Name: one-step purification of twin-strep-tagged proteins and their complexes on strep-tactin resin cross-linked with bis(sulfosuccinimidyl) suberate (bs3)
Uploaded: 2014-04-20T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about One-step Purification of Twin-Strep-tagged Proteins and Their Complexes on Strep-Tactin Resin Cross-linked With Bissulfosuccinimidyl Suberate BS3 at JoVE.com

Wij dankbaar erkennen de technische ondersteuning van Sini Miettinen, Minna Pöllänen en Taru Rautavesi. Wij danken Helka Nurkkala voor het verstrekken van HEK 293 cellen die twin-Strep-gelabeld GFP en Pekka Evijärvi voor het verstrekken van geluidsopname-apparatuur. Dit werk werd gefinancierd door de Academie van Finland, verlenen nummers 138329, 134684 en 258978.

1. Cross-linking van Strep-Tactin polymethacrylaathars met Bis (sulfosuccinimidyl) suberaat (BS3) <ol><li> Equilibreer een afgedichte microbuisjes met 2 mg BS3 vernettingsmiddel tot kamertemperatuur. LET OP: BS3 is een gevaarlijke stof. Draag beschermende handschoenen en een veiligheidsbril. </li><li> Resuspendeer Strep-Tactin polymethacrylaat hars (50% suspensie in 100 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1 mM EDTA, 150 mM NaCl) door korte krachtig schudden en 600 pl van de suspensie onmiddellijk over in de spin-kolom met een pipet ...

<ol>
	<li>Voss, S., Skerra, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutagenesis+of+a+flexible+loop+in+streptavidin+leads+to+higher+affinity+for+the+Strep-tag+II+peptide+and+improved+performance+in+recombinant+protein+purification.">Mutagenesis of a flexible loop in streptavidin leads to higher affinity for the Strep-tag II peptide and improved performance in recombinant protein purification.</a> Protein Eng. 10 (8), 975-982 (1997).</li><li>Schmidt, T. G., Skerra, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Strep-tag+system+for+one-step+purification+and+high-affinity+detection+or+capturing+of+proteins.">The Strep-tag system for one-step purification and high-affinity detection or capturing of proteins.</a> Nat. Protoc. 2 (6), 1528-1535 (2007).</li><li>Junttila, M. R., Saarinen, S., Schmidt, T., Kast, J., Westermarck, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-step+Strep-tag+purification+for+the+isolation+and+identification+of+protein+complexes+from+mammalian+cells.">Single-step Strep-tag purification for the isolation and identification of protein complexes from mammalian cells.</a> Proteomics. 5 (5), 1199-1203 (2005).</li><li>Hafren, A., Hofius, D., Ronnholm, G., Sonnewald, U., Makinen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HSP70+and+its+cochaperone+CPIP+promote+potyvirus+infection+in+Nicotiana+benthamiana+by+regulating+viral+coat+protein+functions.">HSP70 and its cochaperone CPIP promote potyvirus infection in Nicotiana benthamiana by regulating viral coat protein functions.</a> Plant Cell. 22 (2), 523-535 (2010).</li><li>Jaskiewicz, M., Peterhansel, C., Conrath, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+histone+modifications+in+plant+leaves.">Detection of histone modifications in plant leaves.</a> J. Vis. Exp. (55), (2011).</li><li>Witte, C. P., Noel, L. D., Gielbert, J., Parker, J. E., Romeis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+one-step+protein+purification+from+plant+material+using+the+eight-amino+acid+StrepII+epitope.">Rapid one-step protein purification from plant material using the eight-amino acid StrepII epitope.</a> Plant Mol. Biol. 55 (1), 135-147 (2004).</li><li>Werner, A. K., Sparkes, I. A., Romeis, T., Witte, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification,+biochemical+characterization,+and+subcellular+localization+of+allantoate+amidohydrolases+from+Arabidopsis+and+soybean.">Identification, biochemical characterization, and subcellular localization of allantoate amidohydrolases from Arabidopsis and soybean.</a> Plant Physiol. 146 (2), 418-430 (2008).</li><li>Panwar, P., Deniaud, A., Pebay-Peyroula, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contamination+from+an+affinity+column:+an+encounter+with+a+new+villain+in+the+world+of+membrane-protein+crystallization.">Contamination from an affinity column: an encounter with a new villain in the world of membrane-protein crystallization.</a> Acta Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 68 (10), 1272-1277 (2012).</li><li>Hendrickson, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+core+streptavidin+determined+from+multiwavelength+anomalous+diffraction+of+synchrotron+radiation.">Crystal structure of core streptavidin determined from multiwavelength anomalous diffraction of synchrotron radiation.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 86 (7), 2190-2194 (1989).</li><li>Bernot, K. M., Lee, C. H., Coulombe, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+small+surface+hydrophobic+stripe+in+the+coiled-coil+domain+of+type+I+keratins+mediates+tetramer+stability.">A small surface hydrophobic stripe in the coiled-coil domain of type I keratins mediates tetramer stability.</a> J. Cell Biol. 168 (6), 965-974 (2005).</li><li>Singh, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solution+structure+of+human+von+Willebrand+factor+studied+using+small+angle+neutron+scattering.">Solution structure of human von Willebrand factor studied using small angle neutron scattering.</a> J. Biol. Chem. 281 (50), 38266-38275 (2006).</li><li>Weldon, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+immunogenicity+of+stabilized+trimeric+soluble+influenza+hemagglutinin.">Enhanced immunogenicity of stabilized trimeric soluble influenza hemagglutinin.</a> PLoS One. 5 (9), (2010).</li><li>Wang, W., Barger, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Roles+of+quaternary+structure+and+cysteine+residues+in+the+activity+of+human+serine+racemase.">Roles of quaternary structure and cysteine residues in the activity of human serine racemase.</a> BMC Biochem. 12, 63 (2011).</li><li>Rappsilber, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+beginning+of+a+beautiful+friendship:+cross-linking/mass+spectrometry+and+modelling+of+proteins+and+multi-protein+complexes.">The beginning of a beautiful friendship: cross-linking/mass spectrometry and modelling of proteins and multi-protein complexes.</a> J. Struct. Biol. 173 (3), 530-540 (2011).</li><li>Sousa, M. M., Steen, K. W., Hagen, L., Slupphaug, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody+cross-linking+and+target+elution+protocols+used+for+immunoprecipitation+significantly+modulate+signal-to+noise+ratio+in+downstream+2D-PAGE+analysis.">Antibody cross-linking and target elution protocols used for immunoprecipitation significantly modulate signal-to noise ratio in downstream 2D-PAGE analysis.</a> Proteome Sci. 9, 45 (2011).</li></ol>

Het bovenstaande protocol kan worden gebruikt om een ​​twee-Strep-gelabeld aas eiwit van interesse en de bijbehorende complexen in elke geschikte buffer die niet biotine of sterke denatureringsmiddelen bevat zuiveren. In de huidige versie van het protocol, bindende en wassen wordt uitgevoerd onder relatief stringente omstandigheden in de aanwezigheid van hoge zoutconcentratie en niet-ionisch detergens. Hoewel dit leidt tot minder achtergrond, kan breekbare eiwitcomplexen dissociëren onder deze omstandigheden. Om de...

In de afgelopen jaren heeft Strep-tag technologie op grote schaal gebruikt worden in veel gebieden van het biomedisch onderzoek, met inbegrip van proteomics en structurele biologie. Deze eiwitzuivering technologie, die gebaseerd is op de fusie van recombinante eiwitten een korte Strep-tag peptide, gerijpt met de komst van affiniteitsmatrices uitvoering Strep-Tactin, een genetisch gemanipuleerde variant van streptavidine met verbeterde peptide-bindingscapaciteit. 1, 2 fusie-eiwitten die twee kopieën van Strep-tag II, aangeduid twin-Strep-tag of SIII-tag, vertonen een hogere affiniteit voor Strep-Tactin matrices dan die met slechts een enkele Strep-tag, waardoor efficiëntere zuivering van de recombinante eiwitten en bijbehorende bindingspartners. Echter, de hogere affiniteit van twin-Strep-gemerkte eiwitten om Strep-Tactin heeft ook zijn keerzijde. Concurrerende elutie van dergelijke eiwitten met overmaat biotine kan onvolledig zijn, waardoor doeleiwit rendement gedaald. Een merts efficiënt alternatief is elutie met SDS, maar het leidt tot ongewenste verontreiniging met monster Strep-Tactin afgegeven uit het hars, waardoor de bepaling onverenigbaar met proteoomanalyse. Dit document presenteert een techniek om deze beperking te overwinnen door eerst het stabiliseren van de hars-gekoppelde tetrameer van Strep-Tactin door chemische cross-linking en vervolgens met behulp van SDS naar twin-Strep-gemerkte eiwitten en hun bijbehorende complexen uit de resulterende verknoopte hars elueren. Zo kan voldoende eiwit opbrengst worden bereikt zonder monster besmetting met Strep-Tactin, waardoor verdere analyse met behulp van massaspectrometrie. De methode is geschikt voor de zuivering van een recombinant fusie-eiwit met een oppervlak blootgestelde SIII-tag 3 of twin-Strep-tag (aminozuurvolgorde WSHPQFEK (GGGS) 3 WSHPQFEK en SAWSHPQFEK (GGGS) 2 GGSAWSHPQFEK, respectievelijk). Het eiwit kan van dierlijke, plantaardige of bacteriële oorsprong zijn en kunnen worden geïsoleerd uit zowel de totale cellysaat of verrijkte organel fractie. Als voorbeeld beschrijven we hier de zuivering van een SIII-gemerkt eiwit VPG-Pro Aardappel Virus A (PVA) 4 van de nucleaire fractie van PVA-geïnfecteerde Nicotiana benthamiana planten. De nucleaire fractie werd geïsoleerd zoals eerder beschreven 5 met de volgende wijzigingen: cellen werden niet behandeld met formaldehyde, werd natrium butyraat gesubstitueerd alle buffers met 5 mM natriumfluoride, werd volledige proteaseremmer gesubstitueerd met PMSF, Triton X-100 concentratie extractie buffer # 2 werd verlaagd tot 0,3% (v / v) en de nucleaire pellet verkregen door centrifugatie door sucrosekussen (extractiebuffer # 3) werd geresuspendeerd in 1,45 ml voorgekoeld bindingsbuffer en geroteerd gedurende 1,5 uur bij 4 ° C. De resulterende nucleaire extract dat de SIII-gelabeld aas eiwit en bijbehorende complexen (aas eiwit monster) werd verwerkt volgens de hieronder beschreven (zie punt 2) protocol.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="606">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bis(sulfosuccinimidyl) suberate (BS3), No-Weigh format, 8 x 2mg</td>
			<td>Pierce/Thermo Scientific</td>
			<td>21585</td>
			<td><a href="http://www.fishersci.com">www.fishersci.com CAUTION: Hazardous substance. Causes serious respiratory, skin and eye irritation. Wear protective gloves and eye protection.</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Strep-Tactin MacroPrep resin (50% suspension)</td>
			<td>IBA</td>
			<td>2-1505</td>
			<td><a href="http://www.iba-lifesciences.com/">www.iba-lifesciences.com</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spin-X centrifuge tube filter, cellulose acetate membrane, pore size 0.45 &#956;m, non-sterile</td>
			<td>Costar (Corning)</td>
			<td>8163</td>
			<td><a href="http://www.corning.com/lifesciences/">www.corning.com/lifesciences/</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dolphin-nose tubes</td>
			<td>Costar (Corning)</td>
			<td>3213</td>
			<td><a href="http://www.corning.com/lifesciences/">www.corning.com/lifesciences/</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Avidin&#160;</td>
			<td>IBA</td>
			<td>2-0204</td>
			<td><a href="http://www.iba-lifesciences.com/">www.iba-lifesciences.com</a></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

one-step purification of twin-strep-tagged proteins and their complexes on strep-tactin resin cross-linked with bis(sulfosuccinimidyl) suberate (bs3)

Affiniteitszuivering van Strep-gemerkte fusie-eiwitten op harsen dragen een aangelegde streptavidine (Strep-Tactin) is uitgegroeid tot een veel gebruikte methode voor de isolatie van eiwitcomplexen onder fysiologische omstandigheden. Fusie-eiwitten die twee kopieën van Strep-tag II, aangeduid twin-Strep-tag of SIII-tag, hebben het voordeel van hogere affiniteit voor Strep-Tactin in vergelijking met degenen die slechts een enkele Strep-tag, waardoor efficiënter eiwitreiniging. Echter dit voordeel gecompenseerd doordat elutie twin-Strep-gemerkte eiwitten met biotine onvolledig zijn, leidt tot lage eiwit herstel. Het herstel kan drastisch worden verbeterd door denaturerende elutie met natriumdodecylsulfaat (SDS), maar dit leidt tot verontreiniging met Strep-Tactin afgegeven uit de hars monster, waardoor de bepaling onverenigbaar met downstream proteoomanalyse. Om deze beperking te overwinnen, hebben wij een methode waarbij hars gekoppeld tetrameer van Strep-Tactin ontwikkeldwordt eerste gestabiliseerd door covalente verknoping met Bis (sulfosuccinimidyl) suberaat (BS3) en het verkregen verknoopte hars wordt vervolgens gebruikt om doeleiwit complexen te zuiveren in een enkele batch zuiveringsstap. Efficiënte elutie met SDS zorgt voor een goede eiwit herstel, terwijl de afwezigheid van verontreinigende Strep-Tactin laat stroomafwaarts eiwit analyse door massaspectrometrie. Als een proof of concept, beschrijven we hier een protocol voor de zuivering van SIII-getagde viraal eiwit VPG-Pro van kernen van virus-geïnfecteerde N. benthamiana installaties die het Strep-Tactin polymethacrylaathars verknoopt met BS3. Hetzelfde protocol kan worden gebruikt om een ​​twee-Strep-gelabeld eiwit van belang te zuiveren en te karakteriseren zijn fysiologische bindingspartners.

De zuiveringswerkwijze is schematisch weergegeven in figuur 1, samen met een representatie van problemen in verband met andere bestaande zuiveringswerkwijzen. <img alt="Figuur 1" fo:content-width="5.5in" src="/files/ftp_upload/51536/51536fig1highres.jpg" width="650" /> Figuur 1. Schematische weergave van de zuiveringsprocedure. De workflow bevat stabilisatie van de hars gekoppelde Strep-Tactin tetrameer via covalent...

Watch this Scientific Journal Video about One-step Purification of Twin-Strep-tagged Proteins and Their Complexes on Strep-Tactin Resin Cross-linked With Bissulfosuccinimidyl Suberate BS3 at JoVE.com

One-step Purification of Twin-Strep-tagged Proteins and Their Complexes on Strep-Tactin Resin Cross-linked With Bissulfosuccinimidyl Suberate BS3

Een stap Zuivering van Twin-Strep-gelabeld eiwitten en hun complexen op Strep-Tactin Resin Cross-linked met bis (sulfosuccinimidyl) suberaat (BS3)

Een werkwijze wordt beschreven voor een efficiënte zuivering van twin-Strep-gemerkte fusie-eiwitten en hun specifieke complexen van gemodificeerde streptavidine (Strep-Tactin) hars covalent verknoopt met Bis (sulfosuccinimidyl) suberaat (BS3). De methode heeft de voordelen van hoge snelheid, goede doeleiwit terugwinning en hoge zuiverheid, en is compatibel met daaropvolgende analyse door massaspectrometrie.

Affinity purification of Strep-tagged fusion proteins on resins carrying an engineered streptavidin (Strep-Tactin) has become a widely used method for ...

Research

JoVE Journal

Biology

One-step Purification of Twin-Strep-tagged Proteins and Their Complexes on Strep-Tactin Resin Cross-linked With Bis(sulfosuccinimidyl) Suberate (BS3)

Purification and Visualization of Influenza A Viral Ribonucleoprotein Complexes

Zuivering en Visualisatie van Influenza A Viral ribonucleoproteïne Complexen

The influenza A viral genome consists of eight negative-sense, single stranded RNA molecules, individually packed with multiple copies of the influenza A ...

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

Kleuring van eiwitten in Gels met Coomassie G-250 zonder organisch oplosmiddel en azijnzuur

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Genetic Studies of Human DNA Repair Proteins Using Yeast as a Model System 

Genetische studies van het menselijk DNA Repair eiwitten met behulp van gist als een model-systeem

Understanding the roles of human DNA repair proteins in genetic pathways is a formidable challenge to many researchers.  Genetic studies in mammalian ...

One-step Metabolomics: Carbohydrates, Organic and Amino Acids Quantified in a Single Procedure

Een stap Metabolomica: Koolhydraten, organische-en aminozuren gekwantificeerd in een uniforme procedure

Every infant born in the US is now screened for up to 42 rare genetic disorders called "inborn errors of metabolism". The screening method is based on ...

Preparation, Purification, and Characterization of Lanthanide Complexes for Use as Contrast Agents for Magnetic Resonance Imaging

Voorbereiding, Zuivering en karakterisering van lanthanide-complexen voor gebruik als contraststoffen voor Magnetic Resonance Imaging

Polyaminopolycarboxylate-based ligands are commonly used to chelate lanthanide ions, and the resulting complexes are 
useful as contrast agents for ...

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Identificatie van eiwit complexen in<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Met Sequential Peptide Affinity Purification in combinatie met tandem massaspectrometrie

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the ...

Formulations for Freeze-drying of Bacteria and Their Influence on Cell Survival

Formuleringen voor Vriesdrogen van bacteriën en hun invloed op de overleving van de cel

Cellular water can be removed to reversibly inactivate microorganisms to facilitate storage. One such method of removal is freeze-drying, which is ...

High-throughput Purification of Affinity-tagged Recombinant Proteins

High-throughput Zuivering van Affinity gemerkte recombinante eiwitten

X-ray crystallography is the method of choice for obtaining a detailed view of the structure of proteins. Such studies need to be complemented by further ...

Purification of Transcripts and Metabolites from Drosophila Heads

Purification of Transcripts and Metabolites from Drosophila Heads

Zuivering van Afschriften en metabolieten van<em&gt; Drosophila</em&gt; Hoofden

For the last decade, we have tried to understand the molecular and cellular mechanisms of neuronal degeneration using Drosophila as a model organism. ...

Non-chromatographic Purification of Recombinant Elastin-like Polypeptides and their Fusions with Peptides and Proteins from Escherichia coli

Non-chromatographic Purification of Recombinant Elastin-like Polypeptides and their Fusions with Peptides and Proteins from Escherichia coli

Niet-chromatografische zuivering van recombinant elastine-achtige polypeptiden en hun Fusies met peptiden en eiwitten van<em&gt; Escherichia coli</em

Elastin-like polypeptides are repetitive biopolymers that exhibit a lower critical solution temperature phase transition behavior, existing as soluble ...