Name: one-step purification of twin-strep-tagged proteins and their complexes on strep-tactin resin cross-linked with bis(sulfosuccinimidyl) suberate (bs3)
Uploaded: 2014-04-20T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about One-step Purification of Twin-Strep-tagged Proteins and Their Complexes on Strep-Tactin Resin Cross-linked With Bissulfosuccinimidyl Suberate BS3 at JoVE.com

Biz minnetle Sini Miettinen, Minna Pöllänen ve Taru Rautavesi teknik destek için minnettarım. Biz HEK ses kayıt ekipmanları sağlanması için ikiz-Strep-etiketli GFP ve Pekka Evijarvi ifade 293 hücreler sağlamak için Helka Nurkkala teşekkür ederim. Bu çalışma Finlandiya Akademisi tarafından finanse edildi, sayıları 138329, 134684 ve 258978 hibe.

1.. Bis ile Strep-taktin polimetakrilat reçine (sülfosuksinimidil) çapraz bağlanması, suberat (BS3) <ol><li> Oda sıcaklığına BS3 çapraz bağlayıcı içeren 2 mg bir sızdırmaz mikrotüp dengelenmesi. DİKKAT: BS3 tehlikeli bir maddedir. Koruyucu eldiven ve gözlük takın. </li><li> Strep-taktin süspanse polimetakrilat reçine (100 mM Tris-HCI, pH 8.0 içinde% 50 süspansiyon, 1 mM EDTA, 150 mM NaCl) ile çalkalanarak kısa ve hemen bir pipet kullanarak bir döndürme kolonuna süspansiyonu 600 ul transfe...

<ol>
	<li>Voss, S., Skerra, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutagenesis+of+a+flexible+loop+in+streptavidin+leads+to+higher+affinity+for+the+Strep-tag+II+peptide+and+improved+performance+in+recombinant+protein+purification.">Mutagenesis of a flexible loop in streptavidin leads to higher affinity for the Strep-tag II peptide and improved performance in recombinant protein purification.</a> Protein Eng. 10 (8), 975-982 (1997).</li><li>Schmidt, T. G., Skerra, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Strep-tag+system+for+one-step+purification+and+high-affinity+detection+or+capturing+of+proteins.">The Strep-tag system for one-step purification and high-affinity detection or capturing of proteins.</a> Nat. Protoc. 2 (6), 1528-1535 (2007).</li><li>Junttila, M. R., Saarinen, S., Schmidt, T., Kast, J., Westermarck, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-step+Strep-tag+purification+for+the+isolation+and+identification+of+protein+complexes+from+mammalian+cells.">Single-step Strep-tag purification for the isolation and identification of protein complexes from mammalian cells.</a> Proteomics. 5 (5), 1199-1203 (2005).</li><li>Hafren, A., Hofius, D., Ronnholm, G., Sonnewald, U., Makinen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HSP70+and+its+cochaperone+CPIP+promote+potyvirus+infection+in+Nicotiana+benthamiana+by+regulating+viral+coat+protein+functions.">HSP70 and its cochaperone CPIP promote potyvirus infection in Nicotiana benthamiana by regulating viral coat protein functions.</a> Plant Cell. 22 (2), 523-535 (2010).</li><li>Jaskiewicz, M., Peterhansel, C., Conrath, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+histone+modifications+in+plant+leaves.">Detection of histone modifications in plant leaves.</a> J. Vis. Exp. (55), (2011).</li><li>Witte, C. P., Noel, L. D., Gielbert, J., Parker, J. E., Romeis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+one-step+protein+purification+from+plant+material+using+the+eight-amino+acid+StrepII+epitope.">Rapid one-step protein purification from plant material using the eight-amino acid StrepII epitope.</a> Plant Mol. Biol. 55 (1), 135-147 (2004).</li><li>Werner, A. K., Sparkes, I. A., Romeis, T., Witte, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification,+biochemical+characterization,+and+subcellular+localization+of+allantoate+amidohydrolases+from+Arabidopsis+and+soybean.">Identification, biochemical characterization, and subcellular localization of allantoate amidohydrolases from Arabidopsis and soybean.</a> Plant Physiol. 146 (2), 418-430 (2008).</li><li>Panwar, P., Deniaud, A., Pebay-Peyroula, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contamination+from+an+affinity+column:+an+encounter+with+a+new+villain+in+the+world+of+membrane-protein+crystallization.">Contamination from an affinity column: an encounter with a new villain in the world of membrane-protein crystallization.</a> Acta Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 68 (10), 1272-1277 (2012).</li><li>Hendrickson, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+core+streptavidin+determined+from+multiwavelength+anomalous+diffraction+of+synchrotron+radiation.">Crystal structure of core streptavidin determined from multiwavelength anomalous diffraction of synchrotron radiation.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 86 (7), 2190-2194 (1989).</li><li>Bernot, K. M., Lee, C. H., Coulombe, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+small+surface+hydrophobic+stripe+in+the+coiled-coil+domain+of+type+I+keratins+mediates+tetramer+stability.">A small surface hydrophobic stripe in the coiled-coil domain of type I keratins mediates tetramer stability.</a> J. Cell Biol. 168 (6), 965-974 (2005).</li><li>Singh, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solution+structure+of+human+von+Willebrand+factor+studied+using+small+angle+neutron+scattering.">Solution structure of human von Willebrand factor studied using small angle neutron scattering.</a> J. Biol. Chem. 281 (50), 38266-38275 (2006).</li><li>Weldon, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+immunogenicity+of+stabilized+trimeric+soluble+influenza+hemagglutinin.">Enhanced immunogenicity of stabilized trimeric soluble influenza hemagglutinin.</a> PLoS One. 5 (9), (2010).</li><li>Wang, W., Barger, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Roles+of+quaternary+structure+and+cysteine+residues+in+the+activity+of+human+serine+racemase.">Roles of quaternary structure and cysteine residues in the activity of human serine racemase.</a> BMC Biochem. 12, 63 (2011).</li><li>Rappsilber, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+beginning+of+a+beautiful+friendship:+cross-linking/mass+spectrometry+and+modelling+of+proteins+and+multi-protein+complexes.">The beginning of a beautiful friendship: cross-linking/mass spectrometry and modelling of proteins and multi-protein complexes.</a> J. Struct. Biol. 173 (3), 530-540 (2011).</li><li>Sousa, M. M., Steen, K. W., Hagen, L., Slupphaug, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody+cross-linking+and+target+elution+protocols+used+for+immunoprecipitation+significantly+modulate+signal-to+noise+ratio+in+downstream+2D-PAGE+analysis.">Antibody cross-linking and target elution protocols used for immunoprecipitation significantly modulate signal-to noise ratio in downstream 2D-PAGE analysis.</a> Proteome Sci. 9, 45 (2011).</li></ol>

Yukarıdaki protokol biotin ya da güçlü denşirme içermeyen, herhangi bir uygun tampon maddesi içinde ilgi ve ilgili kompleksleri herhangi bir çift-Strep-etiketli yem proteini saflaştırmak için kullanılabilir. Protokol geçerli sürümünde, bağlanma ve yıkama, yüksek tuz ve iyonik olmayan deterjanın varlığında, nispeten sert koşullar altında gerçekleştirilir. Bu, daha az arka sonuçlanır, ancak kırılgan protein kompleksleri, bu koşullar altında ayırmak olabilir. Örneğin düşük afinite kom...

Son yıllarda, Strep-etiket teknolojisi proteomik ve yapısal biyoloji dahil olmak üzere biyomedikal araştırmanın birçok alanda yaygın olarak kullanılır hale gelmiştir. Kısa bir Strep-eklentisi peptide rekombinant proteinlerin füzyon dayanır Bu protein saflaştırma tekniği, Strep-taktin, geliştirilmiş peptid-bağlama kapasiteli streptavidin bir varyantını taşıyan genetik olarak benzer matrislere gelişine olgunlaşmıştır. 1, 2 çift-Strep-eklentisi veya SIII-eklentisi, sergi rekombinant proteinlerin daha etkili bir temizlik sağlanması, sadece tek bir Strep-etiketi ihtiva eden daha Strep-taktin matrisler için daha yüksek bir afinite ve belirlenmiş Strep-etiketi II iki kopyasını ihtiva eden füzyon proteinleri ilişkili bağlama ortakları. Bununla birlikte, Strep-taktin için çift-Strep-etiketli proteinlerinin daha yüksek afinite da yanları vardır. Fazla biotin ile bu tür proteinlerin Rekabetçi elüsyon hedef protein verimi azalmasına yol, eksik olabilir. A mcevher Diğer alternatif SDS ile yıkama, ancak proteomik analizi ile tahlil uyumsuz hale reçineden serbest Strep-taktin ile istenmeyen örnek kirlenmesine yol açar. Bu çalışma, birinci kimyasal çapraz bağlama ile Strep-taktin reçine çiftli tetramer stabilize etme ve daha sonra elde edilen çapraz bağlanmış reçinenin ikinci çift-Strep-etiketli proteinleri ve ilgili kompleksleri elüt edilmesi için SDS kullanarak bu sınırlamanın üstesinden gelmek için bir yöntem sunar. Bu nedenle, yeterli bir protein verimi ve böylece kütle spektrometresi ile daha fazla analiz sağlayan, Strep-taktin numune kirlenme olmadan elde edilebilir. Yöntem, bir yüzey-açık-etiket SIII 3 ya da çift-Strep-etiketi (amino asit sekansı WSHPQFEK (GGGS) sırasıyla 3 ve WSHPQFEK SAWSHPQFEK (GGGS) 2 GGSAWSHPQFEK) ile herhangi bir rekombinant füzyon proteininin saflaştırılması için uygundur. Protein, hayvan, bitki veya bakteri kaynaklı olabilir ve toplam hücre ya da izole edilebilirlizatı veya organel zenginleştirilmiş fraksiyon. Bir örnek olarak, burada PVA ile enfekte edilmiş Nicotiana benthamiana bitkilerinin nükleer fraksiyondan Potato Virüs A (PVA) 4 bir SIII etiketli protein VPg-Pro saflaştırılmasını anlatmaktadır. Daha önce, aşağıdaki modifikasyonlar ile, tarif edildiği gibi, 5 nükleer fraksiyon izole edilmiştir: hücre formaldehit ile tedavi edildi, sodyum bütirat 5 mM sodyum fluorür Tüm tamponlar içinde ikame edilmiş, tam proteaz inhibitör PMSF ile ikame edilmiş, ekstre içinde Triton X-100 konsantrasyonu tampon # 2% 0.3 &#39;e düşürülmüştür (v / v) ve (ekstraksiyon tampon # 3) sakroz yastığı içinden santrifüjleme ile elde edilen nükleer pelet önceden soğutulmuş bağlanma tamponu içinde 1.45 ml içinde yeniden süspansiye edildi ve 4 ° C&#39; de 1.5 saat boyunca döndürülür SIII-etiketli yem protein ve ilişkili kompleksler (yem protein örneği) ihtiva eden ortaya çıkan çekirdek ekstraktı, (bakınız bölüm 2), aşağıda tarif edilen protokole göre işlenmiştir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="606">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bis(sulfosuccinimidyl) suberate (BS3), No-Weigh format, 8 x 2mg</td>
			<td>Pierce/Thermo Scientific</td>
			<td>21585</td>
			<td><a href="http://www.fishersci.com">www.fishersci.com CAUTION: Hazardous substance. Causes serious respiratory, skin and eye irritation. Wear protective gloves and eye protection.</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Strep-Tactin MacroPrep resin (50% suspension)</td>
			<td>IBA</td>
			<td>2-1505</td>
			<td><a href="http://www.iba-lifesciences.com/">www.iba-lifesciences.com</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spin-X centrifuge tube filter, cellulose acetate membrane, pore size 0.45 &#956;m, non-sterile</td>
			<td>Costar (Corning)</td>
			<td>8163</td>
			<td><a href="http://www.corning.com/lifesciences/">www.corning.com/lifesciences/</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dolphin-nose tubes</td>
			<td>Costar (Corning)</td>
			<td>3213</td>
			<td><a href="http://www.corning.com/lifesciences/">www.corning.com/lifesciences/</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Avidin&#160;</td>
			<td>IBA</td>
			<td>2-0204</td>
			<td><a href="http://www.iba-lifesciences.com/">www.iba-lifesciences.com</a></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

one-step purification of twin-strep-tagged proteins and their complexes on strep-tactin resin cross-linked with bis(sulfosuccinimidyl) suberate (bs3)

Işlenmiş bir streptavidin (Strep-taktin) taşıyan reçineleri Strep-etiketli füzyon proteinlerinin afinite saflaştırılması, fizyolojik koşullar altında, protein kompleksleri izolasyonu için yaygın olarak kullanılan bir yöntem haline gelmiştir. Çift-Strep-etiket ya da SIII-etiketi belirlenmiş Strep-etiketi II iki kopyasını ihtiva eden füzyon proteinleri, böylece daha etkili bir protein arıtma sağlayan, tek bir Strep-etiketi ihtiva eden kıyasla Strep-taktin için daha yüksek afinite avantajına sahiptir. Ancak bu avantaj biyotin ile çift-Strep ile işaretlenmiş olan proteinlerin elüsyon düşük protein geri kazanımı yol açan, eksik olabilir gerçeği ile dengelenir. Kurtarma önemli ölçüde sodyum dodesil sülfat (SDS) ile denatüre elüsyonu kullanılarak geliştirilebilir, ancak bu alt-proteomik analizi ile tahlil uyumsuz hale reçineden serbest Strep-taktin bulaşmasını örnek yol açar. Bu sınırlamayı aşmak için, bir yöntem Strep-taktin bu sayede, reçine-birleştiğinde tetramerdir geliştirdikilk kovalent Bis (sülfosuksinimidil) suberat (BS3) ile çapraz bağlama ile elde edilen çapraz bağlanmış Reçine daha sonra, bir tek partili saflaştırma adımında, hedef protein komplekslerinin saflaştırılması için kullanılan ile stabilize edilir. Strep-taktin kontamine olmaması kütle spektrometresi ile aşağı protein analizine olanak verirken SDS verimli yıkama, iyi bir protein iyileşme sağlar. Kavramının bir kanıtı olarak, virüs bulaşmış N. çekirdeklerden VPg-Pro SIII-etiketli viral proteinin saflaştırılması için burada bir protokol açıklar BS3 ile çapraz bağlanmış Strep-taktin polimetakrilat reçine kullanılarak benthamiana bitkileri. Aynı protokol, ilgi duyulan herhangi bir çift-Strep-etiketli proteinin saflaştırılması ve bunun fizyolojik bağlanma ortakları karakterize etmek için kullanılabilir.

Saflaştırma prosedürü, şematik olarak bir arada var olan diğer saflaştırma yöntemleri ile bağlantılı sorunların bir temsili, Şekil 1 &#39;de gösterilmiştir. <img alt="Şekil 1" fo:content-width="5.5in" src="/files/ftp_upload/51536/51536fig1highres.jpg" width="650" /> Şekil 1. Saflaştırma prosedürü şematik temsili. Akışı kovalent çapraz bağlı reçine için çift-Strep-etiketli yem protein ...

Watch this Scientific Journal Video about One-step Purification of Twin-Strep-tagged Proteins and Their Complexes on Strep-Tactin Resin Cross-linked With Bissulfosuccinimidyl Suberate BS3 at JoVE.com

One-step Purification of Twin-Strep-tagged Proteins and Their Complexes on Strep-Tactin Resin Cross-linked With Bissulfosuccinimidyl Suberate BS3

Tek aşamalı Strep-taktin Reçine Bis (sülfosuksinimidil) ile çapraz bağlanmış suberat (BS3) hakkında Çift Strep-etiketli proteinler ve komplekslerinin saflaştırılması

Bir yöntem olup (Strep-taktin) reçinesi kovalent Bis (sülfosuksinimidil) suberat (BS3) ile çapraz bağlanmış, modifiye edilmiş streptavidin ile ilgili çift-Strep-etiketli füzyon proteinleri ve bunların özel komplekslerinin etkin arıtma için açıklanmıştır. Bir yöntem hızlı hızlı, iyi bir hedef protein geri kazanımı ve yüksek saflıkta avantajları vardır ve kütle spektrometresi ile bir sonraki analiz ile uyumludur.

Affinity purification of Strep-tagged fusion proteins on resins carrying an engineered streptavidin (Strep-Tactin) has become a widely used method for ...

Research

JoVE Journal

Biology

One-step Purification of Twin-Strep-tagged Proteins and Their Complexes on Strep-Tactin Resin Cross-linked With Bis(sulfosuccinimidyl) Suberate (BS3)

Purification and Visualization of Influenza A Viral Ribonucleoprotein Complexes

İnfluenza A Viral ribonükleoprotein Kompleksleri saflaştırılması ve Görselleştirme

The influenza A viral genome consists of eight negative-sense, single stranded RNA molecules, individually packed with multiple copies of the influenza A ...

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

Organik Solvent ve Asetik Asit olmadan Jeller Coomassie G-250 ile Proteinlerin Boyama

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Genetic Studies of Human DNA Repair Proteins Using Yeast as a Model System 

İnsan DNA Onarım Proteinler Genetik Araştırmalar Maya Model Sistemi olarak kullanma

Understanding the roles of human DNA repair proteins in genetic pathways is a formidable challenge to many researchers.  Genetic studies in mammalian ...

One-step Metabolomics: Carbohydrates, Organic and Amino Acids Quantified in a Single Procedure

Bir adım metabolomik: Karbonhidratlar, Tek Bir Usul Sayısallaştırılmış Organik ve Amino Asitler

Every infant born in the US is now screened for up to 42 rare genetic disorders called "inborn errors of metabolism". The screening method is based on ...

Preparation, Purification, and Characterization of Lanthanide Complexes for Use as Contrast Agents for Magnetic Resonance Imaging

Manyetik Rezonans Görüntüleme için hazırlanması, Saflaştırılması ve lantanide Kompleksleri Kontrast Ajanlar Kullanım Karakterizasyonu

Polyaminopolycarboxylate-based ligands are commonly used to chelate lanthanide ions, and the resulting complexes are 
useful as contrast agents for ...

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Protein Kompleksi belirlenmesi<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Tandem Kütle Spektrometresi ile Kombine Sıralı Peptid Affinity Arıtma kullanarak

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the ...

Formulations for Freeze-drying of Bacteria and Their Influence on Cell Survival

Hücre Survival üzerinde Bakteriler ve Etki Dondurma-kurutma için formülasyonlar

Cellular water can be removed to reversibly inactivate microorganisms to facilitate storage. One such method of removal is freeze-drying, which is ...

High-throughput Purification of Affinity-tagged Recombinant Proteins

Affinity etiketli Rekombinant Proteinler Yüksek throughput Arıtma

X-ray crystallography is the method of choice for obtaining a detailed view of the structure of proteins. Such studies need to be complemented by further ...

Purification of Transcripts and Metabolites from Drosophila Heads

Purification of Transcripts and Metabolites from Drosophila Heads

Transkript ve Metabolitler gelen saflaştırılması<em&gt; Drosophila</em&gt; Kafaları

For the last decade, we have tried to understand the molecular and cellular mechanisms of neuronal degeneration using Drosophila as a model organism. ...

Non-chromatographic Purification of Recombinant Elastin-like Polypeptides and their Fusions with Peptides and Proteins from Escherichia coli

Non-chromatographic Purification of Recombinant Elastin-like Polypeptides and their Fusions with Peptides and Proteins from Escherichia coli

Peptidler ve proteinler ile rekombinant Elastin gibi Polipeptitlerin ve Fusions olmayan kromatografik saflaştırma<em&gt; Escherichia coli</em

Elastin-like polypeptides are repetitive biopolymers that exhibit a lower critical solution temperature phase transition behavior, existing as soluble ...