Name: semi-automated imaging of tissue-specific fluorescence in zebrafish embryos
Uploaded: 2014-05-17T17:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Semi-automated Imaging of Tissue-specific Fluorescence in Zebrafish Embryos at JoVE.com

Vi tackar Susan Farmer och personalen på UAB zebrafisk forskningsanläggning för zebrafisk vård. Finansieringen tillhandahålls av startpeng från Institutionen för farmakologi och toxikologi.

OBS: Detta protokoll godkändes av University of Alabama i Birmingham Institutional Animal Care och användning kommittén. 1. Zebrafish Avel och ägg samlingar <ol><li> Tre dagar innan kemisk exponering, montera avelstankar med avdelare till separata män och kvinnor. Fyll varje tank halvvägs med vattenbruk systemet vatten. Med hjälp av ett nät, överföra Tg (5xERE: GFP) c262/c262 fisk till avelstankar, placera 2 hanar och 3 honor i varje tank åtskilda av en avdel...

<ol>
	<li>Molina, G., Watkins, S., Tsang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+FGF+reporter+transgenic+zebrafish+and+their+utility+in+chemical+screens.">Generation of FGF reporter transgenic zebrafish and their utility in chemical screens.</a> BMC Developmental Biology. 7, 62 (2007).</li><li>Perz-Edwards, A., Hardison, N. L., Linney, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoic+acid-mediated+gene+expression+in+transgenic+reporter+zebrafish.">Retinoic acid-mediated gene expression in transgenic reporter zebrafish.</a> Developmental Biology. , 89-101 (2001).</li><li>Gorelick, D. A., Halpern, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+Estrogen+Receptor+Transcriptional+Activation+in+Zebrafish.">Visualization of Estrogen Receptor Transcriptional Activation in Zebrafish.</a> Endocrinology. 152, 2690-2703 (2011).</li><li>Tsang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish:+A+tool+for+chemical+screens.">Zebrafish: A tool for chemical screens.</a> Birth Defects Research Part C: Embryo Today: Reviews. 90, 185-192 (2010).</li><li>Peravali, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+feature+detection+and+imaging+for+high-resolution+screening+of+zebrafish+embryos.">Automated feature detection and imaging for high-resolution screening of zebrafish embryos.</a> Biotechniques. 50, 319-324 (2011).</li><li>Walker, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+reporter+quantification+in+vivo:+high-throughput+screening+method+for+reporter-based+assays+in+zebrafish.">Automated reporter quantification in vivo: high-throughput screening method for reporter-based assays in zebrafish.</a> PLoS One. 7, (2012).</li><li>Vogt, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+image-based+phenotypic+analysis+in+zebrafish+embryos.">Automated image-based phenotypic analysis in zebrafish embryos.</a> Developmental Dynamics. 238, 656-663 (2009).</li><li>Vogt, A., Codore, H., Day, B. W., Hukriede, N. A., Tsang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+automated+imaging+and+analysis+for+zebrafish+chemical+screens.">Development of automated imaging and analysis for zebrafish chemical screens.</a> J. Vis. Exp. , (2010).</li><li>Gruber, C. J., Gruber, D. M., Gruber, I. M., Wieser, F., Huber, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomy+of+the+estrogen+response+element.">Anatomy of the estrogen response element.</a> Trends in Endocrinology and Metabolism. 15, 73-78 (2004).</li><li>Rovira, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+screen+identifies+FDA-approved+drugs+and+target+pathways+that+induce+precocious+pancreatic+endocrine+differentiation.">Chemical screen identifies FDA-approved drugs and target pathways that induce precocious pancreatic endocrine differentiation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 108, 19264-19269 (2011).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Zebrafish+Book:+A+guide+for+the+laboratory+use+of+zebrafish+(Danio+rerio).">The Zebrafish Book: A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio).</a> , (2000).</li></ol>

Detta protokoll beskriver en enkel metod för att automatiskt bildvävnadsspecifika fluorescens i zebrafisk embryon. Det protokoll som har utvecklats med hjälp av en Zeiss Axio Observer. Z1 med Zen Blue 2011 programvara, men den teknik som kan anpassas för användning av någon inverterat mikroskop med en motoriserad scen och programvara mikroskop kontroll som kan utföra plattsättning för att skapa sammansatta bilder. Att utrusta ett inverterat mikroskop med en motoriserad skede kan ge en praktisk, billigare altern...

Transgen zebrafisk har utvecklats som gör det möjligt att direkt visualisering av aktivitet i signalvägar, exempelvis fibroblasttillväxtfaktörer 1, retinoinsyra 2 och östrogener 3, i levande embryon. Sådana verktyg möjliggör screening för kemikalier som stör signalvägar (analyserade som förändring i fluorescensintensiteten) eller för kemikalier som modulerar signalering i ett vävnadsspecifikt sätt (förändring i fluorescens lokalisering) 4. Automatisk bildtagning ökar genomströmningen av kemiska skärmar dramatiskt 5,6. Skärmar som automatiskt analys fluorescens i levande zebrafisk litar ofta på dyra, specialutrustning. Så kallade high-halt screening ger fördelen med hög upplösning, kvantitativ avbildning men till priset av att använda specialiserade plattläsare utrustade för konfokalmikroskopi 7,8. Målet med denna metod är att automatiskt analysvävnadsspecifika fluorescens i zebrafisk embryoni en 96-brunnars platta med användning av en standard-epifluorescensmikroskop. Tissue-specifik fluorescens kan urskiljas med hjälp av denna teknik och kan vara en rimlig strategi för laboratorier som saknar tillgång till specialiserade plattläsare eller hög halt screening utrustning. I detta protokoll använder vi automatiserad bildbehandling för att upptäcka vävnadsspecifik östrogenreceptorn (ER) agonister i levande zebrafisk på 3 dagar efter befruktningen (DPF). Den transgena linje Tg (5xERE: GFP) c262/c262 innehåller fem tandemöstrogenresponselement-DNA-sekvenser (ERE) uppströms från grönt fluorescerande protein (GFP) 3. I frånvaro av ligand, ER är normalt inaktiva. Ligandbindning utlöser en konformationsförändring, vilket gör receptorer att binda ERE DNA och reglerar transkriptionen 9. 5xERE: GFP fisk kan användas för att screena kemiska bibliotek för ER-modulatorer och kan användas för att screena prover omgivningsvatten för östrogena föroreningar.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:885px;" width="886">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:100px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:451px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Plastic transfer pipettes; wide bore</td>
			<td style="width:100px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">13-711-23</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Plastic transfer pipettes; fine tip</td>
			<td style="width:100px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">13-711-26</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">96-well, round, flat bottom plates</td>
			<td style="width:100px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">21-377-203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">100 x 35mm paltes</td>
			<td style="width:100px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">08-757-100D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">35 x 60mm plates</td>
			<td style="width:100px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">08-757-100B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Dumont #5 fine forceps</td>
			<td style="width:100px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:119px;">11254-20</td>
			<td>tip dimensions 0.05 x 0.01 mm, for manually removing chorions from embryos</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Tricane methanesulfonate</td>
			<td style="width:100px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A5040-25G</td>
			<td>see Zebrafish Book for recipe (http://zfin.org/zf_info/zfbook/chapt10.html#wptohtml63)&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1-phenyl 2-thiourea (PTU)</td>
			<td style="width:100px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P7629-10G</td>
			<td>Prepare 20 mM stock (100x) and use at 200 &#956;M in E3B&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Zeiss Axio Observer Z1</td>
			<td style="width:100px;">Carl Zeiss</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:451px;">Protocol requires an inverted fluorescence microscope with a motorized stage</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">20x long working distance objective</td>
			<td style="width:100px;">Carl Zeiss</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>We use an objective with 0.4 NA and 8.4 mm working distance</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Axiocam HRm digital camera</td>
			<td style="width:100px;">Carl Zeiss</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">ZenBlue 2011 microscope control software</td>
			<td style="width:100px;">Carl Zeiss</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:451px;">Protocol requires microscopy automation and control software to enable capturing of tiled images using a motorized stage</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Methylene Blue</td>
			<td style="width:100px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>&#160;MB-1; 25 grams</td>
			<td>make 2% solution in RO water for use in E3B (below)</td>
		</tr>
		<tr height="273">
			<td height="273" style="height:273px;">E3B</td>
			<td style="width:100px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:451px;">60X E3 SOLUTION: 
			NaCl&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; - 17.2 grams 
			KCl&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; - 0.76 grams 
			CaCl2-2H2O&#160;&#160;&#160;&#160; - 2.9 grams 
			MgSO4-7H2O&#160; - 4.9 grams or MgSO4 &#8211; 2.39 grams 
			Dissolve in 1 liter Milli-Q water; store in sterile 1 liter bottle. 
			 
			1X E3B SOLUTION FOR ZEBRAFISH: 
			60X E3&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 150mls 
			2% methylene blue&#160;&#160;&#160;&#160; 100&#956;l&#160; 
			Bring to 9 liters with Milli-Q water 
			&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

semi-automated imaging of tissue-specific fluorescence in zebrafish embryos

Zebrafiskembryon är ett kraftfullt verktyg för storskalig screening av små molekyler. Transgen zebrafisk som uttrycker fluorescerande reporterproteiner används ofta för att identifiera kemikalier som modulerar genexpression. Kemiska skärmar som analys fluorescens i levande zebrafisk är ofta beroende dyra, specialutrustning för hög halt screening. Vi beskriver ett förfarande med en vanlig epifluorescensmikroskop med en motoriserad scen till automatiskt bildzebrafisk embryon och upptäcka vävnadsspecifik fluorescens. Med hjälp av transgena zebrafisk som rapporterar östrogenreceptoraktivitet via uttryck av GFP, utvecklade vi en halvautomatisk förfarande för att screena för östrogenreceptorligander som aktiverar reportern i ett vävnadsspecifikt sätt. I denna video beskriver vi förfaranden för grupperande zebrafiskembryon vid 24-48 timmar efter befruktning (HPF) i en 96-brunnsplatta och tillsats av små molekyler som binder östrogenreceptorer. Vid 72-96 HPF, bilder av varje brunn frånhela plattan automatiskt samlas in och manuellt inspekteras för vävnadsspecifik fluorescens. Detta protokoll demonstrerar förmågan att detektera östrogener som aktiverar receptorer i hjärtklaffar, men inte i lever.

Fig. 1 visar sammansatta bilder från enskilda brunnar i en 96-brunnsplatta. Varje sammansatt bild är sammansatt av 59 enskilda bilder med 5% bild överlappning. Observera att levande zebrafisk är orienterade slumpmässigt inom varje brunn, men vi kan urskilja fluorescens i hjärtat från levern. Brightfield bilder är användbara som referenser för att bedöma zebrafisk orientering och visualisera morfologiska abnormiteter (figurerna 1A och 1C). Automatiserad avbildning med en 10x m...

Watch this Scientific Journal Video about Semi-automated Imaging of Tissue-specific Fluorescence in Zebrafish Embryos at JoVE.com

Semi-automated Imaging of Tissue-specific Fluorescence in Zebrafish Embryos

Semi-automatisk avbildning av vävnad-specifika fluorescens i Zebrafish embryon

Beskrivet här är ett protokoll för halvautomatiserad avbildning av vävnadsspecifik fluorescens i zebrafiskembryon.

Zebrafish embryos are a powerful tool for large-scale screening of small molecules. Transgenic zebrafish that express fluorescent reporter proteins are ...

Research

JoVE Journal

Biology

Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos

Två-foton axotomy och Time-lapse konfokala imaging i levande zebrafisk embryon

Zebrafish have long been utilized to study the cellular and molecular mechanisms of development by time-lapse imaging of the living transparent embryo.  ...

Generating Chimeric Zebrafish Embryos by Transplantation

Generera chimär Zebrafish embryon genom transplantation

One of the most powerful tools used to gain insight into complex developmental processes is the analysis of chimeric embryos. A chimera is defined as an ...

Semi-automated Optical Heartbeat Analysis of Small Hearts

Semi-automatisk optisk Heartbeat Analys av små hjärtan

We have developed a method for analyzing high speed optical recordings from Drosophila, zebrafish and embryonic mouse hearts (Fink, et. al., 2009). Our ...

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Time-lapse avbildning av Mitos Efter siRNA Transfektion

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

Transplantation of GFP-expressing Blastomeres for Live Imaging of Retinal and Brain Development in Chimeric Zebrafish Embryos

Transplantation av GFP-uttryckande blastomerer för Live avbildning av näthinnan och hjärnans utveckling hos chimära Zebrafish embryon

Cells change extensively in their locations and property during embryogenesis. These changes are regulated by the interactions between the cells and their ...

Upright Imaging of Drosophila Embryos

Upright Imaging of Drosophila Embryos

Upprätt Imaging av Drosophila Embryon

Several well-known morphogenetic gradients and cellular movements occur along the dorsal/ventral axis of the Drosophila embryo. However, the current ...

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

Imaging Cell Shape Förändring Living Drosophila Embryon

The developing Drosophila melanogaster embryo undergoes a number of cell shape changes that are highly amenable to live confocal imaging.  Cell shape ...

Chromatin Immunoprecipitation Assay for Tissue-specific Genes using Early-stage Mouse Embryos

Kromatin Immunoprecipitation analys för Tissue-specifika gener med början av karriären musembryon

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a powerful tool to identify protein:chromatin interactions that occur in the context of living cells 1-3. This ...

Imaging Glycans in Zebrafish Embryos by Metabolic Labeling and Bioorthogonal Click Chemistry

Imaging glycans i Zebrafish embryon genom Metabola märkning och Bioorthogonal Klicka Kemi

Imaging glycans in vivo has recently been enabled using a bioorthogonal chemical reporter strategy by treating cells or organisms with azide- or ...

Metabolic Profile Analysis of Zebrafish Embryos

Metabolisk profil Analys av zebrafisk embryon

A growing goal in the field of metabolism is to determine the impact of genetics on different aspects of mitochondrial function. Understanding these ...