Name: one-step purification of twin-strep-tagged proteins and their complexes on strep-tactin resin cross-linked with bis(sulfosuccinimidyl) suberate (bs3)
Uploaded: 2014-04-20T14:00:00
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Noi riconosciamo con gratitudine il supporto tecnico di Sini Miettinen, Minna Pollanen e Taru Rautavesi. Ringraziamo Helka Nurkkala per la fornitura di cellule HEK 293 esprimenti twin-Strep-tag GFP e Pekka Evijärvi per la fornitura di apparecchi registrazione suono. Questo lavoro è stato finanziato dall&#39;Accademia di Finlandia, concedere numeri 138.329, 134.684 e 258.978.

1. Cross-linking di Strep-Tactin Polimetacrilato resina con Bis (Sulfosuccinimidil) suberato (BS3) <ol><li> Equilibrare una provetta sigillata contenente 2 mg di BS3 reticolante a temperatura ambiente. ATTENZIONE: BS3 è una sostanza pericolosa. Indossare guanti e occhiali protettivi. </li><li> Risospendere Strep-Tactin resina di polimetacrilato (sospensione al 50% in 100 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1 mM EDTA, 150 mM NaCl) di breve vigorosa agitazione e trasferire immediatamente 600 ml di sospensione ad una colonna di spin c...

<ol>
	<li>Voss, S., Skerra, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutagenesis+of+a+flexible+loop+in+streptavidin+leads+to+higher+affinity+for+the+Strep-tag+II+peptide+and+improved+performance+in+recombinant+protein+purification.">Mutagenesis of a flexible loop in streptavidin leads to higher affinity for the Strep-tag II peptide and improved performance in recombinant protein purification.</a> Protein Eng. 10 (8), 975-982 (1997).</li><li>Schmidt, T. G., Skerra, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Strep-tag+system+for+one-step+purification+and+high-affinity+detection+or+capturing+of+proteins.">The Strep-tag system for one-step purification and high-affinity detection or capturing of proteins.</a> Nat. Protoc. 2 (6), 1528-1535 (2007).</li><li>Junttila, M. R., Saarinen, S., Schmidt, T., Kast, J., Westermarck, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-step+Strep-tag+purification+for+the+isolation+and+identification+of+protein+complexes+from+mammalian+cells.">Single-step Strep-tag purification for the isolation and identification of protein complexes from mammalian cells.</a> Proteomics. 5 (5), 1199-1203 (2005).</li><li>Hafren, A., Hofius, D., Ronnholm, G., Sonnewald, U., Makinen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HSP70+and+its+cochaperone+CPIP+promote+potyvirus+infection+in+Nicotiana+benthamiana+by+regulating+viral+coat+protein+functions.">HSP70 and its cochaperone CPIP promote potyvirus infection in Nicotiana benthamiana by regulating viral coat protein functions.</a> Plant Cell. 22 (2), 523-535 (2010).</li><li>Jaskiewicz, M., Peterhansel, C., Conrath, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+histone+modifications+in+plant+leaves.">Detection of histone modifications in plant leaves.</a> J. Vis. Exp. (55), (2011).</li><li>Witte, C. P., Noel, L. D., Gielbert, J., Parker, J. E., Romeis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+one-step+protein+purification+from+plant+material+using+the+eight-amino+acid+StrepII+epitope.">Rapid one-step protein purification from plant material using the eight-amino acid StrepII epitope.</a> Plant Mol. Biol. 55 (1), 135-147 (2004).</li><li>Werner, A. K., Sparkes, I. A., Romeis, T., Witte, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification,+biochemical+characterization,+and+subcellular+localization+of+allantoate+amidohydrolases+from+Arabidopsis+and+soybean.">Identification, biochemical characterization, and subcellular localization of allantoate amidohydrolases from Arabidopsis and soybean.</a> Plant Physiol. 146 (2), 418-430 (2008).</li><li>Panwar, P., Deniaud, A., Pebay-Peyroula, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contamination+from+an+affinity+column:+an+encounter+with+a+new+villain+in+the+world+of+membrane-protein+crystallization.">Contamination from an affinity column: an encounter with a new villain in the world of membrane-protein crystallization.</a> Acta Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 68 (10), 1272-1277 (2012).</li><li>Hendrickson, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+core+streptavidin+determined+from+multiwavelength+anomalous+diffraction+of+synchrotron+radiation.">Crystal structure of core streptavidin determined from multiwavelength anomalous diffraction of synchrotron radiation.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 86 (7), 2190-2194 (1989).</li><li>Bernot, K. M., Lee, C. H., Coulombe, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+small+surface+hydrophobic+stripe+in+the+coiled-coil+domain+of+type+I+keratins+mediates+tetramer+stability.">A small surface hydrophobic stripe in the coiled-coil domain of type I keratins mediates tetramer stability.</a> J. Cell Biol. 168 (6), 965-974 (2005).</li><li>Singh, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solution+structure+of+human+von+Willebrand+factor+studied+using+small+angle+neutron+scattering.">Solution structure of human von Willebrand factor studied using small angle neutron scattering.</a> J. Biol. Chem. 281 (50), 38266-38275 (2006).</li><li>Weldon, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+immunogenicity+of+stabilized+trimeric+soluble+influenza+hemagglutinin.">Enhanced immunogenicity of stabilized trimeric soluble influenza hemagglutinin.</a> PLoS One. 5 (9), (2010).</li><li>Wang, W., Barger, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Roles+of+quaternary+structure+and+cysteine+residues+in+the+activity+of+human+serine+racemase.">Roles of quaternary structure and cysteine residues in the activity of human serine racemase.</a> BMC Biochem. 12, 63 (2011).</li><li>Rappsilber, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+beginning+of+a+beautiful+friendship:+cross-linking/mass+spectrometry+and+modelling+of+proteins+and+multi-protein+complexes.">The beginning of a beautiful friendship: cross-linking/mass spectrometry and modelling of proteins and multi-protein complexes.</a> J. Struct. Biol. 173 (3), 530-540 (2011).</li><li>Sousa, M. M., Steen, K. W., Hagen, L., Slupphaug, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody+cross-linking+and+target+elution+protocols+used+for+immunoprecipitation+significantly+modulate+signal-to+noise+ratio+in+downstream+2D-PAGE+analysis.">Antibody cross-linking and target elution protocols used for immunoprecipitation significantly modulate signal-to noise ratio in downstream 2D-PAGE analysis.</a> Proteome Sci. 9, 45 (2011).</li></ol>

Il protocollo di cui sopra può essere usato per purificare qualsiasi proteina esca twin-Strep-tag di interesse e suoi complessi associati in qualsiasi tampone adatto che non contiene biotina o denaturanti forti. Nella versione attuale del protocollo, vincolante e lavaggio vengono eseguiti in condizioni relativamente restrittive in presenza di elevata sale e detergente non ionico. Anche se questo si traduce in meno sfondo, complessi proteici fragili possono dissociare in queste condizioni. Per conservare tali complessi ...

Negli ultimi anni, la tecnologia Strep-tag è stato ampiamente utilizzato in molti settori della ricerca biomedica, tra cui la proteomica e la biologia strutturale. Questa tecnologia purificazione della proteina, che si basa sulla fusione di proteine ​​ricombinanti ad una breve Strep-tag peptide, è maturata con l&#39;avvento di matrici di affinità che trasportano Strep-Tactin, una variante geneticamente di streptavidina con una migliore capacità di legame peptidico. 1, 2 proteine ​​di fusione contenenti due copie di Strep-tag II, designate twin-Strep-tag o SIII-tag, mostrano una maggiore affinità per le matrici Strep-Tactin di quelli contenenti un solo Strep-tag, garantendo la depurazione più efficiente delle proteine ​​ricombinanti e i loro partner di legame associate. Tuttavia, la maggiore affinità delle proteine ​​twin-Strep-tagged per Strep-Tactin ha anche il suo rovescio della medaglia. Eluizione concorrenziale di tali proteine ​​con eccesso di biotina può essere incompleta, con conseguente riduzione della resa di proteine ​​bersaglio. A mminerale efficiente alternativa è eluizione con SDS, ma porta alla contaminazione del campione indesiderato con Strep-Tactin rilasciato dalla resina, rendendo il test incompatibile con l&#39;analisi proteomica. Questo articolo presenta una tecnica per superare questa limitazione prima stabilizzazione del tetramero resina accoppiata di Strep-Tactin dal chimico cross-linking e quindi utilizzando SDS per eluire le proteine ​​twin-Strep-taggate e dei loro complessi associati dalla risultante resina reticolata. Così, sufficiente resa di proteine ​​può essere realizzata senza contaminazione del campione con Strep-Tactin, consentendo così un&#39;ulteriore analisi mediante spettrometria di massa. Il metodo è adatto per la purificazione di una proteina di fusione ricombinante con un SIII-tag-superficie esposta 3 o twin-Strep-tag (WSHPQFEK sequenza aminoacidica (GGGS) 3 WSHPQFEK e SAWSHPQFEK (GGGS) 2 GGSAWSHPQFEK, rispettivamente). La proteina può essere di origine animale, vegetale o batterica e può essere isolato da entrambi cellulare totalelisato o frazione organello arricchito. Come esempio, si descrive qui la purificazione di una proteina SIII-tag VPG-Pro di Potato virus A (PVA) 4 dalla frazione nucleare di PVA-infettati Nicotiana benthamiana. La frazione nucleare è stato isolato come descritto in precedenza 5, con le seguenti modifiche: cellule non sono state trattate con formaldeide, butirrato di sodio è stato sostituito in tutti i buffer con fluoruro di sodio 5 mM, inibitore della proteasi completo è stato sostituito con PMSF, Triton X-100 in concentrazione estrazione tampone # 2 è stato ridotto al 0,3% (v / v) e il pellet nucleare ottenuto mediante centrifugazione attraverso cuscino di saccarosio (tampone di estrazione # 3) è stato risospeso in 1,45 ml di tampone di legame pre-raffreddata e ruotata per 1,5 ore a 4 ° C. L&#39;estratto nucleare risultante contiene la proteina esca SIII-tag e complessi associati (campione proteina esca) è stato elaborato secondo il protocollo descritto di seguito (vedere paragrafo 2).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="606">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bis(sulfosuccinimidyl) suberate (BS3), No-Weigh format, 8 x 2mg</td>
			<td>Pierce/Thermo Scientific</td>
			<td>21585</td>
			<td><a href="http://www.fishersci.com">www.fishersci.com CAUTION: Hazardous substance. Causes serious respiratory, skin and eye irritation. Wear protective gloves and eye protection.</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Strep-Tactin MacroPrep resin (50% suspension)</td>
			<td>IBA</td>
			<td>2-1505</td>
			<td><a href="http://www.iba-lifesciences.com/">www.iba-lifesciences.com</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spin-X centrifuge tube filter, cellulose acetate membrane, pore size 0.45 &#956;m, non-sterile</td>
			<td>Costar (Corning)</td>
			<td>8163</td>
			<td><a href="http://www.corning.com/lifesciences/">www.corning.com/lifesciences/</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dolphin-nose tubes</td>
			<td>Costar (Corning)</td>
			<td>3213</td>
			<td><a href="http://www.corning.com/lifesciences/">www.corning.com/lifesciences/</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Avidin&#160;</td>
			<td>IBA</td>
			<td>2-0204</td>
			<td><a href="http://www.iba-lifesciences.com/">www.iba-lifesciences.com</a></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

one-step purification of twin-strep-tagged proteins and their complexes on strep-tactin resin cross-linked with bis(sulfosuccinimidyl) suberate (bs3)

Purificazione per affinità di proteine ​​di fusione Strep-targhetta di resine che trasportano una streptavidina allestita (Strep-Tactin) è diventato un metodo ampiamente utilizzato per l&#39;isolamento di complessi proteici in condizioni fisiologiche. Proteine ​​di fusione contenenti due copie di Strep-tag II, designate twin-Strep-tag o SIII-tag, hanno il vantaggio di una maggiore affinità per Strep-Tactin rispetto a quelli che contengono un solo Strep-tag, permettendo così più efficiente purificazione di proteine. Tuttavia, questo vantaggio è compensato dal fatto che eluizione delle proteine ​​twin-Strep-taggate con biotina può essere incompleta, portando a basso recupero di proteine. Il recupero può essere notevolmente migliorata utilizzando denaturazione eluizione con sodio dodecil solfato (SDS), ma questo porta a campionare contaminazione con Strep-Tactin rilasciato dalla resina, rendendo il saggio incompatibile con analisi proteomica valle. Per superare questa limitazione, abbiamo sviluppato un metodo in base al quale tetramero resina accoppiata di Strep-Tactinè prima stabilizzato da covalente reticolazione con Bis (Sulfosuccinimidil) suberato (BS3) e la resina reticolata risultante viene poi utilizzato per purificare bersaglio complessi proteici in un singolo passaggio di purificazione batch. Eluizione efficiente con SDS assicura buon recupero proteina, mentre l&#39;assenza di contaminazione Strep-Tactin permette valle proteina analisi mediante spettrometria di massa. Come un proof of concept, descriviamo qui un protocollo per la purificazione della proteina virale SIII-tagged VPG-Pro da nuclei di N. infettato da virus piante benthamiana utilizzando la resina di polimetacrilato Strep-Tactin reticolato con BS3. Lo stesso protocollo può essere utilizzato per purificare qualsiasi proteina twin-Strep-tag di interesse e caratterizzare suoi partner di legame fisiologiche.

La procedura di purificazione è schematicamente illustrato in Figura 1, con una rappresentazione di problemi associati con altri metodi di purificazione esistenti. <img alt="Figura 1" fo:content-width="5.5in" src="/files/ftp_upload/51536/51536fig1highres.jpg" width="650" /> Figura 1. Rappresentazione schematica della procedura di purificazione. Il flusso di lavoro comprende stabilizzazione della Strep-Tactin tetram...

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One-step Purification of Twin-Strep-tagged Proteins and Their Complexes on Strep-Tactin Resin Cross-linked With Bissulfosuccinimidyl Suberate BS3

One-step purificazione di proteine ​​Twin-Strep-taggate e dei loro complessi su Strep-Tactin resina reticolato con Bis (Sulfosuccinimidil) suberato (BS3)

Un metodo è descritto per la purificazione efficiente di proteine ​​di fusione twin-Strep-tag e dei loro complessi specifiche in materia di streptavidina modificato (Strep-Tactin) resina covalentemente reticolato con Bis (Sulfosuccinimidil) suberato (BS3). Il metodo ha i vantaggi di velocità veloce, buon recupero proteina bersaglio ed elevata purezza, ed è compatibile con la successiva analisi mediante spettrometria di massa.

Affinity purification of Strep-tagged fusion proteins on resins carrying an engineered streptavidin (Strep-Tactin) has become a widely used method for ...

Research

JoVE Journal

Biology

One-step Purification of Twin-Strep-tagged Proteins and Their Complexes on Strep-Tactin Resin Cross-linked With Bis(sulfosuccinimidyl) Suberate (BS3)

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