Name: semi-automated imaging of tissue-specific fluorescence in zebrafish embryos
Uploaded: 2014-05-17T17:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Semi-automated Imaging of Tissue-specific Fluorescence in Zebrafish Embryos at JoVE.com

हम सुसान किसान और zebrafish देखभाल के लिए UAB zebrafish अनुसंधान सुविधा के कर्मचारियों को धन्यवाद. औषध विज्ञान और विष विज्ञान विभाग की ओर से शुरू हुआ धन द्वारा प्रदान की धन.

नोट: इस प्रोटोकॉल बर्मिंघम संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति में अलबामा के विश्वविद्यालय द्वारा अनुमोदित किया गया था. 1. Zebrafish प्रजनन और अंडे संग्रह <ol><li> तीन दिन रासायनिक जोखिम की शुरुआत स?...

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	<li>Molina, G., Watkins, S., Tsang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+FGF+reporter+transgenic+zebrafish+and+their+utility+in+chemical+screens.">Generation of FGF reporter transgenic zebrafish and their utility in chemical screens.</a> BMC Developmental Biology. 7, 62 (2007).</li><li>Perz-Edwards, A., Hardison, N. L., Linney, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoic+acid-mediated+gene+expression+in+transgenic+reporter+zebrafish.">Retinoic acid-mediated gene expression in transgenic reporter zebrafish.</a> Developmental Biology. , 89-101 (2001).</li><li>Gorelick, D. A., Halpern, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+Estrogen+Receptor+Transcriptional+Activation+in+Zebrafish.">Visualization of Estrogen Receptor Transcriptional Activation in Zebrafish.</a> Endocrinology. 152, 2690-2703 (2011).</li><li>Tsang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish:+A+tool+for+chemical+screens.">Zebrafish: A tool for chemical screens.</a> Birth Defects Research Part C: Embryo Today: Reviews. 90, 185-192 (2010).</li><li>Peravali, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+feature+detection+and+imaging+for+high-resolution+screening+of+zebrafish+embryos.">Automated feature detection and imaging for high-resolution screening of zebrafish embryos.</a> Biotechniques. 50, 319-324 (2011).</li><li>Walker, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+reporter+quantification+in+vivo:+high-throughput+screening+method+for+reporter-based+assays+in+zebrafish.">Automated reporter quantification in vivo: high-throughput screening method for reporter-based assays in zebrafish.</a> PLoS One. 7, (2012).</li><li>Vogt, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+image-based+phenotypic+analysis+in+zebrafish+embryos.">Automated image-based phenotypic analysis in zebrafish embryos.</a> Developmental Dynamics. 238, 656-663 (2009).</li><li>Vogt, A., Codore, H., Day, B. W., Hukriede, N. A., Tsang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+automated+imaging+and+analysis+for+zebrafish+chemical+screens.">Development of automated imaging and analysis for zebrafish chemical screens.</a> J. Vis. Exp. , (2010).</li><li>Gruber, C. J., Gruber, D. M., Gruber, I. M., Wieser, F., Huber, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomy+of+the+estrogen+response+element.">Anatomy of the estrogen response element.</a> Trends in Endocrinology and Metabolism. 15, 73-78 (2004).</li><li>Rovira, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+screen+identifies+FDA-approved+drugs+and+target+pathways+that+induce+precocious+pancreatic+endocrine+differentiation.">Chemical screen identifies FDA-approved drugs and target pathways that induce precocious pancreatic endocrine differentiation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 108, 19264-19269 (2011).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Zebrafish+Book:+A+guide+for+the+laboratory+use+of+zebrafish+(Danio+rerio).">The Zebrafish Book: A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio).</a> , (2000).</li></ol>

इस प्रोटोकॉल zebrafish भ्रूण में स्वतः छवि ऊतक विशेष प्रतिदीप्ति के लिए एक सरल विधि का वर्णन. प्रोटोकॉल एक Zeiss Axio प्रेक्षक का उपयोग कर विकसित किया गया था. Z1 जेन ब्लू 2011 सॉफ्टवेयर के साथ, लेकिन तकनीक समग्र चित्र ब?...

ट्रांसजेनिक zebrafish ऐसे fibroblast वृद्धि 1, retinoic एसिड 2 कारकों और जीने भ्रूण में, 3 एस्ट्रोजेन के रूप में रास्ते संकेतन में गतिविधि के प्रत्यक्ष दृश्य के लिए अनुमति देते हैं कि विकसित किया गया है. इस तरह के उपकरण (प्रतिदीप्ति तीव्रता में परिवर्तन के रूप में assayed) संकेत दे रास्ते उपद्रव कि रसायनों के लिए या एक ऊतक विशेष ढंग से 4 (प्रतिदीप्ति स्थानीयकरण में परिवर्तन) में संकेत मिलाना कि रसायनों के लिए स्क्रीनिंग सक्षम. स्वचालित छवि पर कब्जा नाटकीय रूप से 5,6 रासायनिक स्क्रीन के throughput बढ़ जाती है. लाइव zebrafish में स्वचालित रूप से परख प्रतिदीप्ति अक्सर महंगा, विशेष उपकरणों पर निर्भर है कि स्क्रीन. तथाकथित उच्च सामग्री स्क्रीनिंग उच्च संकल्प, मात्रात्मक इमेजिंग लेकिन confocal माइक्रोस्कोपी 7,8 के लिए सुसज्जित विशेष थाली पाठकों के उपयोग की लागत में से लाभ प्रदान करता है. इस पद्धति का लक्ष्य zebrafish भ्रूण में स्वचालित रूप से परख ऊतक विशेष प्रतिदीप्ति हैएक मानक epifluorescence माइक्रोस्कोप का उपयोग कर एक 96 अच्छी तरह से थाली में. ऊतक विशेष प्रतिदीप्ति इस तकनीक का उपयोग प्रतिष्ठित किया जा सकता है और विशेष थाली पाठकों या उच्च सामग्री स्क्रीनिंग उपकरणों के लिए उपयोग की कमी है कि प्रयोगशालाओं के लिए एक उचित दृष्टिकोण हो सकता है. इस प्रोटोकॉल में, हम 3 दिनों के बाद निषेचन (DPF) में ऊतक विशेष एस्ट्रोजन रिसेप्टर (ईआर) रहते zebrafish में एगोनिस्ट पता लगाने के लिए स्वचालित इमेजिंग का उपयोग करें. ट्रांसजेनिक लाइन टीजी (5xERE: GFP) c262/c262 हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) के अपस्ट्रीम 5 मिलकर एस्ट्रोजन प्रतिक्रिया तत्व डीएनए अनुक्रम (ERE) शामिल 3. Ligand के अभाव में, नेताओं सामान्य रूप से निष्क्रिय हैं. Ligand बाध्यकारी रिसेप्टर्स ERE डीएनए बाँध और प्रतिलेखन 9 को विनियमित करने की इजाजत दी, एक गठनात्मक परिवर्तन हो सके. 5xERE: GFP मछली ईआर modulators के लिए रासायनिक पुस्तकालयों स्क्रीन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है और estrogenic contaminants के लिए पर्यावरण के पानी के नमूनों की छानबीन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:885px;" width="886">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:100px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:451px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Plastic transfer pipettes; wide bore</td>
			<td style="width:100px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">13-711-23</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Plastic transfer pipettes; fine tip</td>
			<td style="width:100px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">13-711-26</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">96-well, round, flat bottom plates</td>
			<td style="width:100px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">21-377-203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">100 x 35mm paltes</td>
			<td style="width:100px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">08-757-100D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">35 x 60mm plates</td>
			<td style="width:100px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">08-757-100B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Dumont #5 fine forceps</td>
			<td style="width:100px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:119px;">11254-20</td>
			<td>tip dimensions 0.05 x 0.01 mm, for manually removing chorions from embryos</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Tricane methanesulfonate</td>
			<td style="width:100px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A5040-25G</td>
			<td>see Zebrafish Book for recipe (http://zfin.org/zf_info/zfbook/chapt10.html#wptohtml63)&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1-phenyl 2-thiourea (PTU)</td>
			<td style="width:100px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P7629-10G</td>
			<td>Prepare 20 mM stock (100x) and use at 200 &#956;M in E3B&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Zeiss Axio Observer Z1</td>
			<td style="width:100px;">Carl Zeiss</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:451px;">Protocol requires an inverted fluorescence microscope with a motorized stage</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">20x long working distance objective</td>
			<td style="width:100px;">Carl Zeiss</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>We use an objective with 0.4 NA and 8.4 mm working distance</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Axiocam HRm digital camera</td>
			<td style="width:100px;">Carl Zeiss</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">ZenBlue 2011 microscope control software</td>
			<td style="width:100px;">Carl Zeiss</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:451px;">Protocol requires microscopy automation and control software to enable capturing of tiled images using a motorized stage</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Methylene Blue</td>
			<td style="width:100px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>&#160;MB-1; 25 grams</td>
			<td>make 2% solution in RO water for use in E3B (below)</td>
		</tr>
		<tr height="273">
			<td height="273" style="height:273px;">E3B</td>
			<td style="width:100px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:451px;">60X E3 SOLUTION: 
			NaCl&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; - 17.2 grams 
			KCl&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; - 0.76 grams 
			CaCl2-2H2O&#160;&#160;&#160;&#160; - 2.9 grams 
			MgSO4-7H2O&#160; - 4.9 grams or MgSO4 &#8211; 2.39 grams 
			Dissolve in 1 liter Milli-Q water; store in sterile 1 liter bottle. 
			 
			1X E3B SOLUTION FOR ZEBRAFISH: 
			60X E3&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 150mls 
			2% methylene blue&#160;&#160;&#160;&#160; 100&#956;l&#160; 
			Bring to 9 liters with Milli-Q water 
			&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

semi-automated imaging of tissue-specific fluorescence in zebrafish embryos

Zebrafish भ्रूण छोटे अणुओं की बड़े पैमाने पर प्रदर्शन के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है. फ्लोरोसेंट संवाददाता प्रोटीन व्यक्त कि ट्रांसजेनिक zebrafish अक्सर जीन अभिव्यक्ति मिलाना कि रसायन की पहचान करने के लिए उपयोग किया जाता है. लाइव zebrafish में प्रतिदीप्ति परख कि रासायनिक स्क्रीन अक्सर उच्च सामग्री स्क्रीनिंग के लिए महंगा, विशेष उपकरणों पर भरोसा करते हैं. हम एक मोटर चालित चरण स्वतः छवि zebrafish भ्रूण के साथ एक मानक epifluorescence माइक्रोस्कोप का उपयोग कर एक प्रक्रिया का वर्णन है और ऊतक विशेष प्रतिदीप्ति का पता लगाने. GFP की अभिव्यक्ति के माध्यम से एस्ट्रोजन रिसेप्टर गतिविधि की रिपोर्ट है कि ट्रांसजेनिक zebrafish का उपयोग करना, हम एक ऊतक विशेष ढंग से रिपोर्टर को सक्रिय कि एस्ट्रोजन रिसेप्टर ligands के लिए स्क्रीन के लिए एक अर्द्ध स्वचालित प्रक्रिया विकसित की है. इस वीडियो में हम एक 96 अच्छी तरह से थाली में 24-48 घंटे के बाद निषेचन (HPF) पर zebrafish भ्रूण arraying और एस्ट्रोजन रिसेप्टर्स कि बाँध छोटे अणुओं को जोड़ने के लिए प्रक्रियाओं का वर्णन है. 72-96 HPF में, प्रत्येक की छवियों को अच्छी तरह सेपूरी थाली स्वचालित रूप से एकत्र और मैन्युअल ऊतक विशेष प्रतिदीप्ति के लिए निरीक्षण कर रहे हैं. इस प्रोटोकॉल नहीं बल्कि जिगर में हृदय वाल्व में रिसेप्टर्स को सक्रिय कि एस्ट्रोजेन का पता लगाने की क्षमता को दर्शाता है.

चित्रा 1 एक 96 अच्छी तरह से थाली के व्यक्तिगत कुओं से समग्र चित्र से पता चलता है. प्रत्येक समग्र छवि 5% छवि ओवरलैप के साथ 59 व्यक्ति छवियों से बना है. रहते zebrafish अच्छी तरह से प्रत्येक के भीतर बेतरतीब ढंग स?...

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Semi-automated Imaging of Tissue-specific Fluorescence in Zebrafish Embryos

Zebrafish भ्रूण में ऊतक विशेष प्रतिदीप्ति की अर्द्ध स्वचालित इमेजिंग

Zebrafish भ्रूण में ऊतक विशेष प्रतिदीप्ति की अर्द्ध स्वचालित इमेजिंग के लिए एक प्रोटोकॉल यहाँ है वर्णित है.

Zebrafish embryos are a powerful tool for large-scale screening of small molecules. Transgenic zebrafish that express fluorescent reporter proteins are ...

Research

JoVE Journal

Biology

Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos

दो photon axotomy और लाइव zebrafish भ्रूण में समय चूक confocal इमेजिंग

Zebrafish have long been utilized to study the cellular and molecular mechanisms of development by time-lapse imaging of the living transparent embryo.  ...

Generating Chimeric Zebrafish Embryos by Transplantation

ट्रांसप्लांटेशन द्वारा chimeric Zebrafish भ्रूण उत्पन्न

One of the most powerful tools used to gain insight into complex developmental processes is the analysis of chimeric embryos. A chimera is defined as an ...

Semi-automated Optical Heartbeat Analysis of Small Hearts

छोटे दिल की अर्ध स्वचालित ऑप्टिकल हार्टबीट विश्लेषण

We have developed a method for analyzing high speed optical recordings from Drosophila, zebrafish and embryonic mouse hearts (Fink, et. al., 2009). Our ...

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

SiRNA अभिकर्मक के बाद समय चूक सूत्रीविभाजन की इमेजिंग

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

Transplantation of GFP-expressing Blastomeres for Live Imaging of Retinal and Brain Development in Chimeric Zebrafish Embryos

के ट्रांसप्लांटेशन GFP chimeric Zebrafish भ्रूण में रेटिना और मस्तिष्क के विकास के लाइव इमेजिंग के लिए Blastomeres व्यक्त

Cells change extensively in their locations and property during embryogenesis. These changes are regulated by the interactions between the cells and their ...

Upright Imaging of Drosophila Embryos

Upright Imaging of Drosophila Embryos

के ईमानदार इमेजिंग ड्रोसोफिला भ्रूण

Several well-known morphogenetic gradients and cellular movements occur along the dorsal/ventral axis of the Drosophila embryo. However, the current ...

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

जहाँ रहते इमेजिंग सेल आकार बदलें ड्रोसोफिला भ्रूण

The developing Drosophila melanogaster embryo undergoes a number of cell shape changes that are highly amenable to live confocal imaging.  Cell shape ...

Chromatin Immunoprecipitation Assay for Tissue-specific Genes using Early-stage Mouse Embryos

ऊतक विशिष्ट प्रारंभिक चरण माउस भ्रूण का उपयोग जीन के लिए chromatin immunoprecipitation परख

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a powerful tool to identify protein:chromatin interactions that occur in the context of living cells 1-3. This ...

Imaging Glycans in Zebrafish Embryos by Metabolic Labeling and Bioorthogonal Click Chemistry

Zebrafish भ्रूण में मेटाबोलिक लेबल और Bioorthogonal क्लिक करें रसायन विज्ञान के द्वारा इमेजिंग glycans

Imaging glycans in vivo has recently been enabled using a bioorthogonal chemical reporter strategy by treating cells or organisms with azide- or ...

Metabolic Profile Analysis of Zebrafish Embryos

Zebrafish भ्रूण के चयापचय प्रोफ़ाइल विश्लेषण

A growing goal in the field of metabolism is to determine the impact of genetics on different aspects of mitochondrial function. Understanding these ...