Name: one-step purification of twin-strep-tagged proteins and their complexes on strep-tactin resin cross-linked with bis(sulfosuccinimidyl) suberate (bs3)
Uploaded: 2014-04-20T14:00:00
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Agradecemos o apoio técnico da Sini Miettinen, Minna Pöllänen e Taru Rautavesi. Agradecemos Helka Nurkkala para fornecer HEK 293 células expressando twin-Strep-marcado GFP e Pekka Evijärvi para o fornecimento de equipamentos de gravação de som. Este trabalho foi financiado pela Academia da Finlândia, conceder números 138329, 134684 e 258978.

1. Cross-linking de Strep-Tactin polimetacrilato Resina com Bis (sulfossuccinimidilo) suberato (BS3) <ol><li> Equilibrar um microtubo selado contendo 2 mg de BS3 de reticulação à temperatura ambiente. CUIDADO: BS3 é uma substância perigosa. Usar luvas e óculos de proteção. </li><li> Resina de polimetacrilato Ressuspender Strep-Tactin (50% de suspensão em 100 mM Tris-HCl, pH 8,0; EDTA 1 mM; NaCl 150 mM) por breve agitação vigorosa e transferir imediatamente 600 uL da suspensão para uma coluna de centrifuga?...

<ol>
	<li>Voss, S., Skerra, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutagenesis+of+a+flexible+loop+in+streptavidin+leads+to+higher+affinity+for+the+Strep-tag+II+peptide+and+improved+performance+in+recombinant+protein+purification.">Mutagenesis of a flexible loop in streptavidin leads to higher affinity for the Strep-tag II peptide and improved performance in recombinant protein purification.</a> Protein Eng. 10 (8), 975-982 (1997).</li><li>Schmidt, T. G., Skerra, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Strep-tag+system+for+one-step+purification+and+high-affinity+detection+or+capturing+of+proteins.">The Strep-tag system for one-step purification and high-affinity detection or capturing of proteins.</a> Nat. Protoc. 2 (6), 1528-1535 (2007).</li><li>Junttila, M. R., Saarinen, S., Schmidt, T., Kast, J., Westermarck, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-step+Strep-tag+purification+for+the+isolation+and+identification+of+protein+complexes+from+mammalian+cells.">Single-step Strep-tag purification for the isolation and identification of protein complexes from mammalian cells.</a> Proteomics. 5 (5), 1199-1203 (2005).</li><li>Hafren, A., Hofius, D., Ronnholm, G., Sonnewald, U., Makinen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HSP70+and+its+cochaperone+CPIP+promote+potyvirus+infection+in+Nicotiana+benthamiana+by+regulating+viral+coat+protein+functions.">HSP70 and its cochaperone CPIP promote potyvirus infection in Nicotiana benthamiana by regulating viral coat protein functions.</a> Plant Cell. 22 (2), 523-535 (2010).</li><li>Jaskiewicz, M., Peterhansel, C., Conrath, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+histone+modifications+in+plant+leaves.">Detection of histone modifications in plant leaves.</a> J. Vis. Exp. (55), (2011).</li><li>Witte, C. P., Noel, L. D., Gielbert, J., Parker, J. E., Romeis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+one-step+protein+purification+from+plant+material+using+the+eight-amino+acid+StrepII+epitope.">Rapid one-step protein purification from plant material using the eight-amino acid StrepII epitope.</a> Plant Mol. Biol. 55 (1), 135-147 (2004).</li><li>Werner, A. K., Sparkes, I. A., Romeis, T., Witte, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification,+biochemical+characterization,+and+subcellular+localization+of+allantoate+amidohydrolases+from+Arabidopsis+and+soybean.">Identification, biochemical characterization, and subcellular localization of allantoate amidohydrolases from Arabidopsis and soybean.</a> Plant Physiol. 146 (2), 418-430 (2008).</li><li>Panwar, P., Deniaud, A., Pebay-Peyroula, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contamination+from+an+affinity+column:+an+encounter+with+a+new+villain+in+the+world+of+membrane-protein+crystallization.">Contamination from an affinity column: an encounter with a new villain in the world of membrane-protein crystallization.</a> Acta Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 68 (10), 1272-1277 (2012).</li><li>Hendrickson, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+core+streptavidin+determined+from+multiwavelength+anomalous+diffraction+of+synchrotron+radiation.">Crystal structure of core streptavidin determined from multiwavelength anomalous diffraction of synchrotron radiation.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 86 (7), 2190-2194 (1989).</li><li>Bernot, K. M., Lee, C. H., Coulombe, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+small+surface+hydrophobic+stripe+in+the+coiled-coil+domain+of+type+I+keratins+mediates+tetramer+stability.">A small surface hydrophobic stripe in the coiled-coil domain of type I keratins mediates tetramer stability.</a> J. Cell Biol. 168 (6), 965-974 (2005).</li><li>Singh, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solution+structure+of+human+von+Willebrand+factor+studied+using+small+angle+neutron+scattering.">Solution structure of human von Willebrand factor studied using small angle neutron scattering.</a> J. Biol. Chem. 281 (50), 38266-38275 (2006).</li><li>Weldon, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+immunogenicity+of+stabilized+trimeric+soluble+influenza+hemagglutinin.">Enhanced immunogenicity of stabilized trimeric soluble influenza hemagglutinin.</a> PLoS One. 5 (9), (2010).</li><li>Wang, W., Barger, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Roles+of+quaternary+structure+and+cysteine+residues+in+the+activity+of+human+serine+racemase.">Roles of quaternary structure and cysteine residues in the activity of human serine racemase.</a> BMC Biochem. 12, 63 (2011).</li><li>Rappsilber, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+beginning+of+a+beautiful+friendship:+cross-linking/mass+spectrometry+and+modelling+of+proteins+and+multi-protein+complexes.">The beginning of a beautiful friendship: cross-linking/mass spectrometry and modelling of proteins and multi-protein complexes.</a> J. Struct. Biol. 173 (3), 530-540 (2011).</li><li>Sousa, M. M., Steen, K. W., Hagen, L., Slupphaug, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody+cross-linking+and+target+elution+protocols+used+for+immunoprecipitation+significantly+modulate+signal-to+noise+ratio+in+downstream+2D-PAGE+analysis.">Antibody cross-linking and target elution protocols used for immunoprecipitation significantly modulate signal-to noise ratio in downstream 2D-PAGE analysis.</a> Proteome Sci. 9, 45 (2011).</li></ol>

O protocolo acima pode ser utilizado para purificar qualquer proteína isco duplo-Strep-tag de interesse e os seus complexos associados em qualquer tampão adequado, que não contém biotina ou desnaturantes fortes. Na versão atual do protocolo, obrigatório e lavagem são realizadas em condições relativamente severas na presença de alto teor de sal e detergente não-iônico. Embora isto resulta em menos fundo, complexos de proteína frágeis podem dissociar sob estas condições. Para preservar os complexos de afin...

Nos últimos anos, a tecnologia Strep-tag tornou-se amplamente utilizado em muitas áreas de pesquisa biomédica, incluindo proteômica e biologia estrutural. Esta tecnologia de purificação de proteínas, o qual baseia-se na fusão de proteínas recombinantes a um péptido curto Strep-tag, amadureceu com o advento de matrizes de afinidade que transportam Strep-Tactin, uma variante geneticamente modificada de estreptavidina com uma melhor capacidade de ligação de péptidos 1, 2. As proteínas de fusão contendo duas cópias do Strep-tag II, designados-Strep-tag ou twin-tag SIII, exibem uma maior afinidade para matrizes Strep-Tactin do que aqueles que contêm apenas uma tag Strep único, garantindo a purificação mais eficiente das proteínas recombinantes e seus parceiros de ligação associados. No entanto, a maior afinidade de proteínas twin-Strep-tag para Strep-Tactin também tem seu lado negativo. Eluição competitiva de tais proteínas, com o excesso de biotina pode ser incompleta, levando à produção de proteína alvo diminui. Um mminério eficiente alternativa é a eluição com SDS, mas conduz a uma contaminação indesejada da amostra com Strep-Tactin libertado da resina, tornando o ensaio de incompatibilidade com a análise de proteoma. Este documento apresenta uma técnica para superar esta limitação, o primeiro estabilizador tetrâmero acoplado à resina de Strep-Tactin por reticulação química e, em seguida, utilizando SDS para eluir proteínas de duplo Strep-tag e os seus complexos associados a partir da resina com ligações cruzadas resultante. Assim, o rendimento de proteína suficiente pode ser conseguida sem a contaminação da amostra com Strep-Tactin, permitindo, assim, ainda mais a análise por espectrometria de massa. O método é adequado para a purificação de qualquer proteína de fusão recombinante com uma etiqueta de SIII exposto à superfície ou 3-Strep-tag duplo (WSHPQFEK sequência de aminoácidos (GGGS) 3 WSHPQFEK SAWSHPQFEK e (GGGS) 2 GGSAWSHPQFEK, respectivamente). A proteína pode ser de origem animal, vegetal ou de origem bacteriana e pode ser isolado a partir de qualquer célula totaislisado ou fracção enriquecida organelo. Como exemplo, descrevemos aqui a purificação de uma proteína marcada com SIII VPg-Pro de batata vírus A (PVA) 4 a partir da fracção nuclear de PVA-infectadas de plantas de Nicotiana benthamiana. A fracção nuclear foi isolado como descrito anteriormente 5, com as seguintes modificações: As células não foram tratadas com o formaldeído, o butirato de sódio foi substituído em todos os tampões, com fluoreto de sódio 5 mM, inibidor de protease completo foi substituído com PMSF, Triton X-100 a concentração na extracção tampão # 2 foi reduzido para 0,3% (v / v) e o sedimento nuclear obtida por centrifugação através de almofada de sacarose (tampão de extracção # 3) foi novamente suspenso em 1,45 ml de tampão de ligação pré-refrigerado e rodado durante 1,5 horas a 4 ° C. O extrato nuclear resultante contendo a proteína isca SIII-marcados e complexos associados (amostra proteína isca) foi processado de acordo com o protocolo descrito a seguir (ver secção 2).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="606">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bis(sulfosuccinimidyl) suberate (BS3), No-Weigh format, 8 x 2mg</td>
			<td>Pierce/Thermo Scientific</td>
			<td>21585</td>
			<td><a href="http://www.fishersci.com">www.fishersci.com CAUTION: Hazardous substance. Causes serious respiratory, skin and eye irritation. Wear protective gloves and eye protection.</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Strep-Tactin MacroPrep resin (50% suspension)</td>
			<td>IBA</td>
			<td>2-1505</td>
			<td><a href="http://www.iba-lifesciences.com/">www.iba-lifesciences.com</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spin-X centrifuge tube filter, cellulose acetate membrane, pore size 0.45 &#956;m, non-sterile</td>
			<td>Costar (Corning)</td>
			<td>8163</td>
			<td><a href="http://www.corning.com/lifesciences/">www.corning.com/lifesciences/</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dolphin-nose tubes</td>
			<td>Costar (Corning)</td>
			<td>3213</td>
			<td><a href="http://www.corning.com/lifesciences/">www.corning.com/lifesciences/</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Avidin&#160;</td>
			<td>IBA</td>
			<td>2-0204</td>
			<td><a href="http://www.iba-lifesciences.com/">www.iba-lifesciences.com</a></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

one-step purification of twin-strep-tagged proteins and their complexes on strep-tactin resin cross-linked with bis(sulfosuccinimidyl) suberate (bs3)

A purificação por afinidade das proteínas de fusão marcadas com Strep-resinas que transportam um estreptavidina engenharia (Strep-Tactin) tornou-se um método utilizado para o isolamento de complexos de proteínas sob condições fisiológicas. As proteínas de fusão que contêm duas cópias de Strep-tag II, designadas-Strep-tag ou duplo SIII-tag, têm a vantagem de uma maior afinidade para o Strep-Tactin em comparação com aquelas que contêm apenas um Strep-tag único, permitindo assim a purificação da proteína mais eficiente. No entanto, esta vantagem é compensada pelo fato de que a eluição de proteínas twin-Strep-marcadas com biotina pode ser incompleta, levando a baixa recuperação de proteína. A recuperação pode ser drasticamente melhorada utilizando desnaturação eluição com dodecil-sulfato de sódio (SDS), mas isto conduz a amostra de contaminação com Strep-Tactin libertado da resina, tornando o ensaio de incompatibilidade com a análise de proteómica jusante. Para superar esta limitação, temos desenvolvido um método pelo qual tetrâmero acoplados à resina de Strep-Tactiné estabilizada pela primeira vez por reticulação covalente com bis (sulfosuccinimidil) suberato (BS3), e a resina com ligações cruzadas resultante é, então, utilizada para purificar complexos de proteínas-alvo em um único passo de purificação por lotes. Eluição eficiente com SDS garante uma boa recuperação de proteína, enquanto a ausência de contaminação Strep-Tactin permite a análise de proteínas downstream por espectrometria de massa. Como prova do conceito, aqui descrita de um protocolo para a purificação de proteínas virais SIII marcado com VPg-Pro a partir de núcleos de N. infectadas com vírus benthamiana plantas utilizando a resina de polimetacrilato Strep-Tactin reticulados com BS3. O mesmo protocolo pode ser utilizado para purificar qualquer proteína duplo-Strep-tag de interesse e caracterizar os seus parceiros de ligação fisiológicas.

O procedimento de purificação está esquematicamente ilustrada na Figura 1, juntamente com uma representação de problemas associados com outros métodos de purificação existentes. <img alt="Figura 1" fo:content-width="5.5in" src="/files/ftp_upload/51536/51536fig1highres.jpg" width="650" /> Figura 1. Representação esquemática do procedimento de purificação. O fluxo de trabalho inclui a estabilização da S...

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One-step Purification of Twin-Strep-tagged Proteins and Their Complexes on Strep-Tactin Resin Cross-linked With Bissulfosuccinimidyl Suberate BS3

Um passo de Purificação de Proteínas Twin-Strep-tag e seus complexos de Strep-Tactin Resina reticulado com Bis (sulfossuccinimidilo) suberato (BS3)

É descrito um método para a purificação eficiente de proteínas de fusão duplo-Strep-marcados e os seus complexos específicos de estreptavidina modificada (Strep-Tactin) resina covalentemente reticulado com bis (sulfosuccinimidil) suberato (BS3). O método tem as vantagens de alta velocidade, uma boa recuperação da proteína alvo e de elevada pureza, e é compatível com a análise subsequente por espectrometria de massa.

Affinity purification of Strep-tagged fusion proteins on resins carrying an engineered streptavidin (Strep-Tactin) has become a widely used method for ...

Research

JoVE Journal

Biology

One-step Purification of Twin-Strep-tagged Proteins and Their Complexes on Strep-Tactin Resin Cross-linked With Bis(sulfosuccinimidyl) Suberate (BS3)

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