Name: semi-automated imaging of tissue-specific fluorescence in zebrafish embryos
Uploaded: 2014-05-17T17:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Semi-automated Imaging of Tissue-specific Fluorescence in Zebrafish Embryos at JoVE.com

私たちは、スーザン·ファーマーやゼブラフィッシュケアのためのUABのゼブラフィッシュ研究施設のスタッフに感謝します。薬理学および毒物学の部門からの起動の資金が提供する資金調達。

注：このプロトコルは、バーミンガム機関動物実験委員会のアラバマ大学によって承認された。 1。ゼブラフィッシュの繁殖や卵コレクション<ol><li>三日間化学物質暴露を開始する前に、別々の男性と女性のディバイダーで飼育タンクを組み立てる。養殖システムの水を各タンクを半埋める。 NETを使用して、TG（5xERE：GFP）を転送する分周器で区切られた各タンク...

<ol>
	<li>Molina, G., Watkins, S., Tsang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+FGF+reporter+transgenic+zebrafish+and+their+utility+in+chemical+screens.">Generation of FGF reporter transgenic zebrafish and their utility in chemical screens.</a> BMC Developmental Biology. 7, 62 (2007).</li><li>Perz-Edwards, A., Hardison, N. L., Linney, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoic+acid-mediated+gene+expression+in+transgenic+reporter+zebrafish.">Retinoic acid-mediated gene expression in transgenic reporter zebrafish.</a> Developmental Biology. , 89-101 (2001).</li><li>Gorelick, D. A., Halpern, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+Estrogen+Receptor+Transcriptional+Activation+in+Zebrafish.">Visualization of Estrogen Receptor Transcriptional Activation in Zebrafish.</a> Endocrinology. 152, 2690-2703 (2011).</li><li>Tsang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish:+A+tool+for+chemical+screens.">Zebrafish: A tool for chemical screens.</a> Birth Defects Research Part C: Embryo Today: Reviews. 90, 185-192 (2010).</li><li>Peravali, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+feature+detection+and+imaging+for+high-resolution+screening+of+zebrafish+embryos.">Automated feature detection and imaging for high-resolution screening of zebrafish embryos.</a> Biotechniques. 50, 319-324 (2011).</li><li>Walker, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+reporter+quantification+in+vivo:+high-throughput+screening+method+for+reporter-based+assays+in+zebrafish.">Automated reporter quantification in vivo: high-throughput screening method for reporter-based assays in zebrafish.</a> PLoS One. 7, (2012).</li><li>Vogt, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+image-based+phenotypic+analysis+in+zebrafish+embryos.">Automated image-based phenotypic analysis in zebrafish embryos.</a> Developmental Dynamics. 238, 656-663 (2009).</li><li>Vogt, A., Codore, H., Day, B. W., Hukriede, N. A., Tsang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+automated+imaging+and+analysis+for+zebrafish+chemical+screens.">Development of automated imaging and analysis for zebrafish chemical screens.</a> J. Vis. Exp. , (2010).</li><li>Gruber, C. J., Gruber, D. M., Gruber, I. M., Wieser, F., Huber, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomy+of+the+estrogen+response+element.">Anatomy of the estrogen response element.</a> Trends in Endocrinology and Metabolism. 15, 73-78 (2004).</li><li>Rovira, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+screen+identifies+FDA-approved+drugs+and+target+pathways+that+induce+precocious+pancreatic+endocrine+differentiation.">Chemical screen identifies FDA-approved drugs and target pathways that induce precocious pancreatic endocrine differentiation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 108, 19264-19269 (2011).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Zebrafish+Book:+A+guide+for+the+laboratory+use+of+zebrafish+(Danio+rerio).">The Zebrafish Book: A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio).</a> , (2000).</li></ol>

このプロトコルは、ゼブラフィッシュ胚で自動的に画像の組織特異的な蛍光の簡単な方法を説明します。プロトコルはツァイスアクシオオブザーバを使用して開発されました。禅ブルー2011ソフトウェアでZ1は、しかし技術は、合成画像を作成するためにタイリングを行うことができる電動ステージと顕微鏡制御ソフトウェアとの任意の倒立顕微鏡を使用して適合させることができる。電動ス?...

トランスジェニックゼブラフィッシュは、線維芽細胞増殖は1、レチノイン酸2因子 、ライブ胚において、3のエストロゲンシグナル伝達経路における活性を直接可視化を可能に開発されている。このようなツールは（蛍光強度の変化としてアッセイ）シグナル伝達経路を撹乱化学物質または組織特異的様式4（蛍光の局在の変化）でシグナル伝達を調節する化学物質のスクリーニングを可能にする。自動化された画像取り込みは、化学画面劇的5,6のスループットが向上します。ライブゼブラフィッシュにおける自動的アッセイ蛍光は、多くの場合、高価な、特殊な装置に依存している画面。いわゆる高含有量スクリーニングは、高分解能、定量的なイメージングが、共焦点顕微鏡、7,8のために装備、特殊なプレートリーダーを使用してのコストでの利点を提供します。このメソッドの目的は、ゼブラフィッシュ胚で自動的に分析組織特異的な蛍光である標準的な落射蛍光顕微鏡を用いて96ウェルプレート中。組織特異的蛍光は、この技術を用いて区別することができ、特殊なプレートリーダーまたはハイコンテントスクリーニング装置へのアクセスを欠いている実験室のための合理的なアプローチであり得る。 このプロトコルでは、3日後に受精（DPF）で組織特異的エストロゲン受容体（ER）ライブゼブラフィッシュにおけるアゴニストを検出するための自​​動化されたイメージングを使用する。トランスジェニック系統のTg（5xERE：GFP）c262/c262は、緑色蛍光タンパク質（GFP）の上流に5タンデムエストロゲン応答エレメントDNA配列（ERE）を含む3。リガンドの非存在下で、ERは、通常は不活性である。リガンド結合は、受容体がERE DNAと結合し、転写9を調節することができるように、コンフォメーション変化を誘発する。 5xERE：GFP魚ERモジュレーターのための化学ライブラリーをスクリーニングするために使用することができ、エストロゲン汚染物質の環境水サンプルをスクリーニングするために使用することができる。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:885px;" width="886">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:100px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:451px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Plastic transfer pipettes; wide bore</td>
			<td style="width:100px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">13-711-23</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Plastic transfer pipettes; fine tip</td>
			<td style="width:100px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">13-711-26</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">96-well, round, flat bottom plates</td>
			<td style="width:100px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">21-377-203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">100 x 35mm paltes</td>
			<td style="width:100px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">08-757-100D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">35 x 60mm plates</td>
			<td style="width:100px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">08-757-100B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Dumont #5 fine forceps</td>
			<td style="width:100px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:119px;">11254-20</td>
			<td>tip dimensions 0.05 x 0.01 mm, for manually removing chorions from embryos</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Tricane methanesulfonate</td>
			<td style="width:100px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A5040-25G</td>
			<td>see Zebrafish Book for recipe (http://zfin.org/zf_info/zfbook/chapt10.html#wptohtml63)&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1-phenyl 2-thiourea (PTU)</td>
			<td style="width:100px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P7629-10G</td>
			<td>Prepare 20 mM stock (100x) and use at 200 &#956;M in E3B&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Zeiss Axio Observer Z1</td>
			<td style="width:100px;">Carl Zeiss</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:451px;">Protocol requires an inverted fluorescence microscope with a motorized stage</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">20x long working distance objective</td>
			<td style="width:100px;">Carl Zeiss</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>We use an objective with 0.4 NA and 8.4 mm working distance</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Axiocam HRm digital camera</td>
			<td style="width:100px;">Carl Zeiss</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">ZenBlue 2011 microscope control software</td>
			<td style="width:100px;">Carl Zeiss</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:451px;">Protocol requires microscopy automation and control software to enable capturing of tiled images using a motorized stage</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Methylene Blue</td>
			<td style="width:100px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>&#160;MB-1; 25 grams</td>
			<td>make 2% solution in RO water for use in E3B (below)</td>
		</tr>
		<tr height="273">
			<td height="273" style="height:273px;">E3B</td>
			<td style="width:100px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:451px;">60X E3 SOLUTION: 
			NaCl&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; - 17.2 grams 
			KCl&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; - 0.76 grams 
			CaCl2-2H2O&#160;&#160;&#160;&#160; - 2.9 grams 
			MgSO4-7H2O&#160; - 4.9 grams or MgSO4 &#8211; 2.39 grams 
			Dissolve in 1 liter Milli-Q water; store in sterile 1 liter bottle. 
			 
			1X E3B SOLUTION FOR ZEBRAFISH: 
			60X E3&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 150mls 
			2% methylene blue&#160;&#160;&#160;&#160; 100&#956;l&#160; 
			Bring to 9 liters with Milli-Q water 
			&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

semi-automated imaging of tissue-specific fluorescence in zebrafish embryos

ゼブラフィッシュ胚は、小分子の大規模スクリーニングのための強力なツールである。蛍光レポータータンパク質を発現するトランスジェニックゼブラフィッシュは、しばしば、遺伝子発現を調節する化学物質を同定するために使用される。ライブゼブラフィッシュで蛍光を分析化学の画面は、多くの場合、高含有量のスクリーニングのために高価な、特殊な装置に依存しています。私たちは、電動ステージ自動的に画像ゼブラフィッシュ胚に標準落射蛍光顕微鏡を用いて手順を説明し、組織特異的な蛍光を検出。 GFPの発現を介して、エストロゲン受容体活性を報告するトランスジェニックゼブラフィッシュを用いて、組織特異的にレポーターを活性化するエストロゲン受容体のリガンドをスクリーニングするための半自動化された手順を開発した。このビデオでは、96穴プレートに24〜48時間後に受精（HPF）でゼブラフィッシュ胚を配列し、エストロゲン受容体に結合する小分子を追加するための手順について説明します。 72〜96 HPFで、それぞれの画像は、ウェルからプレート全体が自動的に収集され、手動で組織特異的な蛍光検査される。このプロトコルは、心臓弁ではなく、肝臓での受容体を活性化エストロゲンを検出する能力を実証する。

図1は、96ウェルプレートの各ウェルからの合成画像を示している。各合成画像は、5％の画像の重複を有する59個々の画像から構成されている。ライブゼブラフィッシュは、各ウェル内でランダムに配向していることに注意してください、まだ我々は、肝臓から心臓内の蛍光を区別することができます。明視野画像は、ゼブラフィッシュの方向性を評価し、形態異常（ 図1A?...

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Semi-automated Imaging of Tissue-specific Fluorescence in Zebrafish Embryos

ゼブラフィッシュ胚における組織特異的蛍光の半自動イメージング

ここで説明するには、ゼブラフィッシュ胚における組織特異的な蛍光の半自動イメージングのためのプロトコルです。

Zebrafish embryos are a powerful tool for large-scale screening of small molecules. Transgenic zebrafish that express fluorescent reporter proteins are ...

Research

JoVE Journal

Biology

Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos

ライブゼブラフィッシュの胚における二光子軸索切断とタイムラプス共焦点イメージング

Zebrafish have long been utilized to study the cellular and molecular mechanisms of development by time-lapse imaging of the living transparent embryo.  ...

Generating Chimeric Zebrafish Embryos by Transplantation

移植によるキメラゼブラフィッシュ胚の生成

One of the most powerful tools used to gain insight into complex developmental processes is the analysis of chimeric embryos. A chimera is defined as an ...

Semi-automated Optical Heartbeat Analysis of Small Hearts

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We have developed a method for analyzing high speed optical recordings from Drosophila, zebrafish and embryonic mouse hearts (Fink, et. al., 2009). Our ...

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Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

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キメラゼブラフィッシュ胚における網膜と脳の開発のライブイメージングのためのGFP発現割球の移植

Cells change extensively in their locations and property during embryogenesis. These changes are regulated by the interactions between the cells and their ...

Upright Imaging of Drosophila Embryos

Upright Imaging of Drosophila Embryos

の直立イメージングショウジョウバエ胚

Several well-known morphogenetic gradients and cellular movements occur along the dorsal/ventral axis of the Drosophila embryo. However, the current ...

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Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

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Chromatin Immunoprecipitation Assay for Tissue-specific Genes using Early-stage Mouse Embryos

初期段階のマウス胚を用いて組織特異的遺伝子のためのクロマチン免疫沈降アッセイ

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a powerful tool to identify protein:chromatin interactions that occur in the context of living cells 1-3. This ...

Imaging Glycans in Zebrafish Embryos by Metabolic Labeling and Bioorthogonal Click Chemistry

代謝標識とBioorthogonalクリックケミストリーによるゼブラフィッシュ胚でのイメージンググリカン

Imaging glycans in vivo has recently been enabled using a bioorthogonal chemical reporter strategy by treating cells or organisms with azide- or ...

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A growing goal in the field of metabolism is to determine the impact of genetics on different aspects of mitochondrial function. Understanding these ...