Name: semi-automated imaging of tissue-specific fluorescence in zebrafish embryos
Uploaded: 2014-05-17T17:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Semi-automated Imaging of Tissue-specific Fluorescence in Zebrafish Embryos at JoVE.com

אנו מודים לסוזן פארמר ואת צוות של מתקן מחקר דג הזברה UAB לטיפול בדג זברה. מימון הניתן על ידי קופות הזנק מהמחלקה לפרמקולוגיה וטוקסיקולוגיה.

הערה: פרוטוקול זה אושר על ידי אוניברסיטת אלבמה בועדת טיפול בבעלי חיים ושימוש המוסדית ברמינגהאם. 1. רבייה דג הזברה ואוספי ביצה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שלושה ימים לפני תחילת חשיפה לחומרים כימיים, להרכיב טנ?...

<ol>
	<li>Molina, G., Watkins, S., Tsang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+FGF+reporter+transgenic+zebrafish+and+their+utility+in+chemical+screens.">Generation of FGF reporter transgenic zebrafish and their utility in chemical screens.</a> BMC Developmental Biology. 7, 62 (2007).</li><li>Perz-Edwards, A., Hardison, N. L., Linney, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoic+acid-mediated+gene+expression+in+transgenic+reporter+zebrafish.">Retinoic acid-mediated gene expression in transgenic reporter zebrafish.</a> Developmental Biology. , 89-101 (2001).</li><li>Gorelick, D. A., Halpern, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+Estrogen+Receptor+Transcriptional+Activation+in+Zebrafish.">Visualization of Estrogen Receptor Transcriptional Activation in Zebrafish.</a> Endocrinology. 152, 2690-2703 (2011).</li><li>Tsang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish:+A+tool+for+chemical+screens.">Zebrafish: A tool for chemical screens.</a> Birth Defects Research Part C: Embryo Today: Reviews. 90, 185-192 (2010).</li><li>Peravali, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+feature+detection+and+imaging+for+high-resolution+screening+of+zebrafish+embryos.">Automated feature detection and imaging for high-resolution screening of zebrafish embryos.</a> Biotechniques. 50, 319-324 (2011).</li><li>Walker, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+reporter+quantification+in+vivo:+high-throughput+screening+method+for+reporter-based+assays+in+zebrafish.">Automated reporter quantification in vivo: high-throughput screening method for reporter-based assays in zebrafish.</a> PLoS One. 7, (2012).</li><li>Vogt, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+image-based+phenotypic+analysis+in+zebrafish+embryos.">Automated image-based phenotypic analysis in zebrafish embryos.</a> Developmental Dynamics. 238, 656-663 (2009).</li><li>Vogt, A., Codore, H., Day, B. W., Hukriede, N. A., Tsang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+automated+imaging+and+analysis+for+zebrafish+chemical+screens.">Development of automated imaging and analysis for zebrafish chemical screens.</a> J. Vis. Exp. , (2010).</li><li>Gruber, C. J., Gruber, D. M., Gruber, I. M., Wieser, F., Huber, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomy+of+the+estrogen+response+element.">Anatomy of the estrogen response element.</a> Trends in Endocrinology and Metabolism. 15, 73-78 (2004).</li><li>Rovira, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+screen+identifies+FDA-approved+drugs+and+target+pathways+that+induce+precocious+pancreatic+endocrine+differentiation.">Chemical screen identifies FDA-approved drugs and target pathways that induce precocious pancreatic endocrine differentiation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 108, 19264-19269 (2011).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Zebrafish+Book:+A+guide+for+the+laboratory+use+of+zebrafish+(Danio+rerio).">The Zebrafish Book: A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio).</a> , (2000).</li></ol>

פרוטוקול זה מתאר שיטה פשוטה לאוטומטי הקרינה רקמות ספציפיות תמונה בעוברי דג הזברה. הפרוטוקול פותח באמצעות Zeiss Axio אובזרוור. Z1 עם תוכנת זן 2011 כחול, עם זאת הטכניקה יכולה להיות מותאם באמצעות כל מיקרוסקופ הפוכה עם במה ממונעת ותוכנת שליטת מיקרוסקופ שיכול לבצע ריצוף כדי ליצו...

דג הזברה מהונדס פותחו המאפשרת הדמיה הישירה של פעילות במסלולי איתות, כגון צמיחת פיברובלסטים גורמי 1, חומצה רטינואית 2 ואסטרוגנים 3, בעוברים בשידור חי. כלים אלה מאפשרים הקרנה של כימיקלים שיוצרים הפרעת מסלולי איתות (assayed כשינוי בעוצמת הקרינה) או לכימיקלים המווסתים איתות באופן רקמות ספציפיות (שינוי בלוקליזציה הקרינה) 4. לכידת תמונה אוטומטית מגדילה את התפוקה של מסכי כימיים באופן דרמטי 5,6. מסכים שהקרינה באופן אוטומטי assay בדג הזברה לחיות לעתים קרובות מסתמכת על ציוד יקר, מיוחד. מה שנקרא גבוה הקרנת תוכן מספקת את היתרון של רזולוציה גבוהה, הדמיה כמותית אך במחיר של שימוש בקוראי צלחת מיוחדים מצוידים למיקרוסקופיה confocal 7,8. מטרתה של שיטה זו היא באופן אוטומטי הקרינה רקמות ספציפיות assay בעוברי דג הזברהבצלחת 96 היטב באמצעות מיקרוסקופ epifluorescence סטנדרטי. הקרינה רקמות ספציפיות ניתן להבחין באמצעות טכניקה זו ועלולה להיות גישה סבירה למעבדות שאין גישה לקוראי צלחת מיוחדות או ציוד גבוה הקרנת תוכן. בפרוטוקול זה, אנו משתמשים בהדמיה אוטומטית כדי לזהות קולט רקמות ספציפיות אסטרוגן (ER) אגוניסטים בדג הזברה לחיות ב3 ימים לאחר הפריה (DPF). הקו המהונדס Tg (5xERE: GFP) c262/c262 מכיל 5 רצפי טנדם תגובת אסטרוגן אלמנט ה-DNA (ERE) במעלה הזרם של חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) 3. בהעדר ליגנד, מיונים הם בדרך כלל לא פעילים. ליגנד מחייב מעורר שינוי קונפורמציה, המאפשר הקולטנים להיקשר ERE-DNA ולווסת את השעתוק 9. 5xERE: ניתן להשתמש בדגים GFP למסך ספריות כימיות למאפנני ER ויכולים לשמש מסך דגימות מים סביבתיים למזהמים אסטרוגניים.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:885px;" width="886">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:100px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:451px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Plastic transfer pipettes; wide bore</td>
			<td style="width:100px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">13-711-23</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Plastic transfer pipettes; fine tip</td>
			<td style="width:100px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">13-711-26</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">96-well, round, flat bottom plates</td>
			<td style="width:100px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">21-377-203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">100 x 35mm paltes</td>
			<td style="width:100px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">08-757-100D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">35 x 60mm plates</td>
			<td style="width:100px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">08-757-100B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Dumont #5 fine forceps</td>
			<td style="width:100px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:119px;">11254-20</td>
			<td>tip dimensions 0.05 x 0.01 mm, for manually removing chorions from embryos</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Tricane methanesulfonate</td>
			<td style="width:100px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A5040-25G</td>
			<td>see Zebrafish Book for recipe (http://zfin.org/zf_info/zfbook/chapt10.html#wptohtml63)&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1-phenyl 2-thiourea (PTU)</td>
			<td style="width:100px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P7629-10G</td>
			<td>Prepare 20 mM stock (100x) and use at 200 &#956;M in E3B&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Zeiss Axio Observer Z1</td>
			<td style="width:100px;">Carl Zeiss</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:451px;">Protocol requires an inverted fluorescence microscope with a motorized stage</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">20x long working distance objective</td>
			<td style="width:100px;">Carl Zeiss</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>We use an objective with 0.4 NA and 8.4 mm working distance</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Axiocam HRm digital camera</td>
			<td style="width:100px;">Carl Zeiss</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">ZenBlue 2011 microscope control software</td>
			<td style="width:100px;">Carl Zeiss</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:451px;">Protocol requires microscopy automation and control software to enable capturing of tiled images using a motorized stage</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Methylene Blue</td>
			<td style="width:100px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>&#160;MB-1; 25 grams</td>
			<td>make 2% solution in RO water for use in E3B (below)</td>
		</tr>
		<tr height="273">
			<td height="273" style="height:273px;">E3B</td>
			<td style="width:100px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:451px;">60X E3 SOLUTION: 
			NaCl&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; - 17.2 grams 
			KCl&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; - 0.76 grams 
			CaCl2-2H2O&#160;&#160;&#160;&#160; - 2.9 grams 
			MgSO4-7H2O&#160; - 4.9 grams or MgSO4 &#8211; 2.39 grams 
			Dissolve in 1 liter Milli-Q water; store in sterile 1 liter bottle. 
			 
			1X E3B SOLUTION FOR ZEBRAFISH: 
			60X E3&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 150mls 
			2% methylene blue&#160;&#160;&#160;&#160; 100&#956;l&#160; 
			Bring to 9 liters with Milli-Q water 
			&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

semi-automated imaging of tissue-specific fluorescence in zebrafish embryos

עוברי דג הזברה הם כלי רב עוצמה להקרנה בקנה מידה גדולה של מולקולות קטנות. דג הזברה מהונדס המבטאים את חלבוני כתב ניאון משמש לעתים קרובות כדי לזהות כימיקלים המווסתים את ביטוי הגנים. מסכי כימיים שassay הקרינה בדג הזברה לחיות לעתים קרובות מסתמכים על ציוד יקר, מיוחד להקרנת תוכן גבוה. אנו מתארים הליך באמצעות מיקרוסקופ epifluorescence רגיל עם במה ממונעת באופן אוטומטי לעוברי דג הזברה תמונה ולזהות הקרינה רקמות ספציפיות. שימוש בדג זברה מהונדס שלדווח על פעילות קולטן אסטרוגן דרך ביטוי של ה-GFP, פיתחנו הליך חצי אוטומטי למסך לligands קולטן אסטרוגן המפעיל את הכתב באופן רקמות ספציפיות. בסרטון זה אנו מתארים נהלים לעריכת עוברי דג הזברה ב24-48 שעות שלאחר הפריה (hpf) בצלחת 96 היטב והוספת מולקולות קטנות אשר נקלטות קולטני אסטרוגן. ב72-96 hpf, תמונות של כל אחד גם מכל הצלחת באופן אוטומטי שנאספו ונבדקה באופן ידני לקרינת רקמות ספציפיות. פרוטוקול זה מדגים את היכולת לזהות אסטרוגנים המפעילים קולטנים במסתמי לב, אך לא בכבד.

איור 1 מציג תמונות מרוכבים מבארות בודדות של צלחת 96 היטב. כל תמונה מורכבת מורכבת מ59 תמונות בודדות עם 5% חפיפה תמונה. שים לב שדג הזברה לחיות מכוונים באופן אקראי בתוך כל טוב, אך אנו מסוגלים להבחין הקרינה בלב מהכבד. תמונות brightfield שימושיות כמו אזכור להעריך נטייה דג ה...

Watch this Scientific Journal Video about Semi-automated Imaging of Tissue-specific Fluorescence in Zebrafish Embryos at JoVE.com

Semi-automated Imaging of Tissue-specific Fluorescence in Zebrafish Embryos

הדמיה חצי אוטומטית של הקרינה רקמות ספציפיות בעוברי דג הזברה

שתואר כאן הוא פרוטוקול להדמיה חצי אוטומטית של הקרינה רקמות ספציפיות בעוברי דג הזברה.

Zebrafish embryos are a powerful tool for large-scale screening of small molecules. Transgenic zebrafish that express fluorescent reporter proteins are ...

Research

JoVE Journal

Biology

Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos

שני הפוטונים axotomy ואת זמן לשגות הדמיה confocal עוברי דג הזברה לחיות

Zebrafish have long been utilized to study the cellular and molecular mechanisms of development by time-lapse imaging of the living transparent embryo.  ...

Generating Chimeric Zebrafish Embryos by Transplantation

יצירת עוברים דג הזברה chimeric על ידי השתלה

One of the most powerful tools used to gain insight into complex developmental processes is the analysis of chimeric embryos. A chimera is defined as an ...

Semi-automated Optical Heartbeat Analysis of Small Hearts

חצי אוטומטיות Heartbeat ניתוח אופטי של לבבות קטנים

We have developed a method for analyzing high speed optical recordings from Drosophila, zebrafish and embryonic mouse hearts (Fink, et. al., 2009). Our ...

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

זמן לשגות הדמיה של מיטוזה לאחר transfection siRNA

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

Transplantation of GFP-expressing Blastomeres for Live Imaging of Retinal and Brain Development in Chimeric Zebrafish Embryos

השתלה של ה-GFP-לבטא בלסטומרים עבור הדמיה חיה של התפתחות המוח ואת רשתית עוברי דג הזברה chimeric

Cells change extensively in their locations and property during embryogenesis. These changes are regulated by the interactions between the cells and their ...

Upright Imaging of Drosophila Embryos

Upright Imaging of Drosophila Embryos

הדמיה של זקופה תסיסנית עוברים

Several well-known morphogenetic gradients and cellular movements occur along the dorsal/ventral axis of the Drosophila embryo. However, the current ...

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

צורה הדמיה תא שינוי חיים תסיסנית עוברים

The developing Drosophila melanogaster embryo undergoes a number of cell shape changes that are highly amenable to live confocal imaging.  Cell shape ...

Chromatin Immunoprecipitation Assay for Tissue-specific Genes using Early-stage Mouse Embryos

הכרומטין Assay immunoprecipitation עבור גנים ספציפיים רקמות באמצעות שלבים מוקדמים של עוברי עכברים

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a powerful tool to identify protein:chromatin interactions that occur in the context of living cells 1-3. This ...

Imaging Glycans in Zebrafish Embryos by Metabolic Labeling and Bioorthogonal Click Chemistry

הדמיה Glycans בעוברים דג הזברה על ידי תיוג מטבולית וכימיה לחץ Bioorthogonal

Imaging glycans in vivo has recently been enabled using a bioorthogonal chemical reporter strategy by treating cells or organisms with azide- or ...

Metabolic Profile Analysis of Zebrafish Embryos

ניתוח פרופיל המטבולי של עוברי דג זברה

A growing goal in the field of metabolism is to determine the impact of genetics on different aspects of mitochondrial function. Understanding these ...