Name: one-step purification of twin-strep-tagged proteins and their complexes on strep-tactin resin cross-linked with bis(sulfosuccinimidyl) suberate (bs3)
Uploaded: 2014-04-20T14:00:00
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我々は感謝SiniがMiettinen、みんなPöllänenとたるRautavesiの技術サポートを認める。私たちは、HEKに録音機器を提供するためのツインStrepタグ、GFPとペッカEvijärviを発現する293細胞を提供するためのヘルカNurkkalaに感謝します。この作品は、フィンランド·アカデミーによって資金を供給された、数字138329、134684と258978を付与します。

ビスのStrep-Tactinのポリメタクリレート樹脂の1。架橋（スルホスクシンイミジル）スベレート（BS3） <ol><li>室温にBS3架橋剤の2ミリグラムを含む1密封されたマイクロチューブを平衡化させます。注意：BS3は、危険な物質である。保護手袋、ゴーグルを着用してください。 </li><li>再懸濁のStrep-Tactinのメタクリル樹脂（100 mMトリス - 塩酸、pH8.0の50％懸濁液、1mMのEDTA、150mMのNaCl）による簡単な激?...

<ol>
	<li>Voss, S., Skerra, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutagenesis+of+a+flexible+loop+in+streptavidin+leads+to+higher+affinity+for+the+Strep-tag+II+peptide+and+improved+performance+in+recombinant+protein+purification.">Mutagenesis of a flexible loop in streptavidin leads to higher affinity for the Strep-tag II peptide and improved performance in recombinant protein purification.</a> Protein Eng. 10 (8), 975-982 (1997).</li><li>Schmidt, T. G., Skerra, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Strep-tag+system+for+one-step+purification+and+high-affinity+detection+or+capturing+of+proteins.">The Strep-tag system for one-step purification and high-affinity detection or capturing of proteins.</a> Nat. Protoc. 2 (6), 1528-1535 (2007).</li><li>Junttila, M. R., Saarinen, S., Schmidt, T., Kast, J., Westermarck, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-step+Strep-tag+purification+for+the+isolation+and+identification+of+protein+complexes+from+mammalian+cells.">Single-step Strep-tag purification for the isolation and identification of protein complexes from mammalian cells.</a> Proteomics. 5 (5), 1199-1203 (2005).</li><li>Hafren, A., Hofius, D., Ronnholm, G., Sonnewald, U., Makinen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HSP70+and+its+cochaperone+CPIP+promote+potyvirus+infection+in+Nicotiana+benthamiana+by+regulating+viral+coat+protein+functions.">HSP70 and its cochaperone CPIP promote potyvirus infection in Nicotiana benthamiana by regulating viral coat protein functions.</a> Plant Cell. 22 (2), 523-535 (2010).</li><li>Jaskiewicz, M., Peterhansel, C., Conrath, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+histone+modifications+in+plant+leaves.">Detection of histone modifications in plant leaves.</a> J. Vis. Exp. (55), (2011).</li><li>Witte, C. P., Noel, L. D., Gielbert, J., Parker, J. E., Romeis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+one-step+protein+purification+from+plant+material+using+the+eight-amino+acid+StrepII+epitope.">Rapid one-step protein purification from plant material using the eight-amino acid StrepII epitope.</a> Plant Mol. Biol. 55 (1), 135-147 (2004).</li><li>Werner, A. K., Sparkes, I. A., Romeis, T., Witte, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification,+biochemical+characterization,+and+subcellular+localization+of+allantoate+amidohydrolases+from+Arabidopsis+and+soybean.">Identification, biochemical characterization, and subcellular localization of allantoate amidohydrolases from Arabidopsis and soybean.</a> Plant Physiol. 146 (2), 418-430 (2008).</li><li>Panwar, P., Deniaud, A., Pebay-Peyroula, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contamination+from+an+affinity+column:+an+encounter+with+a+new+villain+in+the+world+of+membrane-protein+crystallization.">Contamination from an affinity column: an encounter with a new villain in the world of membrane-protein crystallization.</a> Acta Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 68 (10), 1272-1277 (2012).</li><li>Hendrickson, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+core+streptavidin+determined+from+multiwavelength+anomalous+diffraction+of+synchrotron+radiation.">Crystal structure of core streptavidin determined from multiwavelength anomalous diffraction of synchrotron radiation.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 86 (7), 2190-2194 (1989).</li><li>Bernot, K. M., Lee, C. H., Coulombe, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+small+surface+hydrophobic+stripe+in+the+coiled-coil+domain+of+type+I+keratins+mediates+tetramer+stability.">A small surface hydrophobic stripe in the coiled-coil domain of type I keratins mediates tetramer stability.</a> J. Cell Biol. 168 (6), 965-974 (2005).</li><li>Singh, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solution+structure+of+human+von+Willebrand+factor+studied+using+small+angle+neutron+scattering.">Solution structure of human von Willebrand factor studied using small angle neutron scattering.</a> J. Biol. Chem. 281 (50), 38266-38275 (2006).</li><li>Weldon, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+immunogenicity+of+stabilized+trimeric+soluble+influenza+hemagglutinin.">Enhanced immunogenicity of stabilized trimeric soluble influenza hemagglutinin.</a> PLoS One. 5 (9), (2010).</li><li>Wang, W., Barger, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Roles+of+quaternary+structure+and+cysteine+residues+in+the+activity+of+human+serine+racemase.">Roles of quaternary structure and cysteine residues in the activity of human serine racemase.</a> BMC Biochem. 12, 63 (2011).</li><li>Rappsilber, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+beginning+of+a+beautiful+friendship:+cross-linking/mass+spectrometry+and+modelling+of+proteins+and+multi-protein+complexes.">The beginning of a beautiful friendship: cross-linking/mass spectrometry and modelling of proteins and multi-protein complexes.</a> J. Struct. Biol. 173 (3), 530-540 (2011).</li><li>Sousa, M. M., Steen, K. W., Hagen, L., Slupphaug, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody+cross-linking+and+target+elution+protocols+used+for+immunoprecipitation+significantly+modulate+signal-to+noise+ratio+in+downstream+2D-PAGE+analysis.">Antibody cross-linking and target elution protocols used for immunoprecipitation significantly modulate signal-to noise ratio in downstream 2D-PAGE analysis.</a> Proteome Sci. 9, 45 (2011).</li></ol>

上記のプロトコルは、ビオチンまたは強力な変性剤を含まない任意の適切な緩衝液中の目的とそれに関連する複合体のいずれかの二Strepタグベイトタンパク質を精製するために使用することができる。プロトコルの現在のバージョンでは、結合および洗浄は、高い塩および非イオン性界面活性剤の存在下で比較的ストリンジェントな条件下で行われる。これはより少ないバックグラウンドを?...

近年では、Strepタグ技術は、プロテオミクスと構造生物学などの生物医学研究の多くの分野で広く使用されるようになった。ショートStrepタグペプチドに組換えタンパク質の融合に依存するこのタンパク質精製技術は、ストレプト-Tactinの、改良されたペプチド結合能を有するストレプトアビジンの遺伝子操作された変異体を担持するアフィニティーマトリックスの出現により成熟した図1、図2ツインStrepタグまたはSIIIタグを指定StrepタグIIの2つのコピーを含有する融合タンパク質は、組換えタンパク質のより効率的な浄化を保証する、単一のStrepタグを含有するものよりストレプ-Tactinのマトリックスに対して高い親和性を示し、そしてそれに関連付けられた結合パートナー。しかし、連鎖球菌-TactinのにツインStrepタグタンパク質の高い親和性はまた、その欠点を持っています。過剰のビオチンを有するこのようなタンパク質の競合的溶出は、標的タンパク質の収率の低下につながる、不完全であってもよい。 M鉱石効率的な代替は、SDSで溶出されていますが、プロテオーム解析を用いたアッセイ互換性がなくなり、樹脂から遊離のStrep-Tactinのとの望ましくないサンプル汚染につながる。本論文では、最初に化学架橋した後、得られる架橋樹脂からツインStrep-tag IIタグタンパク質およびそれに関連する複合体を溶出させるために、SDSを使用してのStrep-Tactinの樹脂結合型四量体を安定化させることにより、この制限を克服するための技術を提供します。したがって、十分なタンパク質収量、それによって、質量分析によるさらなる分析を可能にする、ストレプト-Tactinの試料汚染することなく達成することができる。 この方法は、表面に露出SIIIタグ3又は二Strepタグ（アミノ酸配列WSHPQFEK（GGGS）3 WSHPQFEKそれぞれSAWSHPQFEK（GGGS）2 GGSAWSHPQFEK）を有する任意の組換え融合タンパク質の精製に適している。タンパク質は、動物、植物または細菌起源のものとすることができ、全細胞のいずれかから単離することができる溶解物または濃縮された細胞小器官画。例として、ここでは、PVAに感染したベンサミアナタバコ植物の核画分からのジャガイモウイルスA（PVA）4のSIIIタグ化タンパク質のVPg -プロの精製を説明します。以前に以下の改変を、5に記載のように、核画分を単離した細胞をホルムアルデヒドで処理しなかった、酪酸ナトリウム、5 mMのフッ化ナトリウムとのすべてのバッファに置換し、完全プロテアーゼ阻害剤は、PMSFで置換し、抽出におけるトリトンX-100濃度バッファ＃2は0.3％に低下した（v / v）で（抽出緩衝液＃3）ショ糖クッションを通した遠心分離により得られた核ペレットを、予め冷却した結合緩衝液1.45中に再懸濁し、4℃で1.5時間回転SIIIタグ化ベイトタンパク質と会合した複合体（ベイトタンパク質試料）を含有する得られた核抽出物（セクション2を参照）、以下に記載されるプロトコルに従って処理した。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="606">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bis(sulfosuccinimidyl) suberate (BS3), No-Weigh format, 8 x 2mg</td>
			<td>Pierce/Thermo Scientific</td>
			<td>21585</td>
			<td><a href="http://www.fishersci.com">www.fishersci.com CAUTION: Hazardous substance. Causes serious respiratory, skin and eye irritation. Wear protective gloves and eye protection.</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Strep-Tactin MacroPrep resin (50% suspension)</td>
			<td>IBA</td>
			<td>2-1505</td>
			<td><a href="http://www.iba-lifesciences.com/">www.iba-lifesciences.com</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spin-X centrifuge tube filter, cellulose acetate membrane, pore size 0.45 &#956;m, non-sterile</td>
			<td>Costar (Corning)</td>
			<td>8163</td>
			<td><a href="http://www.corning.com/lifesciences/">www.corning.com/lifesciences/</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dolphin-nose tubes</td>
			<td>Costar (Corning)</td>
			<td>3213</td>
			<td><a href="http://www.corning.com/lifesciences/">www.corning.com/lifesciences/</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Avidin&#160;</td>
			<td>IBA</td>
			<td>2-0204</td>
			<td><a href="http://www.iba-lifesciences.com/">www.iba-lifesciences.com</a></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

one-step purification of twin-strep-tagged proteins and their complexes on strep-tactin resin cross-linked with bis(sulfosuccinimidyl) suberate (bs3)

操作されたストレプトアビジン（のStrep-Tactinの）を有する樹脂上Strepタグ融合タンパク質のアフィニティー精製は、生理学的条件下でタンパク質複合体の単離のために広く用いられる方法となった。ツインStrepタグまたはSIIIタグを指定StrepタグIIの2つのコピーを含有する融合タンパク質は、より効率的なタンパク質精製を可能にする、単一のStrepタグを含有するものと比較してのStrep-Tactinのための高い親和性の利点を有する。しかし、この利点は、ビオチンとのツインStrepタグタンパク質の溶出は低タンパク質の回収につながる、不完全になる可能性があるという事実によって相殺される。回収率は劇的にドデシル硫酸ナトリウム（SDS）で変性溶出を使用することによって改善することができるが、これは下流のプロテオーム解析を用いたアッセイ互換性がなくなり、樹脂から遊離のStrep-Tactinの混入をサンプリングするために導く。この制限を克服するために、我々は、ストレプト-Tactinの方法により、樹脂結合型四量体を開発した第ビス（スルホスクシンイミジル）スベレート（BS3）で処理し、得られた架橋樹脂との架橋は、単一のバッチ精製段階における標的タンパク質複合体を精製するために使用される共有結合によって安定化される。ストレプト-Tactinのを汚染の不在は、質量分析による下流のタンパク質分析を可能にしながら、SDSによる効率的な溶出は、優れたタンパク質回収を確実にします。概念実証として、我々はここではウイルスに感染したNの核からSIIIタグ付きウイルスタンパク質のVPg-Proを精製するためのプロトコルを記述BS3と架橋したストレプト-Tactinのポリメタクリレート樹脂を用いてベンサミアナタバコ植物 。同じプロトコルは、目的の任意の二Strepタグタンパク質を精製し、その生理学的結合パートナーを特徴付けるために使用することができる。

精製手順を模式的に一緒に他の既存の精製方法に伴う問題の表現と、 図1に示されている。 <img alt="図1" fo:content-width="5.5in" src="/files/ftp_upload/51536/51536fig1highres.jpg" width="650" /> 図1精製手順の概略図。ワークフローは、共有結合架橋樹脂に二Strepタグベイトタンパク質と会合した複合体の結合を、BS3との架橋を介して樹?...

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One-step Purification of Twin-Strep-tagged Proteins and Their Complexes on Strep-Tactin Resin Cross-linked With Bissulfosuccinimidyl Suberate BS3

ツイン連鎖球菌タグタンパク質とのStrep-Tactinの樹脂ビスで架橋された（スルホスクシンイミジル）スベレート（BS3）に対するそれらの複合体のいずれかの段階精製

この方法は、ツインのStrepタグ融合タンパク質と共有結合的にビス（スルホスクシンイミジル）（BS3）で架橋された修正されたストレプトアビジン（ストレプト-Tactinの）樹脂上での具体的な複合体の効率的な精製方法が記載されている。この方法は、速い速度の利点は、良好な標的タンパク質の回収および高純度を有し、質量分析によるその後の分析に対応している。

Affinity purification of Strep-tagged fusion proteins on resins carrying an engineered streptavidin (Strep-Tactin) has become a widely used method for ...

Research

JoVE Journal

Biology

One-step Purification of Twin-Strep-tagged Proteins and Their Complexes on Strep-Tactin Resin Cross-linked With Bis(sulfosuccinimidyl) Suberate (BS3)

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