Name: semi-automated imaging of tissue-specific fluorescence in zebrafish embryos
Uploaded: 2014-05-17T17:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Semi-automated Imaging of Tissue-specific Fluorescence in Zebrafish Embryos at JoVE.com

نشكر سوزان المزارعين وموظفي البنك العربي المتحد الزرد مرفق البحوث لرعاية الزرد. التمويل التي تقدمها صناديق بدء من قسم علم الأدوية والسموم.

ملاحظة: تمت الموافقة على هذا البروتوكول من جامعة ألاباما في جنة رعاية الحيوان واستخدام المؤسسية برمنغهام. 1. تربية اسماك الزرد ومجموعات البيض <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل ثلاثة أيام من بداية التعرض للموا?...

<ol>
	<li>Molina, G., Watkins, S., Tsang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+FGF+reporter+transgenic+zebrafish+and+their+utility+in+chemical+screens.">Generation of FGF reporter transgenic zebrafish and their utility in chemical screens.</a> BMC Developmental Biology. 7, 62 (2007).</li><li>Perz-Edwards, A., Hardison, N. L., Linney, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoic+acid-mediated+gene+expression+in+transgenic+reporter+zebrafish.">Retinoic acid-mediated gene expression in transgenic reporter zebrafish.</a> Developmental Biology. , 89-101 (2001).</li><li>Gorelick, D. A., Halpern, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+Estrogen+Receptor+Transcriptional+Activation+in+Zebrafish.">Visualization of Estrogen Receptor Transcriptional Activation in Zebrafish.</a> Endocrinology. 152, 2690-2703 (2011).</li><li>Tsang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish:+A+tool+for+chemical+screens.">Zebrafish: A tool for chemical screens.</a> Birth Defects Research Part C: Embryo Today: Reviews. 90, 185-192 (2010).</li><li>Peravali, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+feature+detection+and+imaging+for+high-resolution+screening+of+zebrafish+embryos.">Automated feature detection and imaging for high-resolution screening of zebrafish embryos.</a> Biotechniques. 50, 319-324 (2011).</li><li>Walker, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+reporter+quantification+in+vivo:+high-throughput+screening+method+for+reporter-based+assays+in+zebrafish.">Automated reporter quantification in vivo: high-throughput screening method for reporter-based assays in zebrafish.</a> PLoS One. 7, (2012).</li><li>Vogt, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+image-based+phenotypic+analysis+in+zebrafish+embryos.">Automated image-based phenotypic analysis in zebrafish embryos.</a> Developmental Dynamics. 238, 656-663 (2009).</li><li>Vogt, A., Codore, H., Day, B. W., Hukriede, N. A., Tsang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+automated+imaging+and+analysis+for+zebrafish+chemical+screens.">Development of automated imaging and analysis for zebrafish chemical screens.</a> J. Vis. Exp. , (2010).</li><li>Gruber, C. J., Gruber, D. M., Gruber, I. M., Wieser, F., Huber, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomy+of+the+estrogen+response+element.">Anatomy of the estrogen response element.</a> Trends in Endocrinology and Metabolism. 15, 73-78 (2004).</li><li>Rovira, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+screen+identifies+FDA-approved+drugs+and+target+pathways+that+induce+precocious+pancreatic+endocrine+differentiation.">Chemical screen identifies FDA-approved drugs and target pathways that induce precocious pancreatic endocrine differentiation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 108, 19264-19269 (2011).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Zebrafish+Book:+A+guide+for+the+laboratory+use+of+zebrafish+(Danio+rerio).">The Zebrafish Book: A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio).</a> , (2000).</li></ol>

يصف هذا البروتوكول وسيلة مباشرة لتلقائيا صورة مضان الأنسجة محددة في الأجنة الزرد. وقد تم تطوير بروتوكول باستخدام زايس محوري المراقب. Z1 مع زن الأزرق 2011 برنامج، ولكن هذه التقنية يمكن تكييفها باستخدام أي مجهر مقلوب مع مرحلة الآلية وبرامج التحكم المجهر التي يمكن أن تؤدي...

وقد وضعت الزرد المعدلة وراثيا التي تسمح لرؤية مباشرة من النشاط في مسارات الإشارات، مثل عوامل نمو الخلايا الليفية 1، حمض الريتينويك 2 و 3 الاستروجين، في الأجنة الحية. هذه الأدوات تمكين الكشف عن المواد الكيميائية التي التشويش على مسارات إشارات (يعاير مثل تغير في كثافة مضان) أو المواد الكيميائية التي تعدل يشير بطريقة الأنسجة محددة (تغيير في مضان التعريب) 4. التقاط الصور الآلي يزيد من الإنتاجية بشكل كبير من شاشات الكيميائية 5،6. الشاشات التي مضان فحص تلقائيا في الزرد يعيش غالبا ما تعتمد على تكلفة، والمعدات المتخصصة. يوفر ما يسمى الفرز الفائق محتوى صالح ارتفاع القرار، والتصوير الكمي ولكن على حساب من استخدام لوحة القراء المتخصصة المجهزة لالمجهري متحد البؤر 7،8. الهدف من هذا الأسلوب هو تلقائيا مقايسة مضان الأنسجة محددة في الأجنة الزردفي لوحة 96 جيدا باستخدام مجهر epifluorescence القياسية. ويمكن تمييز مضان الأنسجة محددة باستخدام هذه التقنية، وربما يكون نهجا معقولا للمختبرات التي تفتقر إلى الوصول إلى القراء لوحة المتخصصة أو معدات الفحص العالية المحتوى. في هذا البروتوكول، ونحن نستخدم التصوير الآلي للكشف عن الأنسجة محددة مستقبلات هرمون الاستروجين (ER) منبهات في الزرد حية في 3 أيام بعد الإخصاب (DPF). خط المعدلة وراثيا تيراغرام (5xERE: GFP) c262/c262 يحتوي على 5 جنبا إلى جنب استجابة هرمون الاستروجين تسلسل الحمض النووي عنصر (موسوعة الدين و الأخلاق) المنبع من البروتين الفلورية الخضراء (GFP) 3. في غياب يجند، المتطلبات البيئية عادة ما تكون غير نشطة. يجند ملزم يتسبب في تغيير متعلق بتكوين جزئي، مما يسمح للمستقبلات لربط ااا الحمض النووي وتنظيم النسخ 9. 5xERE: الأسماك GFP يمكن استخدامها لفحص المكتبات الكيميائية لجهري ER، ويمكن استخدامها لفحص عينات المياه للملوثات البيئية استروجين.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:885px;" width="886">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:100px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:451px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Plastic transfer pipettes; wide bore</td>
			<td style="width:100px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">13-711-23</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Plastic transfer pipettes; fine tip</td>
			<td style="width:100px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">13-711-26</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">96-well, round, flat bottom plates</td>
			<td style="width:100px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">21-377-203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">100 x 35mm paltes</td>
			<td style="width:100px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">08-757-100D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">35 x 60mm plates</td>
			<td style="width:100px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">08-757-100B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Dumont #5 fine forceps</td>
			<td style="width:100px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:119px;">11254-20</td>
			<td>tip dimensions 0.05 x 0.01 mm, for manually removing chorions from embryos</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Tricane methanesulfonate</td>
			<td style="width:100px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A5040-25G</td>
			<td>see Zebrafish Book for recipe (http://zfin.org/zf_info/zfbook/chapt10.html#wptohtml63)&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1-phenyl 2-thiourea (PTU)</td>
			<td style="width:100px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P7629-10G</td>
			<td>Prepare 20 mM stock (100x) and use at 200 &#956;M in E3B&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Zeiss Axio Observer Z1</td>
			<td style="width:100px;">Carl Zeiss</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:451px;">Protocol requires an inverted fluorescence microscope with a motorized stage</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">20x long working distance objective</td>
			<td style="width:100px;">Carl Zeiss</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>We use an objective with 0.4 NA and 8.4 mm working distance</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Axiocam HRm digital camera</td>
			<td style="width:100px;">Carl Zeiss</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">ZenBlue 2011 microscope control software</td>
			<td style="width:100px;">Carl Zeiss</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:451px;">Protocol requires microscopy automation and control software to enable capturing of tiled images using a motorized stage</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Methylene Blue</td>
			<td style="width:100px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>&#160;MB-1; 25 grams</td>
			<td>make 2% solution in RO water for use in E3B (below)</td>
		</tr>
		<tr height="273">
			<td height="273" style="height:273px;">E3B</td>
			<td style="width:100px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:451px;">60X E3 SOLUTION: 
			NaCl&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; - 17.2 grams 
			KCl&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; - 0.76 grams 
			CaCl2-2H2O&#160;&#160;&#160;&#160; - 2.9 grams 
			MgSO4-7H2O&#160; - 4.9 grams or MgSO4 &#8211; 2.39 grams 
			Dissolve in 1 liter Milli-Q water; store in sterile 1 liter bottle. 
			 
			1X E3B SOLUTION FOR ZEBRAFISH: 
			60X E3&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 150mls 
			2% methylene blue&#160;&#160;&#160;&#160; 100&#956;l&#160; 
			Bring to 9 liters with Milli-Q water 
			&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

semi-automated imaging of tissue-specific fluorescence in zebrafish embryos

الأجنة الزرد هي أداة قوية لفحص واسعة النطاق من جزيئات صغيرة. وكثيرا ما تستخدم الزرد المعدلة وراثيا التي تعبر عن البروتينات الفلورية مراسل لتحديد المواد الكيميائية التي تعدل التعبير الجيني. شاشات الكيميائية التي مقايسة مضان في الزرد يعيش غالبا ما تعتمد على تكلفة، والمعدات المتخصصة لفحص نسبة عالية. نحن تصف الإجراء باستخدام المجهر epifluorescence معيار مع مرحلة الآلية تلقائيا صورة الأجنة الزرد وكشف مضان الأنسجة محددة. باستخدام الزرد المعدلة وراثيا التي تبلغ عن نشاط مستقبلات هرمون الاستروجين عن طريق التعبير عن GFP، وضعنا الداخلي شبه الآلي للكشف عن بروابط مستقبلات هرمون الاستروجين التي تنشط مراسل بطريقة الأنسجة محددة. في هذا الفيديو وصفنا إجراءات arraying الأجنة الزرد في 24-48 ساعة بعد الإخصاب (HPF) في لوحة 96 جيدا وإضافة جزيئات صغيرة التي تربط مستقبلات الاستروجين. في 72-96 HPF والصور من كل بئر منيتم جمع لوحة بأكمله تلقائيا وتفتيشها يدويا لمضان الأنسجة محددة. يوضح هذا البروتوكول القدرة على اكتشاف هرمون الاستروجين التي تنشط المستقبلات في صمامات القلب ولكن ليس في الكبد.

ويبين الشكل 1 الصور المركبة من الآبار الفردية لوحة 96 جيدا. وتتكون كل صورة مركب من 59 الصور الفردية مع 5٪ صورة التداخل. لاحظ أن الزرد الحية موجهة عشوائيا داخل كل بئر، ولكن نحن قادرون على التمييز مضان في قلب من الكبد. الصور Brightfield مفيدة كمرجع لتقييم التوجه الزرد و?...

Watch this Scientific Journal Video about Semi-automated Imaging of Tissue-specific Fluorescence in Zebrafish Embryos at JoVE.com

Semi-automated Imaging of Tissue-specific Fluorescence in Zebrafish Embryos

التصوير الآلي شبه الإسفار من الأنسجة محددة في الزرد الأجنة

الموصوفة هنا هو بروتوكول للتصوير شبه الآلي من مضان الأنسجة محددة في الأجنة الزرد.

Zebrafish embryos are a powerful tool for large-scale screening of small molecules. Transgenic zebrafish that express fluorescent reporter proteins are ...

Research

JoVE Journal

Biology

Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos

ثنائي الفوتون axotomy والوقت الفاصل بين التصوير مبائر يعيش في الأجنة الزرد

Zebrafish have long been utilized to study the cellular and molecular mechanisms of development by time-lapse imaging of the living transparent embryo.  ...

Generating Chimeric Zebrafish Embryos by Transplantation

توليد الأجنة اسماك الزرد همي بواسطة زرع

One of the most powerful tools used to gain insight into complex developmental processes is the analysis of chimeric embryos. A chimera is defined as an ...

Semi-automated Optical Heartbeat Analysis of Small Hearts

شبه الآلي التحليل البصري نبضات القلوب الصغيرة

We have developed a method for analyzing high speed optical recordings from Drosophila, zebrafish and embryonic mouse hearts (Fink, et. al., 2009). Our ...

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

الوقت الفاصل بين التصوير من الانقسام الميتوزي بعد ترنسفكأيشن سيرنا

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

Transplantation of GFP-expressing Blastomeres for Live Imaging of Retinal and Brain Development in Chimeric Zebrafish Embryos

زرع GFP - معربا عن Blastomeres للتصوير لايف التنمية الشبكية والدماغ في الجنين اسماك الزرد همي

Cells change extensively in their locations and property during embryogenesis. These changes are regulated by the interactions between the cells and their ...

Upright Imaging of Drosophila Embryos

Upright Imaging of Drosophila Embryos

تستقيم تصوير ذبابة الفاكهة الأجنة

Several well-known morphogenetic gradients and cellular movements occur along the dorsal/ventral axis of the Drosophila embryo. However, the current ...

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

التصوير تغيير الشكل في الخلية الحية ذبابة الفاكهة الأجنة

The developing Drosophila melanogaster embryo undergoes a number of cell shape changes that are highly amenable to live confocal imaging.  Cell shape ...

Chromatin Immunoprecipitation Assay for Tissue-specific Genes using Early-stage Mouse Embryos

مناعي لونين الفحص الجينات الأنسجة الخاصة باستخدام أجنة فئران في مرحلة مبكرة

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a powerful tool to identify protein:chromatin interactions that occur in the context of living cells 1-3. This ...

Imaging Glycans in Zebrafish Embryos by Metabolic Labeling and Bioorthogonal Click Chemistry

Glycans التصوير في الأجنة التي وصفها اسماك الزرد الاستقلابية والكيمياء Bioorthogonal انقر

Imaging glycans in vivo has recently been enabled using a bioorthogonal chemical reporter strategy by treating cells or organisms with azide- or ...

Metabolic Profile Analysis of Zebrafish Embryos

الأيض تحليل الملف من الأجنة الزرد

A growing goal in the field of metabolism is to determine the impact of genetics on different aspects of mitochondrial function. Understanding these ...