Name: one-step purification of twin-strep-tagged proteins and their complexes on strep-tactin resin cross-linked with bis(sulfosuccinimidyl) suberate (bs3)
Uploaded: 2014-04-20T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about One-step Purification of Twin-Strep-tagged Proteins and Their Complexes on Strep-Tactin Resin Cross-linked With Bissulfosuccinimidyl Suberate BS3 at JoVE.com

نحن نعترف بامتنان الدعم الفني من سيني Miettinen، مينا Pöllänen وترو Rautavesi. نشكر Helka Nurkkala لتوفير HEK 293 الخلايا معربا عن التوأم بكتيريا الموسومة GFP وبيكا Evijärvi لتوفير معدات تسجيل الصوت. وقد تم تمويل هذا العمل من قبل الأكاديمية من فنلندا، منح أرقام 138329، 134684 258978 و.

1. عبر ربط بكتيريا-Tactin Polymethacrylate الراتنج مع مكرر (sulfosuccinimidyl) Suberate (BS3) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تتوازن واحدة microtube مختومة تحتوي على 2 ملغ من BS3 عبر رابط إلى درجة حرارة الغرفة. تنبيه: BS3 هو عبارة عن مادة خطرة. ارتداء قفازات واقية ونظارات واقية. </li><li style...

<ol>
	<li>Voss, S., Skerra, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutagenesis+of+a+flexible+loop+in+streptavidin+leads+to+higher+affinity+for+the+Strep-tag+II+peptide+and+improved+performance+in+recombinant+protein+purification.">Mutagenesis of a flexible loop in streptavidin leads to higher affinity for the Strep-tag II peptide and improved performance in recombinant protein purification.</a> Protein Eng. 10 (8), 975-982 (1997).</li><li>Schmidt, T. G., Skerra, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Strep-tag+system+for+one-step+purification+and+high-affinity+detection+or+capturing+of+proteins.">The Strep-tag system for one-step purification and high-affinity detection or capturing of proteins.</a> Nat. Protoc. 2 (6), 1528-1535 (2007).</li><li>Junttila, M. R., Saarinen, S., Schmidt, T., Kast, J., Westermarck, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-step+Strep-tag+purification+for+the+isolation+and+identification+of+protein+complexes+from+mammalian+cells.">Single-step Strep-tag purification for the isolation and identification of protein complexes from mammalian cells.</a> Proteomics. 5 (5), 1199-1203 (2005).</li><li>Hafren, A., Hofius, D., Ronnholm, G., Sonnewald, U., Makinen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HSP70+and+its+cochaperone+CPIP+promote+potyvirus+infection+in+Nicotiana+benthamiana+by+regulating+viral+coat+protein+functions.">HSP70 and its cochaperone CPIP promote potyvirus infection in Nicotiana benthamiana by regulating viral coat protein functions.</a> Plant Cell. 22 (2), 523-535 (2010).</li><li>Jaskiewicz, M., Peterhansel, C., Conrath, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+histone+modifications+in+plant+leaves.">Detection of histone modifications in plant leaves.</a> J. Vis. Exp. (55), (2011).</li><li>Witte, C. P., Noel, L. D., Gielbert, J., Parker, J. E., Romeis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+one-step+protein+purification+from+plant+material+using+the+eight-amino+acid+StrepII+epitope.">Rapid one-step protein purification from plant material using the eight-amino acid StrepII epitope.</a> Plant Mol. Biol. 55 (1), 135-147 (2004).</li><li>Werner, A. K., Sparkes, I. A., Romeis, T., Witte, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification,+biochemical+characterization,+and+subcellular+localization+of+allantoate+amidohydrolases+from+Arabidopsis+and+soybean.">Identification, biochemical characterization, and subcellular localization of allantoate amidohydrolases from Arabidopsis and soybean.</a> Plant Physiol. 146 (2), 418-430 (2008).</li><li>Panwar, P., Deniaud, A., Pebay-Peyroula, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contamination+from+an+affinity+column:+an+encounter+with+a+new+villain+in+the+world+of+membrane-protein+crystallization.">Contamination from an affinity column: an encounter with a new villain in the world of membrane-protein crystallization.</a> Acta Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 68 (10), 1272-1277 (2012).</li><li>Hendrickson, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+core+streptavidin+determined+from+multiwavelength+anomalous+diffraction+of+synchrotron+radiation.">Crystal structure of core streptavidin determined from multiwavelength anomalous diffraction of synchrotron radiation.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 86 (7), 2190-2194 (1989).</li><li>Bernot, K. M., Lee, C. H., Coulombe, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+small+surface+hydrophobic+stripe+in+the+coiled-coil+domain+of+type+I+keratins+mediates+tetramer+stability.">A small surface hydrophobic stripe in the coiled-coil domain of type I keratins mediates tetramer stability.</a> J. Cell Biol. 168 (6), 965-974 (2005).</li><li>Singh, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solution+structure+of+human+von+Willebrand+factor+studied+using+small+angle+neutron+scattering.">Solution structure of human von Willebrand factor studied using small angle neutron scattering.</a> J. Biol. Chem. 281 (50), 38266-38275 (2006).</li><li>Weldon, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+immunogenicity+of+stabilized+trimeric+soluble+influenza+hemagglutinin.">Enhanced immunogenicity of stabilized trimeric soluble influenza hemagglutinin.</a> PLoS One. 5 (9), (2010).</li><li>Wang, W., Barger, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Roles+of+quaternary+structure+and+cysteine+residues+in+the+activity+of+human+serine+racemase.">Roles of quaternary structure and cysteine residues in the activity of human serine racemase.</a> BMC Biochem. 12, 63 (2011).</li><li>Rappsilber, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+beginning+of+a+beautiful+friendship:+cross-linking/mass+spectrometry+and+modelling+of+proteins+and+multi-protein+complexes.">The beginning of a beautiful friendship: cross-linking/mass spectrometry and modelling of proteins and multi-protein complexes.</a> J. Struct. Biol. 173 (3), 530-540 (2011).</li><li>Sousa, M. M., Steen, K. W., Hagen, L., Slupphaug, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody+cross-linking+and+target+elution+protocols+used+for+immunoprecipitation+significantly+modulate+signal-to+noise+ratio+in+downstream+2D-PAGE+analysis.">Antibody cross-linking and target elution protocols used for immunoprecipitation significantly modulate signal-to noise ratio in downstream 2D-PAGE analysis.</a> Proteome Sci. 9, 45 (2011).</li></ol>

بروتوكول أعلاه يمكن استخدامها لتنقية أي بروتين الطعم المزدوج بكتيريا الموسومة المصالح والمجمعات المرتبطة به في أي مناسبة العازلة التي لا تحتوي على البيوتين أو denaturants قوية. في النسخة الحالية من بروتوكول، يتم تنفيذ ملزمة وغسل تحت شروط صارمة نسبيا في وجود الملح العالي...

في السنوات الأخيرة، أصبحت التكنولوجيا بكتيريا البطاقات المستخدمة على نطاق واسع في العديد من مجالات البحوث الطبية الحيوية، بما في ذلك البروتينات وعلم الأحياء الهيكلي. هذه التكنولوجيا لتنقية البروتين، والذي يعتمد على مزيج من البروتينات المؤتلف لفترة قصيرة بكتيريا علامة الببتيد، قد نضجت مع ظهور المصفوفات تقارب تحمل بكتيريا-Tactin، وهو البديل المعدلة وراثيا من streptavidin مع تحسين القدرات ملزمة الببتيد. 1، 2 البروتينات الانصهار تحتوي على نسختين من بكتيريا علامة الثاني، المعين المزدوج بكتيريا علامة أو علامة SIII، المعرض تقارب أعلى للمصفوفات بكتيريا-Tactin من تلك التي تحتوي على واحد فقط بكتيريا علامة، وضمان تنقية أكثر كفاءة من البروتينات المؤتلف و شركاء ملزمة المرتبطة بها. ومع ذلك، فإن تقارب أعلى من البروتينات المزدوج بكتيريا الموسومة إلى بكتيريا-Tactin ديها أيضا سلبيات. شطف التنافسية لهذه البروتينات مع البيوتين الزائدة قد تكون غير مكتملة، مما يؤدي إلى انخفاض العائد المستهدف البروتين. A مكفاءة خام البديل هو شطف مع SDS، لكنه يؤدي إلى تلوث العينة غير مرغوب فيها مع بكتيريا-Tactin صدر من الراتنج، مما يجعل الفحص يتعارض مع تحليل البروتين. تعرض هذه الورقة تقنية للتغلب على هذا التحديد عن طريق تثبيت لأول مرة tetramer يقترن الراتنج من بكتيريا-Tactin حسب المادة الكيميائية عبر ربط ثم باستخدام SDS إلى أزل البروتينات المزدوج بكتيريا الموسومة والمجمعات المرتبطة بها من الناتج راتنج عبر ربط. وبالتالي، لا يمكن أن يتحقق العائد كافية من البروتين دون تلوث العينة مع بكتيريا-Tactin، مما يتيح المزيد من التحليل بواسطة مطياف الكتلة. هذه الطريقة مناسبة لتنقية أي انصهار بروتين المؤتلف مع المعرضة للسطح SIII علامة 3 أو التوأم بكتيريا علامة (WSHPQFEK تسلسل الأحماض الأمينية (GGGS) 3 WSHPQFEK وSAWSHPQFEK (GGGS) 2 GGSAWSHPQFEK، على التوالي). البروتين يمكن أن يكون من الحيوان والنبات أو الأصل البكتيرية ويمكن عزلها من خلية إما مجموعالمحللة أو المخصب عضية الكسر. كمثال على ذلك، ونحن تصف هنا تنقية من البروتين SIII الموسومة VPG برو من الفيروسات البطاطس A (PVA) 4 من الكسر النووية من PVA المصابة النباتات benthamiana نيكوتيانا. تم عزل جزء النووية كما هو موضح سابقا 5، مع إجراء التعديلات التالية: لم يعاملوا الخلايا مع الفورمالديهايد، تم استبداله بوتيرات الصوديوم في جميع مخازن مع 5 ملي فلوريد الصوديوم، تم استبداله كاملة مثبط البروتياز مع PMSF، تريتون X-100 تركيز في استخراج تم تخفيض العازلة # 2 إلى 0.3٪ (ت / ت) وكان بيليه معلق النووي التي تم الحصول عليها عن طريق الطرد المركزي من خلال وسادة السكروز (العازلة استخراج # 3) في 1.45 مل من العازلة ملزمة قبل المبردة وتناوب لمدة 1.5 ساعة في 4 درجات مئوية. تم معالجة واستخراج النووية الناتجة تحتوي على البروتين الطعم SIII الموسومة والمجمعات المرتبطة بها (عينة البروتين الطعم) وفقا لبروتوكول موضح أدناه (انظر القسم 2).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="606">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bis(sulfosuccinimidyl) suberate (BS3), No-Weigh format, 8 x 2mg</td>
			<td>Pierce/Thermo Scientific</td>
			<td>21585</td>
			<td><a href="http://www.fishersci.com">www.fishersci.com CAUTION: Hazardous substance. Causes serious respiratory, skin and eye irritation. Wear protective gloves and eye protection.</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Strep-Tactin MacroPrep resin (50% suspension)</td>
			<td>IBA</td>
			<td>2-1505</td>
			<td><a href="http://www.iba-lifesciences.com/">www.iba-lifesciences.com</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spin-X centrifuge tube filter, cellulose acetate membrane, pore size 0.45 &#956;m, non-sterile</td>
			<td>Costar (Corning)</td>
			<td>8163</td>
			<td><a href="http://www.corning.com/lifesciences/">www.corning.com/lifesciences/</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dolphin-nose tubes</td>
			<td>Costar (Corning)</td>
			<td>3213</td>
			<td><a href="http://www.corning.com/lifesciences/">www.corning.com/lifesciences/</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Avidin&#160;</td>
			<td>IBA</td>
			<td>2-0204</td>
			<td><a href="http://www.iba-lifesciences.com/">www.iba-lifesciences.com</a></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

one-step purification of twin-strep-tagged proteins and their complexes on strep-tactin resin cross-linked with bis(sulfosuccinimidyl) suberate (bs3)

أصبحت تنقية تقارب من البروتينات الانصهار بكتيريا الموسومة على راتنجات يحمل streptavidin هندسيا (بكتيريا-Tactin) طريقة تستخدم على نطاق واسع لعزل المجمعات البروتين في ظل الظروف الفسيولوجية. البروتينات الانصهار تحتوي على نسختين من بكتيريا علامة الثاني، المعين المزدوج بكتيريا علامة أو علامة SIII، لديها ميزة أعلى النسب للبكتيريا-Tactin مقارنة مع تلك التي تحتوي على واحد فقط بكتيريا البطاقات، مما يسمح تنقية البروتين أكثر فعالية. ومع ذلك، ويقابل هذه الميزة من حقيقة أن شطف من البروتينات المزدوج بكتيريا الموسومة مع البيوتين قد تكون غير مكتملة، مما أدى إلى انخفاض الانتعاش البروتين. الانتعاش يمكن تحسنت بشكل كبير باستخدام تغيير طبيعة شطف مع دوديسيل كبريتات الصوديوم (SDS)، ولكن هذا يؤدي إلى تلوث عينة مع بكتيريا-Tactin صدر من الراتنج، مما يجعل الفحص يتعارض مع تحليل البروتين المصب. للتغلب على هذا القيد، قمنا بتطوير طريقة tetramer حيث يقترن الراتنج من بكتيريا-Tactinواستقرت أول من التساهمية عبر ربط مع مكرر (sulfosuccinimidyl) suberate (BS3) ثم يستخدم الناتجة الراتنج عبر ربط لتنقية البروتين المجمعات المستهدفة في خطوة تنقية دفعة واحدة. شطف كفاءة مع SDS يضمن الانتعاش البروتين جيدة، في حين أن غياب بكتيريا تلوث-Tactin يسمح تحليل البروتين المصب بواسطة مطياف الكتلة. كدليل على المفهوم، ونحن هنا وصف بروتوكول لتنقية البروتين الفيروسي SIII الموسومة VPG-Pro من نوى N. المصابة بالفيروسات النباتات benthamiana باستخدام الراتنج polymethacrylate بكتيريا-Tactin مرتبطة مع الصليب BS3. البروتوكول نفسه يمكن أن تستخدم لتنقية البروتين أي التوأم بكتيريا الموسومة المصالح وتميز شركائها ملزمة الفسيولوجية.

ويتضح الإجراء تنقية تخطيطي في الشكل 1، جنبا إلى جنب مع تمثيل من المشاكل المرتبطة غيرها من وسائل تنقية القائمة. <img alt="الشكل 1" fo:content-width="5.5in" src="/files/ftp_upload/51536/51536fig1highres.jpg" width="650" /> الشكل 1. تمثيل تخطي...

Watch this Scientific Journal Video about One-step Purification of Twin-Strep-tagged Proteins and Their Complexes on Strep-Tactin Resin Cross-linked With Bissulfosuccinimidyl Suberate BS3 at JoVE.com

One-step Purification of Twin-Strep-tagged Proteins and Their Complexes on Strep-Tactin Resin Cross-linked With Bissulfosuccinimidyl Suberate BS3

خطوة واحدة تنقية البروتينات التوأم بكتيريا الموسومة ومجمعات منها على بكتيريا-Tactin الراتنج عبر ربط مع مكرر (sulfosuccinimidyl) Suberate (BS3)

ووصف طريقة لتنقية فعالة من البروتينات الانصهار المزدوج بكتيريا الموسومة والمجمعات الخاصة على تعديل streptavidin (بكتيريا-Tactin) الراتنج تساهميا عبر ربط مع مكرر (sulfosuccinimidyl) suberate (BS3). أسلوب لديها مزايا السرعة، وحسن الانتعاش البروتين الهدف ونقاء عالية، ومتوافق مع تحليل لاحقة من قبل مطياف الكتلة.

Affinity purification of Strep-tagged fusion proteins on resins carrying an engineered streptavidin (Strep-Tactin) has become a widely used method for ...

Research

JoVE Journal

Biology

One-step Purification of Twin-Strep-tagged Proteins and Their Complexes on Strep-Tactin Resin Cross-linked With Bis(sulfosuccinimidyl) Suberate (BS3)

Purification and Visualization of Influenza A Viral Ribonucleoprotein Complexes

تنقية والتخيل من الأنفلونزا من المجمعات بروتين نووي ريبوزي الفيروسية

The influenza A viral genome consists of eight negative-sense, single stranded RNA molecules, individually packed with multiple copies of the influenza A ...

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

تلطيخ من البروتينات في الهلام مع Coomassie G - 250 دون عضوي حمض الخليك والمذيبات

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Genetic Studies of Human DNA Repair Proteins Using Yeast as a Model System 

الدراسات الجينية البشرية البروتينات إصلاح الحمض النووي باستخدام خميرة كنظام النموذجي

Understanding the roles of human DNA repair proteins in genetic pathways is a formidable challenge to many researchers.  Genetic studies in mammalian ...

One-step Metabolomics: Carbohydrates, Organic and Amino Acids Quantified in a Single Procedure

خطوة واحدة Metabolomics : الكربوهيدرات والأحماض الأمينية والعضوية والكمية في إجراء واحد

Every infant born in the US is now screened for up to 42 rare genetic disorders called "inborn errors of metabolism". The screening method is based on ...

Preparation, Purification, and Characterization of Lanthanide Complexes for Use as Contrast Agents for Magnetic Resonance Imaging

تحضير وتنقية وتوصيف انثانيد المجمعات للاستخدام وكلاء والتباين للتصوير بالرنين المغناطيسي

Polyaminopolycarboxylate-based ligands are commonly used to chelate lanthanide ions, and the resulting complexes are 
useful as contrast agents for ...

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

تحديد بروتين في مجمعات<em&gt; كولاي</em&gt; استخدام المتعاقبة تنقية تقارب الببتيد في تركيبة مع جنبا إلى جنب الطيف الكتلي

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the ...

Formulations for Freeze-drying of Bacteria and Their Influence on Cell Survival

تركيبات لتجميد التجفيف من البكتيريا وتأثيرها على بقاء الخلية

Cellular water can be removed to reversibly inactivate microorganisms to facilitate storage. One such method of removal is freeze-drying, which is ...

High-throughput Purification of Affinity-tagged Recombinant Proteins

عالية الإنتاجية تنقية تقارب الموسومة البروتينات المؤتلف

X-ray crystallography is the method of choice for obtaining a detailed view of the structure of proteins. Such studies need to be complemented by further ...

Purification of Transcripts and Metabolites from Drosophila Heads

Purification of Transcripts and Metabolites from Drosophila Heads

تنقية النصوص والأيضات من<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; رؤساء

For the last decade, we have tried to understand the molecular and cellular mechanisms of neuronal degeneration using Drosophila as a model organism. ...

Non-chromatographic Purification of Recombinant Elastin-like Polypeptides and their Fusions with Peptides and Proteins from Escherichia coli

Non-chromatographic Purification of Recombinant Elastin-like Polypeptides and their Fusions with Peptides and Proteins from Escherichia coli

تنقية الكروماتوغرافي من غير البروتينية المؤتلف الإيلاستين مثل والإنشطار مع الببتيدات والبروتينات من<em&gt; كولاي</em

Elastin-like polypeptides are repetitive biopolymers that exhibit a lower critical solution temperature phase transition behavior, existing as soluble ...