Name: one-step purification of twin-strep-tagged proteins and their complexes on strep-tactin resin cross-linked with bis(sulfosuccinimidyl) suberate (bs3)
Uploaded: 2014-04-20T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about One-step Purification of Twin-Strep-tagged Proteins and Their Complexes on Strep-Tactin Resin Cross-linked With Bissulfosuccinimidyl Suberate BS3 at JoVE.com

Vi erkänner tacksamt tekniskt stöd från Sini Miettinen, Minna Pöllänen och Taru Rautavesi. Vi tackar Helka Nurkkala för att ge HEK 293 celler som uttrycker twin-Strep-märkta GFP och Pekka Evijärvi för att ge ljudinspelningsutrustning. Detta arbete har finansierats av Finlands Akademi, beviljar nummer 138329, 134.684 och 258.978.

1. Tvärbindning av Strep-Tactin polymetakrylatharts med bis (sulfosuccinimidyl) suberat (BS3) <ol><li> Jämvikta en förseglad mikrorör innehållande 2 mg BS3 tvärbindare till rumstemperatur. VARNING: BS3 är ett farligt ämne. Använd skyddshandskar och skyddsglasögon. </li><li> Resuspendera Strep-Tactin polymetakrylatharts (50% suspension i 100 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1 mM EDTA, 150 mM NaCl) genom kortvarig kraftig skakning och omedelbart överför 600 pl av suspensionen till en centrifugeringskolonn med användnin...

<ol>
	<li>Voss, S., Skerra, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutagenesis+of+a+flexible+loop+in+streptavidin+leads+to+higher+affinity+for+the+Strep-tag+II+peptide+and+improved+performance+in+recombinant+protein+purification.">Mutagenesis of a flexible loop in streptavidin leads to higher affinity for the Strep-tag II peptide and improved performance in recombinant protein purification.</a> Protein Eng. 10 (8), 975-982 (1997).</li><li>Schmidt, T. G., Skerra, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Strep-tag+system+for+one-step+purification+and+high-affinity+detection+or+capturing+of+proteins.">The Strep-tag system for one-step purification and high-affinity detection or capturing of proteins.</a> Nat. Protoc. 2 (6), 1528-1535 (2007).</li><li>Junttila, M. R., Saarinen, S., Schmidt, T., Kast, J., Westermarck, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-step+Strep-tag+purification+for+the+isolation+and+identification+of+protein+complexes+from+mammalian+cells.">Single-step Strep-tag purification for the isolation and identification of protein complexes from mammalian cells.</a> Proteomics. 5 (5), 1199-1203 (2005).</li><li>Hafren, A., Hofius, D., Ronnholm, G., Sonnewald, U., Makinen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HSP70+and+its+cochaperone+CPIP+promote+potyvirus+infection+in+Nicotiana+benthamiana+by+regulating+viral+coat+protein+functions.">HSP70 and its cochaperone CPIP promote potyvirus infection in Nicotiana benthamiana by regulating viral coat protein functions.</a> Plant Cell. 22 (2), 523-535 (2010).</li><li>Jaskiewicz, M., Peterhansel, C., Conrath, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+histone+modifications+in+plant+leaves.">Detection of histone modifications in plant leaves.</a> J. Vis. Exp. (55), (2011).</li><li>Witte, C. P., Noel, L. D., Gielbert, J., Parker, J. E., Romeis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+one-step+protein+purification+from+plant+material+using+the+eight-amino+acid+StrepII+epitope.">Rapid one-step protein purification from plant material using the eight-amino acid StrepII epitope.</a> Plant Mol. Biol. 55 (1), 135-147 (2004).</li><li>Werner, A. K., Sparkes, I. A., Romeis, T., Witte, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification,+biochemical+characterization,+and+subcellular+localization+of+allantoate+amidohydrolases+from+Arabidopsis+and+soybean.">Identification, biochemical characterization, and subcellular localization of allantoate amidohydrolases from Arabidopsis and soybean.</a> Plant Physiol. 146 (2), 418-430 (2008).</li><li>Panwar, P., Deniaud, A., Pebay-Peyroula, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contamination+from+an+affinity+column:+an+encounter+with+a+new+villain+in+the+world+of+membrane-protein+crystallization.">Contamination from an affinity column: an encounter with a new villain in the world of membrane-protein crystallization.</a> Acta Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 68 (10), 1272-1277 (2012).</li><li>Hendrickson, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+core+streptavidin+determined+from+multiwavelength+anomalous+diffraction+of+synchrotron+radiation.">Crystal structure of core streptavidin determined from multiwavelength anomalous diffraction of synchrotron radiation.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 86 (7), 2190-2194 (1989).</li><li>Bernot, K. M., Lee, C. H., Coulombe, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+small+surface+hydrophobic+stripe+in+the+coiled-coil+domain+of+type+I+keratins+mediates+tetramer+stability.">A small surface hydrophobic stripe in the coiled-coil domain of type I keratins mediates tetramer stability.</a> J. Cell Biol. 168 (6), 965-974 (2005).</li><li>Singh, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solution+structure+of+human+von+Willebrand+factor+studied+using+small+angle+neutron+scattering.">Solution structure of human von Willebrand factor studied using small angle neutron scattering.</a> J. Biol. Chem. 281 (50), 38266-38275 (2006).</li><li>Weldon, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+immunogenicity+of+stabilized+trimeric+soluble+influenza+hemagglutinin.">Enhanced immunogenicity of stabilized trimeric soluble influenza hemagglutinin.</a> PLoS One. 5 (9), (2010).</li><li>Wang, W., Barger, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Roles+of+quaternary+structure+and+cysteine+residues+in+the+activity+of+human+serine+racemase.">Roles of quaternary structure and cysteine residues in the activity of human serine racemase.</a> BMC Biochem. 12, 63 (2011).</li><li>Rappsilber, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+beginning+of+a+beautiful+friendship:+cross-linking/mass+spectrometry+and+modelling+of+proteins+and+multi-protein+complexes.">The beginning of a beautiful friendship: cross-linking/mass spectrometry and modelling of proteins and multi-protein complexes.</a> J. Struct. Biol. 173 (3), 530-540 (2011).</li><li>Sousa, M. M., Steen, K. W., Hagen, L., Slupphaug, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody+cross-linking+and+target+elution+protocols+used+for+immunoprecipitation+significantly+modulate+signal-to+noise+ratio+in+downstream+2D-PAGE+analysis.">Antibody cross-linking and target elution protocols used for immunoprecipitation significantly modulate signal-to noise ratio in downstream 2D-PAGE analysis.</a> Proteome Sci. 9, 45 (2011).</li></ol>

Det ovanstående protokollet kan användas för att rena varje twin-Strep-taggat bete proteinet av intresse och dess associerade komplex i vilken lämplig buffert som inte innehåller biotin eller starka denatureringsmedel. I den nuvarande versionen av protokollet, bindande och tvätt utförs under relativt stränga förhållanden i närvaro av höga salt-och icke-jonisk detergent. Även om detta resulterar i mindre bakgrund, kan de instabila proteinkomplex dissociera under dessa betingelser. För att bevara dessa lägr...

Under de senaste åren har Strep-tagg tekniken blivit allmänt använda inom många områden av biomedicinsk forskning, inklusive proteomik och strukturbiologi. Denna proteinreningsteknik, som förlitar sig på fusion av rekombinanta proteiner med en kort Strep-Tag-peptiden, har mognat med tillkomsten av affinitetsmatriser transporterar Strep-Tactin, en genetiskt modifierad variant av streptavidin med förbättrad peptidbindande kapacitet. 1, 2 Fusionsproteiner som innehåller två kopior av Strep-Tag II, betecknade twin-Strep-tagg eller SIII-etikett, uppvisar en högre affinitet för Strep-Tactin matriser än de som innehåller endast en enda Strep-Tag, vilket säkerställer mer effektiv rening av de rekombinanta proteinerna och deras tillhörande bindningspartners. Emellertid har högre affinitet av twin-Strep-märkta proteiner till Strep-Tactin också sin baksida. Konkurrens eluering av sådana proteiner med överskott biotin kan vara ofullständig, vilket leder till minskad målprotein avkastning. A mmalmen effektivt alternativ är eluering med SDS, men det leder till oönskad förorening provet med Strep-Tactin frigöras från hartset, vilket gör analysen oförenligt med proteomic analys. Detta dokument presenterar en teknik för att övervinna denna begränsning genom att först stabilisera hartskopplade tetramer av Strep-Tactin genom kemisk tvärbindning och därefter med användning av SDS för att eluera twin-Strep-märkta proteiner och deras associerade komplex från den resulterande tvärbundna hartset. Således kan tillräcklig proteinutbytet uppnås utan provkontaminering med Strep-Tactin därigenom medge ytterligare analys med masspektrometri. Metoden lämpar sig för rening av vilken rekombinant fusionsprotein med en ytexponerade SIII tagg 3 eller tvilling-Strep-Tag (aminosyrasekvens WSHPQFEK (GGGS) 3 WSHPQFEK och SAWSHPQFEK (GGGS) 2 GGSAWSHPQFEK, respektive). Proteinet kan vara av djur-, växt-eller bakterieursprung och kan isoleras från antingen totalt celllysat eller berikad organell fraktionen. Som ett exempel beskriver vi här rening av en SIII-märkt protein Vpg-Pro av potatisvirus A (PVA) 4 från den nukleära fraktionen av PVA-infekterade Nicotiana benthamiana växter. Den nukleära fraktionen isolerades som tidigare beskrivits 5, med följande modifieringar: celler som inte behandlats med formaldehyd, har natriumbutyrat substituerade i alla buffertar med 5 mM natriumfluorid, var fullständig proteasinhibitor substituerad med PMSF, Triton X-100-koncentrationen i extraktion buffert # 2 var sänkt till 0,3% (v / v) och den nukleära pelleten erhållen genom centrifugering genom sackaros dyna (extraktionsbuffert # 3) återsuspenderades i 1,45 ml av i förväg kyld bindande buffert och roterades under 1,5 timmar vid 4 ° C. Det resulterande kärnextrakt som innehåller SIII-taggade bete protein och tillhörande komplex (bete protein prov) behandlades enligt protokollet som beskrivs nedan (se avsnitt 2).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="606">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bis(sulfosuccinimidyl) suberate (BS3), No-Weigh format, 8 x 2mg</td>
			<td>Pierce/Thermo Scientific</td>
			<td>21585</td>
			<td><a href="http://www.fishersci.com">www.fishersci.com CAUTION: Hazardous substance. Causes serious respiratory, skin and eye irritation. Wear protective gloves and eye protection.</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Strep-Tactin MacroPrep resin (50% suspension)</td>
			<td>IBA</td>
			<td>2-1505</td>
			<td><a href="http://www.iba-lifesciences.com/">www.iba-lifesciences.com</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spin-X centrifuge tube filter, cellulose acetate membrane, pore size 0.45 &#956;m, non-sterile</td>
			<td>Costar (Corning)</td>
			<td>8163</td>
			<td><a href="http://www.corning.com/lifesciences/">www.corning.com/lifesciences/</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dolphin-nose tubes</td>
			<td>Costar (Corning)</td>
			<td>3213</td>
			<td><a href="http://www.corning.com/lifesciences/">www.corning.com/lifesciences/</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Avidin&#160;</td>
			<td>IBA</td>
			<td>2-0204</td>
			<td><a href="http://www.iba-lifesciences.com/">www.iba-lifesciences.com</a></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

one-step purification of twin-strep-tagged proteins and their complexes on strep-tactin resin cross-linked with bis(sulfosuccinimidyl) suberate (bs3)

Affinitetsrening av Strep-taggade fusionsproteiner på hartser som bär en konstruerad streptavidin (Strep-Tactin) har blivit en allmänt använd metod för isolering av protein-komplex under fysiologiska betingelser. Fusionsproteiner som innehåller två kopior av Strep-Tag II, betecknade twin-Strep-tagg eller SIII-taggen, har fördelen av högre affinitet för Strep-Tactin jämfört med de som innehåller endast en enda Strep-Tag, vilket möjliggör mer effektiv proteinrening. Dock är denna fördel kompenseras av att eluering av twin-Strep-märkta proteiner med biotin kan vara ofullständig, vilket leder till låg protein återhämtning. Utvinningen kan förbättras dramatiskt genom användning av denaturerande eluering med natriumdodecylsulfat (SDS), men detta leder till prov kontaminering med Strep-Tactin frigöras från hartset, vilket gör analysen oförenligt med nedströms proteomic analys. För att övervinna denna begränsning, har vi utvecklat en metod där harts kopplade tetramer av Strep-Tactinförst stabiliseras genom kovalent tvärbindning med bis (sulfosuccinimidyl) suberat (BS3), och den resulterande tvärbundna harts används sedan för att rena mål-protein-komplex i en enda sats reningssteg. Effektiv eluering med SDS säkerställer god proteinutvinning, och avsaknaden av kontaminerande Strep-Tactin tillåter nedströms proteinanalys med masspektrometri. Som ett bevis på koncept, beskriver vi här ett protokoll för rening av SIII-märkta virusprotein Vpg-Pro från kärnor av virusinfekterade N. benthamiana växter genom användning av Strep-Tactin polymetakrylatharts tvärbunden med BS3. Samma protokoll kan användas för att rena varje twin-Strep-inmärkt protein av intresse och karakterisera dess fysiologiska bindningspartners.

Reningsproceduren illustreras schematiskt i figur 1, tillsammans med en representation av problem som är förknippade med andra existerande reningsmetoder. <img alt="Figur 1" fo:content-width="5.5in" src="/files/ftp_upload/51536/51536fig1highres.jpg" width="650" /> Figur 1. Schematisk representation av reningsförfarandet. Arbetsflödet innefattar stabilisering av hartskopplade Strep-Tactin tetramer genom kovalent ...

Watch this Scientific Journal Video about One-step Purification of Twin-Strep-tagged Proteins and Their Complexes on Strep-Tactin Resin Cross-linked With Bissulfosuccinimidyl Suberate BS3 at JoVE.com

One-step Purification of Twin-Strep-tagged Proteins and Their Complexes on Strep-Tactin Resin Cross-linked With Bissulfosuccinimidyl Suberate BS3

Ett steg Rening av Twin-Strep-märkta proteiner och deras komplex på Strep-Tactin Resin tvärbunden med bis (sulfosuccinimidyl) suberat (BS3)

Ett förfarande beskrivs för effektiv rening av twin-Strep-märkta fusionsproteiner och deras specifika komplex på modifierad streptavidin (Strep-Tactin)-harts som är kovalent tvärbundet med bis (sulfosuccinimidyl) suberat (BS3). Metoden har fördelarna av snabb hastighet, bra mål proteinutvinning och hög renhet, och är kompatibel med efterföljande analys genom masspektrometri.

Affinity purification of Strep-tagged fusion proteins on resins carrying an engineered streptavidin (Strep-Tactin) has become a widely used method for ...

Research

JoVE Journal

Biology

One-step Purification of Twin-Strep-tagged Proteins and Their Complexes on Strep-Tactin Resin Cross-linked With Bis(sulfosuccinimidyl) Suberate (BS3)

Purification and Visualization of Influenza A Viral Ribonucleoprotein Complexes

Rening och visualisering av influensa A Viral Ribonucleoprotein Complexes

The influenza A viral genome consists of eight negative-sense, single stranded RNA molecules, individually packed with multiple copies of the influenza A ...

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

Färgning av proteinerna i geler med Coomassie G-250 utan organiska lösningsmedel och ättiksyra

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Genetic Studies of Human DNA Repair Proteins Using Yeast as a Model System 

Genetiska studier av människans proteiner DNA Repair använder jäst som modellsystem

Understanding the roles of human DNA repair proteins in genetic pathways is a formidable challenge to many researchers.  Genetic studies in mammalian ...

One-step Metabolomics: Carbohydrates, Organic and Amino Acids Quantified in a Single Procedure

Ett steg Metabolomics: Kolhydrater, Organisk och aminosyror kvantifieras i ett enda förfarande

Every infant born in the US is now screened for up to 42 rare genetic disorders called "inborn errors of metabolism". The screening method is based on ...

Preparation, Purification, and Characterization of Lanthanide Complexes for Use as Contrast Agents for Magnetic Resonance Imaging

Förberedelse, rening och karakterisering av lantanider Complexes för användning som kontrastmedel för magnetisk resonanstomografi

Polyaminopolycarboxylate-based ligands are commonly used to chelate lanthanide ions, and the resulting complexes are 
useful as contrast agents for ...

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Identifiering av proteinkomplex i<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Hjälp Sekventiell rening peptid affinitet i kombination med tandem masspektrometri

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the ...

Formulations for Freeze-drying of Bacteria and Their Influence on Cell Survival

Formuleringar för frystorkning av bakterier och deras inverkan på cellöverlevnad

Cellular water can be removed to reversibly inactivate microorganisms to facilitate storage. One such method of removal is freeze-drying, which is ...

High-throughput Purification of Affinity-tagged Recombinant Proteins

Hög genomströmning Rening av Affinity-märkta rekombinanta proteiner

X-ray crystallography is the method of choice for obtaining a detailed view of the structure of proteins. Such studies need to be complemented by further ...

Purification of Transcripts and Metabolites from Drosophila Heads

Purification of Transcripts and Metabolites from Drosophila Heads

Rening av Transkript och metaboliter från<em&gt; Drosophila</em&gt; Heads

For the last decade, we have tried to understand the molecular and cellular mechanisms of neuronal degeneration using Drosophila as a model organism. ...

Non-chromatographic Purification of Recombinant Elastin-like Polypeptides and their Fusions with Peptides and Proteins from Escherichia coli

Non-chromatographic Purification of Recombinant Elastin-like Polypeptides and their Fusions with Peptides and Proteins from Escherichia coli

Icke-kromatografisk rening av rekombinant Elastin liknande polypeptider och deras fusioner med peptider och proteiner från<em&gt; Escherichia coli</em

Elastin-like polypeptides are repetitive biopolymers that exhibit a lower critical solution temperature phase transition behavior, existing as soluble ...