Name: assessing species-specific contributions to craniofacial development using quail-duck chimeras
Uploaded: 2014-05-31T14:00:00
Duration: 9 min 38 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assessing Species-specific Contributions To Craniofacial Development Using Quail-duck Chimeras at JoVE.com

Dit werk werd gefinancierd door een National Institute of Dental en Craniofacial Onderzoek (NIDCR) F32-subsidie ​​(DE021929) naar JLF en een NIDCR R01 subsidie ​​DE016402 RAS

1. Bereid Tungsten Naalden <ol><li> Snijd een wolfraamstaaf in de helft gebruik draadsnijders zodat de stang niet buigt. </li><li> Rijg de stang door de taps toelopende einde van een 5 3/4 in borosilicaatglas Pasteur pipet. </li><li> Laat ongeveer 3/4 van de staaf steken van het glas, hechten de stang om de pipet tip met een kleine kraal van &quot;smeltlijm&quot; (HMA), dat is de lijm stok gebruikt voor een lijmpistool. De HMA moet snel worden gesmolten in een alcohol vlam, let op dat de lijm niet te branden en het genereren van zwarte rook. </li><li> Met een pincet, buig de punt van de wolfraamstaaf (ongeveer 1/4 vanaf de bovenkant) tot 45 ° wordt bereikt. </li><li> Houd de Pasteur pipet, plaats ongeveer 1/8 in de punt van de wolfraam staafje in de vlam van een propaantoorts. Houd de tip stabiel en precies loodrecht op de vlam. </li><li> Trek de naald uit de vlam het moment dat een klein oranje stipje wolfraatien vliegen af ​​van de naald. </li></ol> 2. Bereid Spemann pipetten <ol><li> Tot het glas iets voorbij de conische smelt behulp van een Bunsen brander verhit het dunne uiteinde van een Pasteur pipet. Verwijderen uit vlam en trek de punt totdat de pipet wordt verzegeld. Wees er zeker van dat er nog een deel van de taps toelopende deel dat een OD van ongeveer 0,7-1,0 mm heeft. Breek de verzegelde einde uit ongeveer 4 cm van de conus. </li><li> Bevestig ongeveer 2 voet (60 cm) rubber slang aan de brede (open) uiteinde van de pipet. Blaas het andere uiteinde van de rubber slang zodat er geen lucht door het tapse gedeelte van het Pasteur pipet. </li><li> Met behulp van een propaan brandstof cilinder met een aangrenzende pen vlamtoorts Verhit een ovaal gebied aan een zijde van de pipet net onder het begin van de conus. Blaas zachtjes en voortdurend door de rubber buis met een kleine hoeveelheid druk (ongeveer hoeveelheid druk nodig is om het begin van de lette zeggenr &quot;P&quot; op conversatie niveau). Wanneer het glas wordt zacht enerzijds en begint naar buiten knikken, snel van de vlam verwijder de pipet en blaas hard en stabiel door de rubber slang. Hierdoor wordt het verwarmde uiteinde van de glazen een worst-vormige bel die pop, wat fijn vormen. Als de luchtbel te klein is, probeer smelten en opnieuw blazen het glas. De laatste open raam in het glas moet rond 0.25 in (6,35 mm) breed en 0.5 inch (12,7 mm) lang. </li><li> Wijzend het taps toelopende einde omhoog, schraap de bel in een glazen afvalcontainer terwijl waait zachtjes door de slang om te voorkomen dat glasscherven in het invoeren van de pipet. </li><li> Met behulp van de propaan vlam, branden de resterende randen van de zeepbel en de brand-Pools de zijkanten van het open raam. Zorg de as van de pipet niet smelten. </li><li> Met behulp van een diamant punt potlood, scoren het taps toelopende einde van de pipet ongeveer 1.25 in (30 mm) uit het raam en afbreken van de tipmet een pincet zodat de pipet opening wordt netjes afgesneden (discard pipetten met gebroken of oneffen tips). </li><li> Gebruik tang en de rand van een vlam uit een alcohol brander, buig het smalle gedeelte van de pipet 0,375 cm (9,5 mm) van het uiteinde een hoek van ongeveer 60 ° zodat het gebogen gedeelte in een verticaal vlak wanneer de vensteropening is bij de 1:00 positie voor rechtshandig gebruik en 11:00 voor linkshandig gebruik. Deze stap wordt het best uitgevoerd in een tochtvrije behuizing. </li><li> Brand-polish de punt met behulp van de alcohol vlam onder een dissectie microscoop. Zorg ervoor dat u niet te dicht langs de punt, maar houden de openingsronde en glad zonder vernauwing. </li><li> Snij een 1 in (25 mm) stuk rubber slang, spuit het stuk slang met 70% ethanol, en schuif de slang over de as van de pipet tot de raamopening geheel bedekt is. Dit functioneert als het &quot;membraan&quot; van de Spemann pipet. </li><li> Plaats een latex rubber 2 ml bulbboven de open bodem van de pipet. De lamp handhaaft negatieve druk in de Spemann pipet. </li><li> Oefenen met een Spemann pipet chromatografie kralen van ongeveer 100-200 micrometer in diameter van een gemarkeerde plaats in een petrischaal op een gemarkeerde plaats in een andere onder een microscoop. </li><li> Om de Spemann pipet schoon, verwijder de rubberen bol en plaats pipet tip naar beneden, in een hoog bekerglas gevoerd met katoen of gaas op de bodem en gevuld met gedestilleerd water en glaswerk detergent. </li></ol> 3. Steriliseren en Incubate Eieren <ol><li> Veeg eieren met 70% ethanol en leg de eieren op plastic eiertrays. </li><li> Stel eieren in een verwarmde incubator bij 37,5 ° C en 85-87%. </li><li> Uitbroeden eieren totdat ze HH9.5, ongeveer 26 uur voor kwartels en 48 uur voor de eend te bereiken. </li></ol> 4. Window Eggs <ol><li> Verwijderen van een klein stukje van de buitenste schil van de bovenkant van het ei met een pincet, het verzorgen van de binnenste schil m niet te doorborenembrane. </li><li> Met behulp van een spuit met een 18 G met 1-inch naald, prik een gat op het smalste punt van het ei en ongeveer 1-2 ml albumine in te trekken. </li><li> Plaats transparante tape over het gat en punctie merk in de schelp. </li><li> Snij een &quot;venster&quot; langs het bovenoppervlak van het ei (via de transparante tape) met gebogen schaar. </li></ol> 5. Visualiseer Embryo&#39;s en voorbereiden voor Heelkunde <ol><li> Met behulp van een glasstaaf voorzichtig borstelen een kleine hoeveelheid neutraal rood (0,02 g / ml in Hank&#39;s BSS) via embryo. </li><li> Snijd de vitelline membraan en trek hem over de embryo met behulp van een vlam geslepen wolfraam naald. </li><li> Opnieuw verzegelen het ei door het plaatsen van transparante tape over het raam. </li></ol> 6. Scheid de donorweefsel van de Donor Embryo <ol><li> Verwijder tape van het venster op het ei van de donor embryo. </li><li> Om de neurale plooi gesneden uit de aangrenzende ectoderm van de donor embryo, maken sleuven aan beide sides van de neurale buis, met behulp van een vlam geslepen wolfraam naald (vervaardigd zoals boven beschreven). </li><li> Vervolgens dwars door de neurale buis op de gewenste voorste en achterste lagen van de graft en scheiden het transplantaat van de rest van de neurale buis. </li><li> Verwijder de neurale plooi van de donor embryo behulp van een Spemann pipet of ander type micropipet. </li><li> Verwijder dan de tape van het venster op de host ei en gebruik Spemann pipet om de donor neurale vouw langs de ontvangende embryo grenst aan de regio van de neurale buis die de transplantatie ontvangen. </li></ol> 7. Scheid de Host Tissue en Transplant het donorweefsel <ol><li> Scheid de neurale plooi van de neurale buis van de gastheer embryo, zoals gedaan met de donor. Zorg ervoor dat een ent van gelijke grootte te verwijderen als het donorweefsel. </li><li> Duw zachtjes deze host weefsel ver weg van het embryo. </li><li> Dan, met een stompe wolfraam naald of de afgeronde top van een micropipette, beweeg de donor neurale vouwen in de gastheer neurale buis, handhaven van de juiste antero-posterior en dorso-ventrale oriëntaties. Zorg ervoor dat het transplantaat is verscholen in langs de zijkanten, maar zeker niet te porren of schade aan de onderliggende weefsels. Om u te helpen bijhouden van de oorspronkelijke oriëntatie noot eventuele asymmetrie in het donorweefsel of differentiële kleuring van de Neutrale Red. We hebben ook foto-document de donor embryo met het bijbehorende uitgesneden weefsel, evenals de chimere onmiddellijk na chirurgie. </li><li> Steriele zoutoplossing worden toegevoegd aan het ei als de ontvangende embryo tekenen van uitdroging. </li><li> Nu voorzichtig terug afdichting en label het ei, en voorzichtig terug te sturen naar een hoge luchtvochtigheid incubator (70-80%), waar het chimere embryo kan ontwikkelen om de gewenste fase voor analyse. </li></ol> 8. Collectie van Chimeras <ol><li> Zorg ervoor dat chimere embryo&#39;s in vers gemaakte koude Serra&#39;s fixatief verzamelen en plaatsen ze direct op een rocker bij 4 ° C gedurende een O / N fixatie. Dit zal zorgen voor meer gevoelige detectie van kwartel cellen met de anti-kwartel antilichaam. </li><li> Voor genexpressie-analyses via RT-qPCR, bevriezen embryo&#39;s rechtstreeks in vloeibare stikstof voorafgaand aan RNA-extractie. </li></ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

De neurale een voorbijgaande embryonale celpopulatie die uitgebreid migreert hele embryo en differentieert in diverse celtypen, waaronder chondrocyten en osteoblasten, die bijdragen aan het craniofaciale skelet. Het transplanteren van de neurale lijst in de kwartel-eend chimere systeem heeft veel bijgedragen aan ons begrip van het weefsel interacties en signaalwegen in de ontwikkeling van het craniofaciale skelet reguleren. Echter, gezien de enorme mogelijkheden van neurale lijst te genereren ook gladde spiercellen, adipocyten, melanocyten, Schwann-cellen en neuronen, de kwartel-eend chimera systeem heeft een enorm potentieel voor toekomstige toepassingen, met name in combinatie met de snelle vooruitgang van de biologie van de stamcel en regeneratieve geneeskunde. Sinds kwartel en eend zijn zowel commercieel gekweekt soorten, een klaar levering van relatief goedkope bevruchte eieren is beschikbaar uit een verscheidenheid van bedrijven. Daarom moet deze techniek toegankelijk zijn researchare die binnen een breed scala van budgetten en facilitaire ruimte. Hoewel deze techniek zeer krachtig, blijven er verscheidene beperkingen. Net als andere chirurgische technieken, de kwaliteit en de houdbaarheid van kwartel eend chimeren vertrouwen op de chirurgische vaardigheden van de onderzoeker, en daarom zal er meer inter-en intra-individuele variatie tussen experimenten in vergelijking met andere modellen, zoals gebruik muis te genetica. Bovendien is er ook variatie in het ontwikkelingstempo en stadia van individuele embryo dat tot de reproduceerbaarheid en het succes van elk transplantaat. Vogelembryo&#39;s zijn ook zeer gevoelig voor uitdroging en dus kritische stappen tijdens chirurgie inhouden dat de lage lichtniveaus, de tijd onder de microscoop minste de gesloten met plakband zoveel mogelijk eieren en hoge vochtigheid in de postoperatieve incubator voorkomen uitdroging. In termen van de levensvatbaarheid van de hersenschimmen, usually tussen 50-75% overleven, hoewel deze percentages de oudere kan verminderen de collectie podium. In een typische 4-6 uur zitting van de operatie, kan een ervaren chirurg 10-15 hersenschimmen genereren. Het succes van de transplantatie hangt ook sterk af van de kwaliteit van het gereedschap. Goed gereedschap leiden tot een meer consistente, reproduceerbare resultaten. Met behulp van een propaantoorts om wolfraam naalden maken laat zeer scherpe naalden worden gemaakt. Het type toorts maakt een groot verschil omdat het bepaalt de grootte van de vlam. Elektrolytisch slijpen kan ook worden gebruikt, maar deze aanpak niet eens in de buurt aan het produceren van naalden zo scherp. Gebruik wolfraam staven in plaats van wachtrij draad zodat de naalden direct kan worden gemaakt. De Spemann micropipet, terwijl tijdrovend en moeilijk te maken, is een ideaal instrument voor weefsel-overdracht. De pipet kan worden aangepast met verschillende grootte openingen, en kan meerdere malen worden gebruikt. Een kritische factor voor usinga Spemann micropipet is om wat vloeistof in de pipet voordat u met de punt naar het oppervlak van het embryo. Een deel van de vloeistof zal altijd vloeien wanneer contact wordt gemaakt met de meniscus over de embryo. Drukken op het membraan laat vloeistof en graft weefsel heel precies worden uitgeworpen, terwijl iets te laten op het membraan voorzichtig zuigt de donor transplantaat weefsel in de pipet. Handhaving wat positieve druk op het membraan blijft de donor transplantaat weefsel aan het uiteinde van pipet tijdens de overdracht, en een beetje extra druk op het membraan kan de donor transplantaat weefsel opzettelijk geplaatst in dezelfde gastheer. Ter bescherming van de Spemann pipet tijdens opslag en sterilisatie, verwijder de lamp uit het brede uiteinde en plaats voorzichtig de taps toelopende tip in de lamp. Plaats de Spemann pipet in een glazen reageerbuis, bedek de bovenkant met aluminiumfolie, en autoclaaf voorafgaand aan de operatie. Na meerdere pipetten zijn ready opnieuw worden gesteriliseerd voor een operatie, keren de pipetten, verwarm ze bijna aan de kook in een zelfde oplossing van gedestilleerd water en glaswerk wasmiddel, en vervolgens herhaaldelijk spoelen met gedistilleerd water. Autoclaaf pipetten in hun individuele buizen. De rubberen slangen die het middenrif en de rubberen peertje vormt moet worden vervangen na een aantal sterilisaties of wanneer ze verduisterd en stijf. Veel van de onderdelen van dit protocol te betrekken gevaarlijke apparatuur. Bijvoorbeeld, de procedure om een ​​Spemann Micropipet omvat drie soorten vlammen en verwarming, trekken, blazen, buigen, snijden en polijsten glas. Daarom is het dragen van de juiste persoonlijke beschermingsmiddelen (PBM), dat de veiligheid verhoogt, zoals een veiligheidsbril en een laboratoriumjas is van cruciaal belang. Bovendien, omdat veel mensen last van, of hebben het potentieel om te ontwikkelen, ei allergie, altijd handschoenen bij het hanteren van eieren. Met deze voorzorgsmaatregelen in het achterhoofd, de kwartel-eend chimere systeem isa veilig, efficiënt en relatief toegankelijke methode die veel toekomstige toepassingen heeft.

Het gezicht skelet ontwikkelt zich uit de groei en fusie van meerdere gezicht processen die zijn samengesteld uit de neurale lijst en mesodermal mesenchym omgeven door ectodermale en endodermale epitheellagen 1-11. Morfogenetische gebeurtenissen binnen elk proces worden beheerst door duidelijke signalering interacties tussen de mesenchym en de omliggende epitheel 12-16. Wijzigingen in deze signalering interacties en / of de stroomafwaartse effectoren bijdragen aan de ziekte fenotypes en kan ook de ontwikkeling van craniofaciale skelet 17, 18 relevant zijn. Daarom is het ophelderen van de timing en de aard van het weefsel interacties heeft een groot potentieel om ons begrip van de ontwikkelings-en evolutionaire biologie van het gezicht skelet verhogen. Het gebruik van chimere embryo&#39;s om weefsel interacties te onderzoeken heeft een lange geschiedenis in de ontwikkelingsbiologie. Deze aanpak is ontwikkeld door Hans Spemann en zijn labdie embryonale &quot;organisatoren&quot; ontdekt door het transplanteren van weefsels tussen de embryo&#39;s van verschillende soorten amfibieën. Spemann was een meester van micro-chirurgische technieken wiens hand-vaardigheden werden aangevuld door zijn ontwikkeling van gespecialiseerde tools, met name de Spemann pipet. Viktor Hamburger was een afgestudeerde student in het laboratorium van Hans Spemann in Freiburg tijdens de jaren 1920, dat is wanneer de oorspronkelijke transplantatie experimenten die leidden tot Spemann de Nobelprijs werden uitgevoerd. Bij Hamburger verhuisde naar Washington University in St. Louis in 1935, gedetailleerd hij het ​​proces van het maken van een Spemann micropipet in zijn Manual of Experimental Embryologie 19. Drew Noden was een afgestudeerde student in het lab Hamburger bij de Universiteit van Washington tot 1972. Na de verhuizing naar de Universiteit van Massachusetts, Amherst en daarna naar Cornell University, Noden voortgezet fabriceren en gebruiken Spemann micropipetten voor zijn chirurgische transplantaties met kwartel-chick hersenschimmen. &amp;# 160;. Terwijl een afgestudeerde student, een van de auteurs (Rich Schneider) getraind met Drew Noden aan de Cornell 1995-1998 Het volgende protocol voor het maken van een Spemann micropipet is gebaseerd op beschrijvingen geschreven door Hamburger en Noden, en omvat de volgende wijzigingen door Schneider. Het gebruik van kwartel-chick chimeren voor de studie van craniofaciale ontwikkeling en vooral voor het begrip van de bijdrage van neurale cellen is ontwikkeld door Noden en Le Douarin in de vroege jaren 1970, beoordeeld Le Douarin et al. 20. Deze benadering is algemeen in veel studies en talrijke andere onderzoekers 1, 4, 5, 21-38 aangenomen. Het equivalent groeicijfers en de morfologie van kwartel en kuiken maken transplantaties binnen ze ideaal voor de studie van cel lot en lineage tracing. Echter, vanwege de overeenkomsten tussen kwartel en kuiken, morfologische veranderingen indhanteerden door donorcellen zijn moeilijk te ontcijferen. In tegenstelling, hebben andere aviaire chimere systemen binnenlandse eend opgenomen als een manier om de mechanismen die embryo anatomisch duidelijke 39-50 te bestuderen. Meer specifiek, de kwartel-eend chimere systeem biedt meerdere voordelen voor het onderscheiden van de effecten van de donor op de host, en vice versa. Eerste, kwartel en eend embryo&#39;s zijn te onderscheiden in het lichaam van grootte en vorm, die een directe manier om donor-of host-specifieke mechanismen van patroonvorming verkennen door te testen op differentiële domeinen van genexpressie (figuren 1 A en B) biedt. Tweede, kwartel en eend embryo&#39;s hebben aanzienlijk verschillende tarieven van rijping, met kwartel eitjes in 17 dagen en eend uitkomen in 28 dagen. Getransplanteerde neurale handhaaft haar intrinsieke rijping tarief binnen de nieuwe omgeving, en dus de identificatie van temporele veranderingen in genexpressie, weefsel interacties, histogenese en morfogenese is mogelijk51-57. Tenslotte, de anti-nucleaire antilichamen kwartel (Q ¢ PN) maakt donor en gastheer cellulaire bijdragen permanent onderscheiden van elkaar door het herkennen van een eiwit dat alomtegenwoordig tot expressie wordt gebracht in kwartel cellen maar afwezig eend cellen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="746">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:169px;">1x PBS</td>
			<td style="width:180px;">TEK</td>
			<td style="width:145px;">TEKZR114</td>
			<td style="width:252px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:169px;">Hank&#8217;s BSS w/o Phenol Red</td>
			<td style="width:180px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:145px;">14025-092</td>
			<td style="width:252px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:169px;">Neutral Red</td>
			<td style="width:180px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:145px;">N4638-5G</td>
			<td style="width:252px;">.22&#181;m filter-sterilized</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:169px;">18G Needles</td>
			<td style="width:180px;">BD</td>
			<td style="width:145px;">305195</td>
			<td style="width:252px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:169px;">5 ml syringe</td>
			<td style="width:180px;">BD</td>
			<td style="width:145px;">309646</td>
			<td style="width:252px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:169px;">No. 5 Dumont forceps</td>
			<td style="width:180px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:145px;">11252-20</td>
			<td style="width:252px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:169px;">Straight Scissors</td>
			<td style="width:180px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:145px;">14028-10</td>
			<td style="width:252px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:169px;">Curved Scissors</td>
			<td style="width:180px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:145px;">14029-10</td>
			<td style="width:252px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:169px;">Spemann Pipet</td>
			<td style="width:180px;"></td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td style="width:252px;">Hand-made in lab</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:169px;">Egg holder</td>
			<td style="width:180px;"></td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td style="width:252px;">Glass ashtray and modeling clay</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:169px;">Alcohol burner</td>
			<td style="width:180px;">Fisher</td>
			<td style="width:145px;">04-245-1</td>
			<td style="width:252px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:169px;">Transparent tape</td>
			<td style="width:180px;">3M Scotch</td>
			<td style="width:145px;">600</td>
			<td style="width:252px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:169px;">Glass Stirring Rod</td>
			<td style="width:180px;">Fisher</td>
			<td style="width:145px;">11-380C</td>
			<td style="width:252px;">Tip is narrowed and rounded using a flame</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:169px;">Tungston wire (.004 x 3 inches)</td>
			<td style="width:180px;">A-M Systems</td>
			<td style="width:145px;">7190</td>
			<td style="width:252px;">Tip is flame-sharpened in a propane torch</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bunsun burner</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>&#160;S49117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pasteur pipette</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>&#160;22-183-632</td>
			<td>9-inch (229 mm)&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="81">
			<td height="81" style="height:81px;width:169px;">rubber tubing</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>14-178C</td>
			<td style="width:252px;">amber, thin wall natural rubber; wall thickness: 0.0625 inches/1.6 mm; O.D.: 0.375 inches/9.5 mm; I.D.: 0.25 inches/6.4mm</td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;">&#160;Propane fuel cylinder</td>
			<td>BernzOmatic</td>
			<td>UL2317</td>
			<td style="width:252px;">&#160;TX-9 with torch style &#34;A&#34; with a screw-on brass &#34;pencil flame&#34; torch&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Diamond point pencil</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>&#160;22-268912</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rubber bulbs</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>S32325</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessing species-specific contributions to craniofacial development using quail-duck chimeras

De generatie van chimere embryo&#39;s is een wijdverspreide en krachtige aanpak van celtypes, weefsel interacties en soortspecifieke bijdragen aan de histologische en morfologische ontwikkeling van gewervelde embryo&#39;s te bestuderen. Met name het gebruik van chimere embryo het belang van neurale vastgesteld richten van de species-specifieke morfologie van het craniofaciale complex. De hierin beschreven werkwijze maakt gebruik van twee vogelsoorten, eend en kwartel, met opmerkelijk verschillend craniofaciale morfologie. Deze methode aanzienlijk vergemakkelijkt het onderzoek van de moleculaire en cellulaire regulatie van soortspecifieke patroon in het craniofaciale complex. Experimenten in kwartel en eend chimere embryo&#39;s hebben al onthuld neurale-kuif gemedieerde weefsel interacties en cel-autonome gedrag dat soort-specifiek patroon in het craniofaciale skelet, spieren, en integument reguleren. De grote diversiteit van neurale derivaten suggereert aanzienlijk potentieelvoor toekomstige toepassingen van de kwartel eend chimere systeem begrijpen gewervelde ontwikkeling, ziekte en evolutie.

Voorafgaand aan verdere analyse, de efficiëntie van het transplantaat moet worden getest. Voor histologische, morfologische, of genexpressie analyses van weefselmonsters, moet kwartel cellen worden gedetecteerd door immunohistochemie met behulp van Q ¢ PN antilichaam zoals beschreven 36. Voor RNA-analyses, kunnen soortspecifieke bijdragen aan weefsels van belang worden berekend met behulp van een PCR-gebaseerde strategie 58. Na de werkzaamheid van het transplantaat is gevalideerd kunnen verdere morfologische en moleculaire meetinstrumenten worden beoordeeld chimeren. Interacties tussen de donor neurale lijst cellen en omliggende gastheer afkomstig weefsel dat een goede histogenese en morfogenese van het craniofaciale complex ten grondslag liggen zijn eerder uitvoerig bestudeerd. In het bijzonder neurale mesenchym regisseert soortspecifieke morfologie van het gezicht 7, 13, 51, 59, veer patroon 52, spier-patroon 56 </s<html> inschrijven&gt;, en kraakbeen 53, 57 door de regulering van gastheer genexpressie. Bijvoorbeeld, neurale mesenchym dicteert wanneer bot vormen in de onderkaak door tijdelijk reguleren Bmp4 expressie 55. Onlangs heeft het onderzoek gericht op weefsel interacties voorkwamen heel vroeg in craniofaciale ontwikkeling. In dit verband, experimenten met behulp van kwartel-eend hersenschimmen hebben aangetoond gastheer embryo beïnvloeden neurale migratie door het bepalen van morfologische grenzen. Dat wil zeggen, in chimere quck embryo, donor kwartel neurale lijst cellen migreren naar de gastheer eend onderkaak boog in een eend-achtig patroon (figuur 1D). Ondanks deze bijdrage gastheer voor de omvang van de neurale populatie, de donor neurale blijft onderkaak skelet dat kwartel-achtige vorm en grootte (figuur 1E) genereren. e 1 &quot;fo: content-width =&quot; 6in &quot;fo: src =&quot; / files/ftp_upload/51534/51534fig1highres.jpg &quot;src =&quot; / files/ftp_upload/51534/51534fig1.jpg &quot;/&gt; Figuur 1. Quail-Eend Chimeric System. (A) kwartel en (B) eend schedels tonen aanzienlijke verschillen in grootte en vorm, en derhalve zijn ideaal voor het gebruik van een chimeer systeem craniofaciale ontwikkeling bestuderen (gewijzigd van Tokia et al.. 56). (C) Proefopzet opwekken eenzijdige chimere quck embryo&#39;s van stadium afgestemd HH9.5 kwartel en eend embryo&#39;s. De neurale plooi wordt verwijderd van een kant van kwartels embryo en getransplanteerd in eenden embryo na een equivalent stuk van de neurale plooi is verwijderd. (D) Quail donorcellen (groen) kan worden gevolgd chimeren met een anti-kwartel antilichaam (Q ¢ PN), zoals in ventrale oog op UU12 chimere embryo. (V) In quck kaken op HH38, de kwartel donor-afgeleide Meckel7, s kraakbeen korter en rechter dan die waargenomen voor de contralaterale eend gastheer afkomstig Meckel kraakbeen, die groter en gebogen. Herdrukt Tokita et al.., Dev. Bio. 306, 377 (2007) met toestemming van Elsevier.

Watch this Scientific Journal Video about Assessing Species-specific Contributions To Craniofacial Development Using Quail-duck Chimeras at JoVE.com

Assessing Species-specific Contributions To Craniofacial Development Using Quail-duck Chimeras

Het beoordelen Soortspecifieke Bijdragen aan craniofaciale ontwikkeling met behulp van Quail-eend Chimeras

Dit artikel beschrijft een werkwijze voor chimeer embryo&#39;s die zijn ontworpen om de soortspecifieke bijdragen van neurale en / of andere weefsels craniofaciale ontwikkeling testen genereren.

The generation of chimeric embryos is a widespread and powerful approach to study cell fates, tissue interactions, and species-specific contributions to ...

Research

JoVE Journal

Biology

Development of New Therapeutic Applications Using Microfluidics

Ontwikkeling van nieuwe therapeutische toepassingen met Microfluidics

In vivo Bioluminescent Imaging of Mammary Tumors Using IVIS Spectrum

In vivo Bioluminescent Imaging of Mammary Tumors Using IVIS Spectrum

In vivo Bioluminescent Imaging van borsttumoren gebruik van IVIS Spectrum

4T1 mouse mammary tumor cells can be implanted sub-cutaneously in nu/nu mice to form palpable tumors in 15 to 20 days. This xenograft tumor model system ...

Tissue Targeted Embryonic Chimeras: Zebrafish Gastrula Cell Transplantation

Tissue Gerichte Embryonale Chimera: Zebravis gastrula Cell Transplantation

Certain fundamental questions in the field of developmental biology can only be answered when cells are placed in novel environments or when small groups ...

Using the GELFREE 8100 Fractionation System for Molecular Weight-Based Fractionation with Liquid Phase Recovery

Met behulp van de GELFREE 8100 Fractionering System for Molecular Weight-Based Fractionering met Liquid Phase Recovery

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based ...

Assessing Signaling Properties of Ectodermal Epithelia During Craniofacial Development

Het beoordelen van Signalering Eigenschappen van ectodermale epitheel Tijdens craniofaciale ontwikkeling

The accessibility of avian embryos has helped experimental embryologists understand the fates of cells during development and the role of tissue ...

Electroporation of Craniofacial Mesenchyme

Elektroporatie van Craniofaciale Mesenchym

Electroporation is an efficient method of delivering DNA and other charged macromolecules into tissues at precise time points and in precise locations. ...

A Semi-quantitative Approach to Assess Biofilm Formation Using Wrinkled Colony Development

Een semi-kwantitatieve benadering van biofilmvorming Met behulp van Gerimpelde Colony ontwikkeling te beoordelen

Biofilms, or surface-attached communities of cells encapsulated in an extracellular matrix, represent a common lifestyle for many bacteria. Within a ...

Conversion of a Capture ELISA to a Luminex xMAP Assay using a Multiplex Antibody Screening Method

Omzetting van een Capture ELISA aan een Luminex xMAP test met behulp van een Multiplex Antilichaam screeningsmethode

The enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) has long been the primary tool for detection of analytes of interest in biological samples for both life ...

Cell Tracking Using Photoconvertible Proteins During Zebrafish Development

Mobiele Tracking Met behulp van Photoconvertible eiwitten tijdens ontwikkeling van de zebravis

Embryogenesis is a dynamic process that is best studied by using techniques that allow the documentation of developmental changes in vivo. The use of ...

Assessing Murine Resistance Artery Function Using Pressure Myography

Beoordelen van Muizen Resistance Artery functie gebruiken Pressure myography

Pressure myograph systems are  exquisitely useful in the functional assessment of small arteries, pressurized  to a suitable transmural pressure. The  ...