Name: one-step purification of twin-strep-tagged proteins and their complexes on strep-tactin resin cross-linked with bis(sulfosuccinimidyl) suberate (bs3)
Uploaded: 2014-04-20T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about One-step Purification of Twin-Strep-tagged Proteins and Their Complexes on Strep-Tactin Resin Cross-linked With Bissulfosuccinimidyl Suberate BS3 at JoVE.com

Мы выражаем искреннюю благодарность за техническую поддержку Сини Миеттиненом, Минна Pöllänen и Тару Раутавеси. Мы благодарим Helka Nurkkala для обеспечения НЕК 293 клетки, экспрессирующие твин-Стрептококковое-меткой GFP и Пекка Evijärvi для обеспечения звукового оборудования записи. Эта работа финансировалась Академией Финляндии, предоставить номера 138329, 134684 и 258978.

1. Сшивка Strep-Tactin полиметакрилатные Ресин с бис (сульфосукцинимидил) суберат (BS3) <ol><li> Равновесие один запечатанный микропробирок, содержащий 2 мг BS3 сшивающего агента до комнатной температуры. ВНИМАНИЕ: BS3 является опасным веществом. Носите защитные перчатки и очки. </li><li> Ресуспендируют...

<ol>
	<li>Voss, S., Skerra, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutagenesis+of+a+flexible+loop+in+streptavidin+leads+to+higher+affinity+for+the+Strep-tag+II+peptide+and+improved+performance+in+recombinant+protein+purification.">Mutagenesis of a flexible loop in streptavidin leads to higher affinity for the Strep-tag II peptide and improved performance in recombinant protein purification.</a> Protein Eng. 10 (8), 975-982 (1997).</li><li>Schmidt, T. G., Skerra, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Strep-tag+system+for+one-step+purification+and+high-affinity+detection+or+capturing+of+proteins.">The Strep-tag system for one-step purification and high-affinity detection or capturing of proteins.</a> Nat. Protoc. 2 (6), 1528-1535 (2007).</li><li>Junttila, M. R., Saarinen, S., Schmidt, T., Kast, J., Westermarck, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-step+Strep-tag+purification+for+the+isolation+and+identification+of+protein+complexes+from+mammalian+cells.">Single-step Strep-tag purification for the isolation and identification of protein complexes from mammalian cells.</a> Proteomics. 5 (5), 1199-1203 (2005).</li><li>Hafren, A., Hofius, D., Ronnholm, G., Sonnewald, U., Makinen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HSP70+and+its+cochaperone+CPIP+promote+potyvirus+infection+in+Nicotiana+benthamiana+by+regulating+viral+coat+protein+functions.">HSP70 and its cochaperone CPIP promote potyvirus infection in Nicotiana benthamiana by regulating viral coat protein functions.</a> Plant Cell. 22 (2), 523-535 (2010).</li><li>Jaskiewicz, M., Peterhansel, C., Conrath, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+histone+modifications+in+plant+leaves.">Detection of histone modifications in plant leaves.</a> J. Vis. Exp. (55), (2011).</li><li>Witte, C. P., Noel, L. D., Gielbert, J., Parker, J. E., Romeis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+one-step+protein+purification+from+plant+material+using+the+eight-amino+acid+StrepII+epitope.">Rapid one-step protein purification from plant material using the eight-amino acid StrepII epitope.</a> Plant Mol. Biol. 55 (1), 135-147 (2004).</li><li>Werner, A. K., Sparkes, I. A., Romeis, T., Witte, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification,+biochemical+characterization,+and+subcellular+localization+of+allantoate+amidohydrolases+from+Arabidopsis+and+soybean.">Identification, biochemical characterization, and subcellular localization of allantoate amidohydrolases from Arabidopsis and soybean.</a> Plant Physiol. 146 (2), 418-430 (2008).</li><li>Panwar, P., Deniaud, A., Pebay-Peyroula, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contamination+from+an+affinity+column:+an+encounter+with+a+new+villain+in+the+world+of+membrane-protein+crystallization.">Contamination from an affinity column: an encounter with a new villain in the world of membrane-protein crystallization.</a> Acta Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 68 (10), 1272-1277 (2012).</li><li>Hendrickson, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+core+streptavidin+determined+from+multiwavelength+anomalous+diffraction+of+synchrotron+radiation.">Crystal structure of core streptavidin determined from multiwavelength anomalous diffraction of synchrotron radiation.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 86 (7), 2190-2194 (1989).</li><li>Bernot, K. M., Lee, C. H., Coulombe, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+small+surface+hydrophobic+stripe+in+the+coiled-coil+domain+of+type+I+keratins+mediates+tetramer+stability.">A small surface hydrophobic stripe in the coiled-coil domain of type I keratins mediates tetramer stability.</a> J. Cell Biol. 168 (6), 965-974 (2005).</li><li>Singh, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solution+structure+of+human+von+Willebrand+factor+studied+using+small+angle+neutron+scattering.">Solution structure of human von Willebrand factor studied using small angle neutron scattering.</a> J. Biol. Chem. 281 (50), 38266-38275 (2006).</li><li>Weldon, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+immunogenicity+of+stabilized+trimeric+soluble+influenza+hemagglutinin.">Enhanced immunogenicity of stabilized trimeric soluble influenza hemagglutinin.</a> PLoS One. 5 (9), (2010).</li><li>Wang, W., Barger, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Roles+of+quaternary+structure+and+cysteine+residues+in+the+activity+of+human+serine+racemase.">Roles of quaternary structure and cysteine residues in the activity of human serine racemase.</a> BMC Biochem. 12, 63 (2011).</li><li>Rappsilber, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+beginning+of+a+beautiful+friendship:+cross-linking/mass+spectrometry+and+modelling+of+proteins+and+multi-protein+complexes.">The beginning of a beautiful friendship: cross-linking/mass spectrometry and modelling of proteins and multi-protein complexes.</a> J. Struct. Biol. 173 (3), 530-540 (2011).</li><li>Sousa, M. M., Steen, K. W., Hagen, L., Slupphaug, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody+cross-linking+and+target+elution+protocols+used+for+immunoprecipitation+significantly+modulate+signal-to+noise+ratio+in+downstream+2D-PAGE+analysis.">Antibody cross-linking and target elution protocols used for immunoprecipitation significantly modulate signal-to noise ratio in downstream 2D-PAGE analysis.</a> Proteome Sci. 9, 45 (2011).</li></ol>

Данный протокол может быть использован для очистки любой твин-Strep-меченого приманки интерес белок и связанных комплексов в любом подходящем буфере, который не содержит биотин или сильные денатурирующих. В текущей версии протокола, связывание и стиральная выполняются в относительно ж?...

В последние годы технология Стрептококковое-тег стал широко используемым во многих областях биомедицинских исследований, в том числе протеомики и структурной биологии. Эта технология очистки белка, которая опирается на слияние рекомбинантных белков на короткий пептид Стрептококковое-тега, созрел с появлением сродства матриц, несущих Strep-Tactin, генетически модифицированного варианта стрептавидином с улучшенной пептид-связывающей способности. 1, 2 Гибридные белки, содержащие две копии Strep-тега II, обозначенные двойной Стрептококковое-теги или SIII-тег, проявляют высокое сродство к Стрептококковое-Tactin матриц, чем те, которые содержат только один Strep-тег, обеспечивая более эффективную очистку рекомбинантных белков и связанные с ними связывающие партнеры. Тем не менее, более высокое сродство твин-Стрептококковое-меченых белков Strep-Tactin также имеет свою оборотную сторону. Конкурентная вымывание таких белков с избыточным биотина может быть неполным, что приводит к снижению выход белка целевой. Мруда эффективной альтернативой является элюирование SDS, но это приводит к нежелательному загрязнения образца с Strep-Tactin выпущенный из смолы, что делает анализ несовместимы с протеомного анализа. Эта статья представляет собой технику, чтобы преодолеть это ограничение, сначала стабилизации смолы связью тетрамер стрептококкового-Tactin с помощью химической сшивки, а затем с помощью SDS для элюирования твин-Стрептококковое-тегом белки и связанные с ними комплексы из полученного сшитого полимера. Таким образом, достаточно выход белка может быть достигнуто без загрязнения образца с Strep-Tactin, тем самым позволяя дальнейшего анализа методом масс-спектрометрии. Метод подходит для очистки любого рекомбинантного гибридного белка с поверхности, подвергшихся воздействию SIII-тега 3 или двумя-Strep-тега (последовательность аминокислот WSHPQFEK (GGGS) 3 WSHPQFEK и SAWSHPQFEK (GGGS) 2 GGSAWSHPQFEK, соответственно). Белок может быть животного, растительного или бактериального происхождения и может быть выделен из клеток либо общийлизат или обогащенный органелл фракция. В качестве примера, мы описываем здесь очищение в SIII с метками белка ВПГ-Профи Картофель Virus A (ПВС) 4 от ядерной фракции ПВА-инфицированных Nicotiana benthamiana растений. Ядерный фракцию выделяли, как описано ранее 5, со следующими изменениями: клетки не были обработаны формальдегидом, бутират натрия замещенных во всех буферов 5 мМ фторида натрия, в комплекте ингибитор протеазы был замещен PMSF, Тритон Х-100 в концентрации добычи буфер # 2 был снижен до 0,3% (объем / объем) и ядерный осадок получали центрифугированием через сахарозы (экстракционный буфер # 3) ресуспендировали в 1,45 мл предварительно охлажденной буфером для связывания и вращают в течение 1,5 часов при 4 ° С. Полученную ядерный экстракт, содержащий SIII-меченого белка приманки и связанные комплексы (примеры приманка белка) обрабатывают в соответствии с протоколом, описанным ниже (см. раздел 2).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="606">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bis(sulfosuccinimidyl) suberate (BS3), No-Weigh format, 8 x 2mg</td>
			<td>Pierce/Thermo Scientific</td>
			<td>21585</td>
			<td><a href="http://www.fishersci.com">www.fishersci.com CAUTION: Hazardous substance. Causes serious respiratory, skin and eye irritation. Wear protective gloves and eye protection.</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Strep-Tactin MacroPrep resin (50% suspension)</td>
			<td>IBA</td>
			<td>2-1505</td>
			<td><a href="http://www.iba-lifesciences.com/">www.iba-lifesciences.com</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spin-X centrifuge tube filter, cellulose acetate membrane, pore size 0.45 &#956;m, non-sterile</td>
			<td>Costar (Corning)</td>
			<td>8163</td>
			<td><a href="http://www.corning.com/lifesciences/">www.corning.com/lifesciences/</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dolphin-nose tubes</td>
			<td>Costar (Corning)</td>
			<td>3213</td>
			<td><a href="http://www.corning.com/lifesciences/">www.corning.com/lifesciences/</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Avidin&#160;</td>
			<td>IBA</td>
			<td>2-0204</td>
			<td><a href="http://www.iba-lifesciences.com/">www.iba-lifesciences.com</a></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

one-step purification of twin-strep-tagged proteins and their complexes on strep-tactin resin cross-linked with bis(sulfosuccinimidyl) suberate (bs3)

Affinity очистка Стрептококковое метками слитых белков на смол, несущих инженерии стрептавидин (Стрептококковое-Tactin) стал широко используемым методом для выделения белковых комплексов в физиологических условиях. Гибридные белки, содержащие две копии Strep-тега II, обозначенные двойной-Strep-теги или SIII-тег, имеют то преимущество, более высокое сродство к Strep-Tactin по сравнению с те, которые содержат только один Strep-тег, что позволяет более эффективную очистку белка. Однако это преимущество компенсируется тем, что вымывание твин-Стрептококковое-меченых белков с биотин может быть неполной, что приводит к низкой восстановления белка. Восстановление может быть значительно улучшена с помощью денатурирующего элюирование с додецилсульфатом натрия (SDS), но это приводит к образцу заражение Strep-Tactin выпущенный из смолы, что делает анализ несовместимы с последующей протеомного анализа. Чтобы преодолеть это ограничение, мы разработали метод, посредством смолы в сочетании тетрамерное из Strep-Tactinсначала стабилизированы ковалентной сшивки с бис (сульфосукцинимидил) суберат (BS3) и полученную сшитый полимер затем использовать для очистки целевых комплексов белков в одной стадии очистки пакета. Эффективное элюирование SDS обеспечивает хорошее восстановление белка, а отсутствие загрязнения Strep-Tactin позволяет потоку анализа белков методом масс-спектрометрии. Как доказательство концепции, мы описываем здесь протокол для очистки SIII-меченого вирусного белка ВПГ-Pro из ядер инфицированных вирусом N. benthamiana растения, использующие полиметакрилатные смолы Стрептококковое-Tactin сшитый с БС3. То же протокол может быть использован для очистки любой твин-Strep-меченый белок, представляющий интерес и характеризуют его физиологических партнеров по связыванию.

Процедура очистки схематически показано на фиг.1, вместе с представлением проблем, связанных с другими существующими методами очистки. <img alt="Рисунок 1" fo:content-width="5.5in" src="/files/ftp_upload/51536/51536fig1highres.jpg" width="650" /> Рисунок 1. Схематическое предста?...

Watch this Scientific Journal Video about One-step Purification of Twin-Strep-tagged Proteins and Their Complexes on Strep-Tactin Resin Cross-linked With Bissulfosuccinimidyl Suberate BS3 at JoVE.com

One-step Purification of Twin-Strep-tagged Proteins and Their Complexes on Strep-Tactin Resin Cross-linked With Bissulfosuccinimidyl Suberate BS3

Один шаг Очистка Твин-Стрептококковое-меченых белков и их комплексов на Стрептококковое-Tactin Смола, сшитые с бис (сульфосукцинимидил) суберат (BS3)

Описан способ эффективного очищения твин-Strep-меченых гибридных белков и их специфических комплексов на модифицированной стрептавидином (Strep-Tactin) смолу, ковалентно сшитый с бис (сульфосукцинимидил) суберат (BS3). Способ имеет преимущества высокой скорости, хорошее восстановление белка-мишени и высокой степенью чистоты, и совместим с последующим анализом методом масс-спектрометрии.

Affinity purification of Strep-tagged fusion proteins on resins carrying an engineered streptavidin (Strep-Tactin) has become a widely used method for ...

Research

JoVE Journal

Biology

One-step Purification of Twin-Strep-tagged Proteins and Their Complexes on Strep-Tactin Resin Cross-linked With Bis(sulfosuccinimidyl) Suberate (BS3)

Purification and Visualization of Influenza A Viral Ribonucleoprotein Complexes

Очистка и визуализация гриппа Вирусный комплексы рибонуклеопротеидных

The influenza A viral genome consists of eight negative-sense, single stranded RNA molecules, individually packed with multiple copies of the influenza A ...

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

Окрашивание белков в гелях Кумасси G-250 без органических растворителей и уксусной кислоты

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Genetic Studies of Human DNA Repair Proteins Using Yeast as a Model System 

Генетические исследования белков человека Ремонт ДНК Использование дрожжей в качестве модельной системы

Understanding the roles of human DNA repair proteins in genetic pathways is a formidable challenge to many researchers.  Genetic studies in mammalian ...

One-step Metabolomics: Carbohydrates, Organic and Amino Acids Quantified in a Single Procedure

Один шаг метаболомики: углеводы, органические и аминокислоты количественно в одну процедуру

Every infant born in the US is now screened for up to 42 rare genetic disorders called "inborn errors of metabolism". The screening method is based on ...

Preparation, Purification, and Characterization of Lanthanide Complexes for Use as Contrast Agents for Magnetic Resonance Imaging

Подготовка, очистка и характеристика комплексов лантанидов для использования в качестве контрастных агентов для магнитно-резонансная томография

Polyaminopolycarboxylate-based ligands are commonly used to chelate lanthanide ions, and the resulting complexes are 
useful as contrast agents for ...

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Определение белковых комплексов в<em&gt; Кишечной палочки</em&gt; С помощью последовательного аффинной очистки пептидов в сочетании с тандемной масс-спектрометрии

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the ...

Formulations for Freeze-drying of Bacteria and Their Influence on Cell Survival

Препараты для Лиофилизацию бактерий и их влияние на выживаемость клеток

Cellular water can be removed to reversibly inactivate microorganisms to facilitate storage. One such method of removal is freeze-drying, which is ...

High-throughput Purification of Affinity-tagged Recombinant Proteins

Высокая пропускная способность очистки Affinity с метками рекомбинантных белков

X-ray crystallography is the method of choice for obtaining a detailed view of the structure of proteins. Such studies need to be complemented by further ...

Purification of Transcripts and Metabolites from Drosophila Heads

Purification of Transcripts and Metabolites from Drosophila Heads

Очистка стенограммы и метаболитов из<em&gt; Drosophila</em&gt; Главы

For the last decade, we have tried to understand the molecular and cellular mechanisms of neuronal degeneration using Drosophila as a model organism. ...

Non-chromatographic Purification of Recombinant Elastin-like Polypeptides and their Fusions with Peptides and Proteins from Escherichia coli

Non-chromatographic Purification of Recombinant Elastin-like Polypeptides and their Fusions with Peptides and Proteins from Escherichia coli

Номера хроматографической очистки рекомбинантного Эластин-подобных полипептидов и их слияний с пептидов и белков с<em&gt; Кишечная палочка</em

Elastin-like polypeptides are repetitive biopolymers that exhibit a lower critical solution temperature phase transition behavior, existing as soluble ...