogenetic tools for Arabidopsis thaliana.</a> Chromosome Res. 11 (3), 183-194 (2003).</li><li>Oliver, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dynamics+of+histone+H3+modifications+is+species-specific+in+plant+meiosis.">The dynamics of histone H3 modifications is species-specific in plant meiosis.</a> Planta. 238 (1), 23-33 (2013).</li><li>Ravi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Meiosis-specific+loading+of+the+centromere-specific+histone+CENH3+in+Arabidopsis+thaliana.">Meiosis-specific loading of the centromere-specific histone CENH3 in Arabidopsis thaliana.</a> PLoS Genet. 7 (6), (2011).</li><li>Borges, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reprogramming+the+epigenome+in+Arabidopsis+pollen.">Reprogramming the epigenome in Arabidopsis pollen.</a> Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 77, 1-5 (2012).</li><li>Pandey, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+alterations+during+pollen+development+in+Hordeum+vulgare.">Chromatin alterations during pollen development in Hordeum vulgare.</a> Cytogenet Genome Res. 141 (1), 50-57 (2013).</li><li>Schoft, V. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+RNA-directed+DNA+methylation+upon+decondensation+of+constitutive+heterochromatin.">Induction of RNA-directed DNA methylation upon decondensation of constitutive heterochromatin.</a> EMBO Rep. 10 (9), 1015-1021 (2009).</li><li>Barrell, P. J., Grossniklaus, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confocal+microscopy+of+whole+ovules+for+analysis+of+reproductive+development:+the+elongate1+mutant+affects+meiosis+II.">Confocal microscopy of whole ovules for analysis of reproductive development: the elongate1 mutant affects meiosis II.</a> Plant J. 43 (2), 309-320 (2005).</li><li>Braselton, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feulgen+staining+of+intact+plant+tissues+for+confocal+microscopy.">Feulgen staining of intact plant tissues for confocal microscopy.</a> Biotech. Histochem. 71, 84-87 (1996).</li><li>Scott, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parent-of-origin+effects+on+seed+development+in+Arabidopsis+thaliana.">Parent-of-origin effects on seed development in Arabidopsis thaliana.</a> Development. 125, 3329-3341 (1998).</li><li>Armstrong, S. J., Jones, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Female+meiosis+in+wild-type+Arabidopsis+thaliana+and+in+two+meiotic+mutants.">Female meiosis in wild-type Arabidopsis thaliana and in two meiotic mutants.</a> Sex Plant Reprod. 13, 177-183 (2001).</li><li>Grimanelli, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterochronic+expression+of+sexual+reproductive+programs+during+apomictic+development+in+Tripsacum.">Heterochronic expression of sexual reproductive programs during apomictic development in Tripsacum.</a> Genetics. 165, 1521-1531 (2003).</li><li>Gutierrez-Marcos, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maternal+gametophytic+baseless1+is+required+for+development+of+the+central+cell+and+early+endosperm+patterning+in+maize+(Zea+mays).">Maternal gametophytic baseless1 is required for development of the central cell and early endosperm patterning in maize (Zea mays).</a> Genetics. 174 (1), 317-329 (2006).</li><li>Niedojad&#322;o, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosomal+RNA+of+Hyacinthus+orientalis+L.+female+gametophyte+cells+before+and+after+fertilization.">Ribosomal RNA of Hyacinthus orientalis L. female gametophyte cells before and after fertilization.</a> Planta. 236, 171-184 (2012).</li><li>Williams, J. H., Friedman, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+four-celled+female+gametophyte+of+Illicium+(Illiciaceae;+Austrobaileyales):+Implications+for+understanding+the+origin+and+early+evolution+of+monocots,+eumagnoliids,+and+eudicots.">The four-celled female gametophyte of Illicium (Illiciaceae; Austrobaileyales): Implications for understanding the origin and early evolution of monocots, eumagnoliids, and eudicots.</a> Am J Bot. 91 (3), 332-351 (2004).</li><li>Bass, H. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomeres+cluster+de+novo+before+the+initiation+of+synapsis:+a+three-dimensional+spatial+analysis+of+telomere+positions+before+and+during+meiotic+prophase.">Telomeres cluster de novo before the initiation of synapsis: a three-dimensional spatial analysis of telomere positions before and during meiotic prophase.</a> J Cell Biol. 137 (1), 5-18 (1997).</li><li>Howe, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+acrylamide+fluorescence+in+situ+hybridization+for+plant+cells.">Three-dimensional acrylamide fluorescence in situ hybridization for plant cells.</a> Methods Mol Biol. 990, 53-66 (2013).</li><li>She, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+reprogramming+during+the+somatic-to-reproductive+cell+fate+transition+in+plants.">Chromatin reprogramming during the somatic-to-reproductive cell fate transition in plants.</a> Development. 140 (19), 4008-4019 (2013).</li><li>Pillot, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryo+and+endosperm+inherit+distinct+chromatin+and+transcriptional+states+from+the+female+gametes+in+Arabidopsis.">Embryo and endosperm inherit distinct chromatin and transcriptional states from the female gametes in Arabidopsis.</a> Plant Cell. 22 (2), 307-320 (2010).</li><li>Borlinghaus, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MRT+letter:+high+speed+scanning+has+the+potential+to+increase+fluorescence+yield+and+to+reduce+photobleaching.">MRT letter: high speed scanning has the potential to increase fluorescence yield and to reduce photobleaching.</a> Microsc Res Tech. 69 (9), 689-692 (2006).</li><li>Autran, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maternal+epigenetic+pathways+control+parental+contributions+to+Arabidopsis+early+embryogenesis.">Maternal epigenetic pathways control parental contributions to Arabidopsis early embryogenesis.</a> Cell. 145 (5), 707-719 (2011).</li><li>Fransz, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interphase+chromosomes+in+Arabidopsis+are+organized+as+well+defined+chromocenters+from+which+euchromatin+loops+emanate.">Interphase chromosomes in Arabidopsis are organized as well defined chromocenters from which euchromatin loops emanate.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 99 (22), 14584-14589 (2002).</li><li>Cox, W. G., Singer, V. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+DNA+hybridization+probe+preparation+using+amine+modification+and+reactive+dye+coupling.">Fluorescent DNA hybridization probe preparation using amine modification and reactive dye coupling.</a> BioTechniques. 36 (1), 114-122 (2004).</li><li>Lysak, M., Salinas, J., Sanchez-Serrano, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Cytogenetic analyses of Arabidopsis In Arabidopsis Protocols: Methods in Molecular Biology, 2nd ed. , 173-186 (2006).</li><li>Chieco, P., Derenzini, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Feulgen+reaction+75+years+on.">The Feulgen reaction 75 years on.</a> Histochem Cell Biol. 111 (5), 345-358 (1999).</li><li>Suzuki, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+staining+for+fluorescence+and+laser+confocal+microscopy.">DNA staining for fluorescence and laser confocal microscopy.</a> J Histochem Cytochem. 45 (1), 49-53 (1997).</li><li>Egelhofer, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+assessment+of+histone-modification+antibody+quality.">An assessment of histone-modification antibody quality.</a> Nat Struct Mol Biol. 18 (1), 91-93 (2011).</li><li>Bauwens, S., Oostveldt, P. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+mount+fluorescence+in+situ+hybridization+(FISH)+of+repetitive+DNA+sequences+on+interphase+nuclei+of+the+small+cruciferous+plant+Arabidopsis+thaliana.">Whole mount fluorescence in situ hybridization (FISH) of repetitive DNA sequences on interphase nuclei of the small cruciferous plant Arabidopsis thaliana.</a> Procedures for In Situ Hybridization to Chromosomes, Cells, and Tissue Sections. Nonradioactive in situ hybridization application manual. , 165-171 (1996).</li></ol>

בצמחים פורחים, שושלת הרבייה הנשית מוקפת בכמה שכבות תאים הכוללים nucellus וteguments הביצית, ובכך הופכת את צביעת ציטולוגית בכל הר מאתגר מבחינה טכנית. כאן אנו מציגים פרוטוקול יעיל המאפשר העריכה ולעיבוד של מספר רב של ביציות מתאימות לצביעת ציטולוגית כגון immunostaining, מכתים DNA וקרינת...

בצמחים פורחים, הקמת שושלות רבייה מתחילה בבידול של SMCs, MMC הנשי ותא האם נבגון גברי. MMC מתפתח מתא nucellar תת אפידרמיס בקצה הדיסטלי של primordium הביצית, והתא האם נבגון מתפתח מרקמת sporogenous במאבק locule, אשר ממוקמים עמוק בתוך האיברים פרחוניים 1. SMCs לעבור מיוזה לייצר נבגים הפלואידים, אשר לאחר מכן להצמיח gametophytes על מיטוזה. נקבת gametophyte, או שק עובר, מורכב מתא אחד ביצה, תא מרכזי אחד, שתיים ושלוש synergids antipodals. Gametophyte הגברי, או האבקה, מורכבת מתא אחד של צמח ושני תאי זרע. בעוד gametophyte הזכר נשאר מחקר אובייקט-of-יחסית נגיש, הנשי gametophyte מוטבע בתוך הביצית, את עצמו מוקף בcarpel הפרח, ובכך מציב אתגרים ספציפיים לניתוחים מולקולריים וציטולוגיה. לאחרונה, עם זאת, בסיוע לייזרmicrodissection הציע פתרון אלגנטי המאפשר transcriptomic מנתח בMMC ותאי gametophytic הנשיים 2-4. בנוסף לביטוי גני מועמד מנתח, תוך שימוש למשל RNA הכלאה באתר או מבחני גן כתב, ניתוחי ציטולוגית מאפשר חוקרים את הדינמיקה של מרכיבים תאיים אנדוגני באמצעות מכתים ספציפי ישיר הסלולר או immunostaining העקיף. במיוחד, מכתים ציטוגנטית באמצעות דגים ומכתימים-DNA, יחד עם immunostaining של שינויי הכרומטין או רכיבי הכרומטין גישות מרכזיות על מנת להבהיר דינמיקת הכרומטין וארגון גרעיני בארבידופסיס 5. בדרך כלל, מיוזה כרוכה דינמיקה של כרומוזום מסוימת שנחקרה היטב בזכר מפעל meiocytes 6,7; בקנה מידה גדול עוד יותר, ארגון מחדש הכרומטין תא ספציפי, סביר המשקף את תכנות מחדש אפיגנטיים דינמי תוארה במהלך התפתחות אבקת 8-10. לעומת זאת, בשללנגישות היחסית של נקבת meiocyte וgametophyte, החקירות אלה נשארים קשות מבחינה טכנית ליישם, ולעתים קרובות דורשות נתיחת חתך או הוראות ועיכול אנזימטי (ראה להלן). בנוסף, חוסר הרווח של בהירות אופטית בכל ההר הוא מכשול להדמיה ברזולוציה גבוהה של תאי רבייה בביציות ללא פגע. שיטה קלאסית לניתוח ציטולוגית של ארגון כרומוזום בביציות כל הר משתמשת בהכתמה של Feulgen 11-13. זה כרוך הידרוליזה חומצה (באמצעות חומצת hypochlorous) של ה-DNA שתוצאת denaturation חלבון ובכך גורם להרס של מבנה הכרומטין. לחלופין, ארגון כרומוזום בmeiocytes הנשי ותאי gametophytic ניתן לצפות באמצעות מכתים DAPI וimmunostaining על סעיפי חצי דקים או שקי עובר גזורים וMMC (למשל לראות 14-18). עם זאת, ברור נתיחה וחתך במדריך יכולים להיות עבודה אינטנסיבית ופוגע בניתוח האיכותי וכמותי של מספר גדול של אפיטופים הכרומטין. כאן אנו מספקים פרוטוקול יעיל להכין מספר גדול של ביציות ארבידופסיס מתאימות למגוון של מכתים ציטולוגית במורד הזרם בכל ההר. בקיצור, ניצני פרחים מודגרת בפתרון מקבע, שורות של ביציות הם גזורים מcarpel והמשובצת בacrylamide בשקופית כפי שנעשו לmeiocytes האבקה 19,20. הביציות מוטבעות נמחקות נוספת וקבוע במתנול, אתנול, וקסילן לפני דופן תא עיכול וpermeabilization. וריאציות אפשריות של צעדים אלה הם דנו. הדגימות לאחר מכן ניתן להשתמש עבור מכתים DNA, immunostaining, ודגים. מצב ההכנה הוא יעיל ומאפשר לניסוי הגדרה מקבילה (אפשר להכין עד 16 שקופיות ביום לניתוח במורד הזרם שונה). הטיפולים שתוארו יאפשר אותות הומוגנית בכל ההר והשתמרו היסטולוגית, סלולארי טוב,וארגון גרעיני בתאי רבייה ותאים המקיפים nucellar אשר נהנים השוואות איכותיות וכמותית בין סוגי תאים. מכויל, הדמיה ברזולוציה גבוהה המבוססת על CLSM ואחריו שחזור 3 ממדים מאפשרת מדידת כמותית משמעותית של אותות ניאון. אנחנו השתמשנו בהצלחה בהליך זה כדי לנתח את דינמיקת הכרומטין בMMC ההבחנה 21 ופיתוח נשי gametophyte 22; אנו מציגים כאן תוצאות נציג של ניתוח heterochromatin, immunostaining הכרומטין, immunostaining GFP ודגים בביציות כל הר. בנוסף, אנו מאמינים כי הפרוטוקול שלנו יהיה מתאים לרקמות צמח אחרות ומינים.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="993">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;"><a name="RANGE!A1:D39">Name of Material/ Equipment</a></td>
			<td style="width:135px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:481px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Solutions</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:481px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">BVO Fixation Buffer (based on32)</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:481px;">2mM EGTA, pH7.5, 1% (v/v) Formaldehyde,10% DMSO, 1&#215; PBS, 0.1% Tween-20</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PBT</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:481px;">1&#215; PBS, 0.1% Tween-20</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PBT-F</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:481px;">1&#215; PBT, 2.5% (v/v) formaldehyde</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">30% acrylamide:bisacrylamide&#160;</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:481px;">3g acrylamide, 0.33g bisacrylamide, 1&#215; PBS (prepare 10ml, store at 4&#176;C)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">200mL&#160; 5% acrylamide mix in PBS&#160;</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:481px;">34mL 30% acrylamide:bisacrylamide, 166mL 1&#215; PBS (make fresh from 30% stock)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">20% ammoniumpersulfte&#160;</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:481px;">0.2g ammoniumpersulfte, 1mL sterile water (prepare aliquots with 1mL and store at -20&#176;C)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">20% sodium sulfite&#160;</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:481px;">0.2g sodium sulfite, 1mL sterile water (prepare aliquots with 1mL and store at -20&#176;C)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cell wall enzyme mix</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:481px;">0.5% (w/v) cellulase, 1% (w/v) driselase, 0.5% (w/v) pectolyase</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;"></td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:481px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Reagents and Materials</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:481px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Formaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F1635</td>
			<td style="width:481px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMSO</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D5879</td>
			<td style="width:481px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tris</td>
			<td>Amaresco</td>
			<td>0497</td>
			<td style="width:481px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethanol</td>
			<td>Schaurlau</td>
			<td>ET00102500</td>
			<td style="width:481px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Methanol</td>
			<td>Schaurlau</td>
			<td>ME03062500</td>
			<td style="width:481px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Xylene</td>
			<td>ROTH</td>
			<td>4436.1</td>
			<td style="width:481px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cellulase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>1794</td>
			<td style="width:481px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Driselase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8037</td>
			<td style="width:481px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pectolyase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5936</td>
			<td style="width:481px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tween-20</td>
			<td>Merck</td>
			<td>8.22184.0500</td>
			<td style="width:481px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EGTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E-4378</td>
			<td style="width:481px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">acrylamide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A-3553</td>
			<td style="width:481px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">bisacrylamide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M2022</td>
			<td style="width:481px;">toxic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ammoniumpersulfate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9164</td>
			<td style="width:481px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium sulfite</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>71988</td>
			<td style="width:481px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-trimethyl-Histone H3 (Lys4)</td>
			<td>Upstate</td>
			<td>07-473</td>
			<td style="width:481px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti- monomethyl-Histone H3 (Lys27)</td>
			<td>Upstate</td>
			<td>07-448</td>
			<td style="width:481px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Alexa Fluor 488~goat ~anti ~rabbit (H+L)</td>
			<td>Molecular Probe</td>
			<td>A11008</td>
			<td style="width:481px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ProlongGold</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P36934</td>
			<td style="width:481px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Propidium iodide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4170</td>
			<td style="width:481px;">toxic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DAPI</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9542</td>
			<td style="width:481px;">toxic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RNAse A</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10109169001</td>
			<td style="width:481px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Coplin jar</td>
			<td>Huber &#38; CO</td>
			<td>10.055</td>
			<td style="width:481px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Forceps</td>
			<td>DUMONT BIOLOGY</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:481px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Shaker</td>
			<td>Heidolph</td>
			<td>543-12310-00-0</td>
			<td style="width:481px;"></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;">Moist chamber</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:481px;">A plastic box with damp paper towel inside, a plastic support is put into the box for supporting the slides and keep slides from the water.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Superfrost Plus slide</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>J1800AMNZ</td>
			<td style="width:481px;">Menzel-Gl&#228;ser</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FISH Tag DNA KIt</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>F32947</td>
			<td style="width:481px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">GFP booster</td>
			<td style="width:135px;">Chromotek</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:481px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an efficient method for quantitative, single-cell analysis of chromatin modification and nuclear architecture in whole-mount ovules in arabidopsis

בצמחים פורחים, המעבר גורל תא סומטי לרבייה מתאפיין במפרט של תאי אם נבג (SMCs) באיברים פרחוניים של הצמח הבוגר. נקבת SMC (תא האם megaspore, MMC) מבדיל בprimordium הביצית ועובר מיוזה. Megaspore הפלואידים שנבחר לאחר מכן עובר מיטוזה ליצירת הנשית gametophyte רב תאי, שיהיה להצמיח תאי הרבייה, תא הביצית ותא מרכזי, יחד עם תאי אבזר. הנגישות המוגבלת של MMC, meiocyte וgametophyte הנשי בתוך הביצית היא מאתגרת מבחינה טכנית לציטולוגיה וציטוגנטית מנתח ברמת תא בודדת. במיוחד, immunodetection ישיר או העקיף של אפיטופים סלולריים או גרעיניים נפגעים על ידי חדירה ירודה של חומרים כימיים בתוך ההדמיה תא צמח ותא בודד demised ידי חוסר הבהירות אופטית ברקמות כל הר. לכן, פיתחנו שיטה יעילה לנתח nuclארגון אוזן ושינוי הכרומטין ברזולוציה גבוהה של תא בודד בכל הר ביציות ארבידופסיס משובצים. היא מבוססת על נתיחה והטבעה של ביציות קבועות בשכבה דקה של ג&#39;ל acrylamide בשקופית מיקרוסקופית. הביציות מוטבעות חשופים לטיפולים כימיים והאנזימטית שמטרתן שיפור בהירות וחדירות רקמה לחומרים הכימיים immunostaining. טיפולים אלה לשמר אפיטופים ארגון, דנ&quot;א וחלבון תאיים והכרומטין. הדגימות יכולות לשמש לניתוחים שונים במורד הזרם ציטולוגית, כוללים immunostaining הכרומטין, הקרינה הכלאה באתרו (FISH), ומכתים DNA לניתוח heterochromatin. הדמיה מיקרוסקופית סריקת לייזר confocal (CLSM), עם רזולוציה גבוהה, ואחריו שחזור 3D מאפשרת למדידות כמותיות ברזולוציה תא בודד.

אנו מספקים פרוטוקול חזק להכנה בקנה מידה גדולה ועיבוד של ביציות ארבידופסיס מתאימות לצביעת ציטולוגית בכל ההר. הודות להטבעה, הביציות לשמר מבנה 3 ממדים (איור 3). יתר על כן, עיבוד הרקמות כולל הבהרה אופטית מאפשר מבני subcellular הדמיה ברזולוציה גבוהה. איור 4...

Watch this Scientific Journal Video about An Efficient Method for Quantitative, Single-cell Analysis of Chromatin Modification and Nuclear Architecture in Whole-mount Ovules in Arabidopsis at JoVE.com

An Efficient Method for Quantitative, Single-cell Analysis of Chromatin Modification and Nuclear Architecture in Whole-mount Ovules in Arabidopsis

שיטה יעילה לניתוח כמותי, תא בודד של הכרומטין שינוי ואדריכלות גרעינית בהר שלם-ביציות ב<em&gt; ארבידופסיס</em

אנו מספקים כאן פרוטוקול יעיל ואמין עבור immunostaining, הקרינה הכלאה באתר, מכתים DNA ואחרי הדמיה בביציות thaliana ארבידופסיס כל הר כמותיים, ברזולוציה גבוהה. שיטה זו השתמשה בהצלחה כדי לנתח שינויי הכרומטין ואדריכלות גרעינית.

In flowering plants, the somatic-to-reproductive cell fate transition is marked by the specification of spore mother cells (SMCs) in floral organs of the ...

Research

JoVE Journal

Biology

An Efficient Method for Quantitative, Single-cell Analysis of Chromatin Modification and Nuclear Architecture in Whole-mount Ovules in Arabidopsis

Double Whole Mount in situ Hybridization of Early Chick Embryos

הר שלם כפול באתרו הכלאה של עוברים צ&#39;יק מוקדם

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Method for Whole Mount Antibody Staining in Chick

שיטת מכתים נוגדן שלם הר ב צ&#39;יק

Single-cell Suction Recordings from Mouse Cone Photoreceptors

תא בודד יניקה הקלטות של photoreceptors קון עכבר

Rod and cone photoreceptors in the retina are responsible for light detection. In darkness, cyclic nucleotide-gated (CNG) channels in the outer segment ...

Hi-C: A Method to Study the Three-dimensional Architecture of Genomes.

Hi-C: שיטה לחקר ארכיטקטורה תלת ממדי של הגנום.

The three-dimensional folding of chromosomes compartmentalizes the genome and and can bring distant functional elements, such as promoters and enhancers, ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

הדמיה וניתוח של מולקולות ה-mRNA באמצעות הקרינה<em&gt; באתרו</em&gt; הכלאה ב<em&gt; Cerevisiae Saccharomyces</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Measuring Spatial and Temporal Ca2+ Signals in Arabidopsis Plants

Measuring Spatial and Temporal Ca2+ Signals in Arabidopsis Plants

מדידת מרחב ובזמן Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; אותות בצמחים ארבידופסיס

Developmental and environmental cues induce Ca2+ fluctuations in plant cells. Stimulus-specific spatial-temporal Ca2+ patterns are sensed by cellular Ca2+ ...

A Whole Mount In Situ Hybridization Method for the Gastropod Mollusc Lymnaea stagnalis

A Whole Mount In Situ Hybridization Method for the Gastropod Mollusc Lymnaea stagnalis

הר שלם<em&gt; באתרו</em&gt; כלת שיטה עבור חלזון הרכיכות<em&gt; Stagnalis Lymnaea</em

Whole mount in situ hybridization (WMISH) is a technique that allows for the spatial resolution of nucleic acid molecules (often mRNAs) within a ...

CUBIC Protocol Visualizes Protein Expression at Single Cell Resolution in Whole Mount Skin Preparations

פרוטוקול מעוקב מדמיין ביטוי החלבון ברזולוציה תא יחיד תכשירים לעור הר שלם

The skin is essential for our survival. The outer epidermal layer consists of the interfollicular epidermis, which is a stratified squamous epithelium ...

Visualization of 3D White Adipose Tissue Structure Using Whole-mount Staining

הדמיה של מבנה שומן לבן תלת-ממד באמצעות צביעת כולה-הר

Adipose tissue is an important metabolic organ with high plasticity and is responsive to environmental stimuli and nutrient status. As such, various ...

An Easy and Flexible Inoculation Method for Accurately Assessing Powdery Mildew-Infection Phenotypes of Arabidopsis and Other Plants

שיטת חיסון קלה וגמישה להערכה מדויקת של פנוטיפים של זיהום טחב אבקתי של ערבידופסיס וצמחים אחרים

Reducing crop losses due to fungal diseases requires improved understanding of the mechanisms governing plant immunity and fungal pathogenesis, which in ...