Name: nanomanipulation of single rna molecules by optical tweezers
Uploaded: 2014-08-20T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Nanomanipulation of Single RNA Molecules by Optical Tweezers at JoVE.com

This work was supported by an NSF grant (MCB-1054449) and a collaborative interdisciplinary Pilot Research Program award from The RNA Institute at University at Albany to PTXL.

1 Получение РНК молекул для выщипывания отдельных молекул <ol><li> Клонирование последовательность интерес. Клонирование ДНК-последовательность, соответствующую структуре РНК в вектор. </li><li> Синтез и очистка шаблона транскрипции. Синтезировать шаблон транскрипции с помощью ПЦР. [Табли?...

<html> Модификация и устранение неисправностей в подготовке выщипывания Образцы Выбор вектора клонирования. Хотя общая схема описано здесь (фиг.3) не требует специального клонирующий вектор, вектор предпочтительно не имеют внутреннюю Т7 или Т3 промо?...

Развитие оптического пинцета техники уже давно сопровождается ее применения в биологических исследованиях. Когда оптический эффект захвата был впервые обнаружен, Артур Ashkin заметил, что бактерии в загрязненной воде может оказаться в ловушке в фокусе лазера 1. С тех пор, бактерии пленения стала непреднамеренным, забавный эксперимент для поколений студентов биофизики, а также серьезный инструмент исследования для изучения микробного физиологию 2,3. Техника оптического захвата использует сфокусированный лазерный луч, чтобы обездвижить микроскопический объект 1. Практически, лазерной ловушки функционирует как оптического источника, который также измеряет силу (F) на захваченного объекта путем его перемещения от центра ловушки (АХ). В течение короткого диапазона, F = κ х АХ, в κ постоянная пружины из ловушки. Оптическая ловушка может быть использован, чтобы оказывать усилие в picoNewton (PN) точностью до микроскопииОбъект Copic и измерить его положение с нанометровой (нм) точности. В последние два десятилетия, оптический пинцет стали одним из наиболее часто используемых методов одиночных молекул в биофизике. Техника использовалась для изучения складывания и механику ДНК 4-6, РНК 7-9, и белков 10,11. Оптический пинцет также использовались для наблюдения репликации ДНК 12, транскрипции РНК 13, и синтез белка 14,15, а также многие другие биомолекулярные события 16-18. Одиночных молекул подходы используются в РНК структурных исследований главным образом для изучения прочный складной энергетический ландшафт РНК. Последовательность РНК, как правило, раз в несколько стабильных, взаимоисключающих структур, в связи с простых химического состава и база Paring правил РНК. Давно известно, что РНК структурный полиморфизм, как, например, происходит в riboswitches 19,20, играет важную роль в регуляции генов. Recenт генома опрос показал, что колебания температуры как малые, как на несколько градусов существенно повлиять структуры и синтез белка в значительной части клеточного транскриптома 21. Этот пример подсказывает, что биологическая роль альтернативного РНК складывания, пожалуй, более важным и распространенным, чем предполагалось ранее. Структурная полиморфизм, однако, представляет собой вызов для традиционных биохимических и биофизических подходов, которые рассматривают средние свойства многих молекул. Например, &quot;на&quot; и &quot;выключено&quot; конформации riboswitch являются взаимоисключающими. Среднем структура получена из гетерогенных структур, вероятно, не похожи на любой из биологически соответствующих конформеров. Кроме того, нетранслируемая РНК и мРНК обычно образуют структуры. Их взаимодействие с белками и регулирующих РНК обычно требуется раскрытие существующей структуры в рамках взаимодействия. Поэтому, изучая РНК разворачивается / повторной укладки становится уместенВопрос РНК биологии. Для удовлетворения такой вызов, подход одиночных молекул был использован, чтобы разгадать РНК структурный полиморфизм, изучая одну молекулу в то время 22-27. По сравнению с популярным методом флуоресцентной одиночных молекул, пинцет, основанные механическая разворачивается предлагает преимущество, что конформации отдельных молекул можно управлять с помощью приложенной силы и быть измерена с нанометровой точностью. Эта возможность наноманипулирование могут быть использованы для мониторинга разворачивается / складной отдельных структурных доменов таким образом, что иерархическое складывание большого РНК можно разрезать 28. Кроме того, одной нити могут быть направлены на сгиб в одном из нескольких конформеров; или Существующая структура может быть механически индуцированной чтобы повторно сворачивают в другую конформацию 29. В биологических условиях, структура РНК может быть изменен на изменение температуры или связывание лиганда. Возможность непосредственного использования молекулярных стуру открывает новую площадку РНК структурной исследования. В принципе, другие механические методы, такие как атомного микроскопа силы и магнитных пинцетов, также может быть использован для изучения складывания отдельных молекул РНК. Тем не менее, такие приложения ограничиваются в основном за счет относительно низкой пространственной разрешающей 30. Применение оптического пинцета позволяет РНК структуры, чтобы быть развернута по механической силы. Преимущество механической разворачивается в несколько раз. Сила может быть использован, чтобы развернуть как вторичные и третичные структуры, тогда как металлические ионы и лигандом индуцированного складывающиеся в основном ограничивается третичных структур. Температура и денатуранта могут существенно влиять на деятельность воды и растворенных веществ. В отличие от этого, сила прикладывается локально, чтобы возмущать молекулярных структур; Эффект силы на окружающую среду можно пренебречь. Кроме того, тепловое плавления лучше всего использовать для изучения сворачивания термодинамики малых структур РНК,в то время как оптический пинцет были использованы для изучения РНК структуры с различными размерами в диапазоне от семи пар оснований tetraloop шпильки 28 до 400 нуклеотидов рибозима 31. Кроме того, РНК структуры могут быть механически развернулась в мезофильных температурах. В отличие от этого, разворачиваться РНК в эксперименте теплового плавления, температура, как правило, поднят значительно выше физиологических температурах, что существенно увеличивает гидролиз РНК, особенно в присутствии ионов Mg2 +. Важно отметить, что механическое действие силы зависит от того, как оно применяется к структуре. Приложенная сила наклоняет складной энергетический ландшафт. Например, когда сила приложена к шпильке, что пар оснований последовательно разбиты, по одному за раз (фиг.1а). Копирования вилки прогрессирует по винтовой оси, перпендикулярной к приложенной силе. В отличие от этого, когда минимальное поцелуи комплекс находится под натяжением, два целоватьсяпар оснований, которые параллельны приложенной силы, распределить нагрузку силы (1б). Различные геометрии шпильке и целуя комплекса по отношению к приложенной силы в результате их различных механических ответ, который может быть использован, чтобы отличить вторичную и третичную складывание 28,32. Теоретико аспект механической разворачивается ранее отзывы 8,9,30. Эта работа излагаются основные подходы по созданию и выполнить один-молекулы механическую разворачивается анализа. Экспериментальная установка. В нашей механической потянув эксперимента, РНК образец для выщипывания состоит из РНК интереса в окружении двух двухцепочечными ручками ДНК / РНК (рисунок 2) 7. Вся молекула может быть привязан к двум бисером микронного размера поверхностных покрытием (SPHEROTECH) через стрептавидин- биотина и дигоксигенином анти-дигоксигенин антител взаимодействий, соответственно. Один шарик удерживается измерения усилия оптической трап, в то время как другой проводится на кончике микропипеткой. Относительное расстояние между шариков может быть изменено либо рулевой ловушку или перемещение микропипетки. Используя этот подход, одна молекула РНК привязывать шарики могут быть растянуты и расслаблены. Получение образцов. Синтез образцов РНК для выщипывания включает несколько шагов (рисунок 3). Сначала ДНК-последовательность, соответствующую РНК интереса сначала клонировали в плазмидный вектор. Далее, три ПЦР-реакции выполняются генерировать две ручки и шаблон для транскрипции. Шаблон транскрипции охватывает ручки регионы и вставленные последовательности. Полная длина РНК синтезировали с помощью транскрипции в пробирке. Последние, РНК и химически модифицированные ручки отжигают вместе, чтобы сформировать молекулы для выщипывания. Калибровка и эксплуатация Пинцет. Базовая конструкция использованием Minitweezersд в этой работе следует, что из двойного пучка оптического пинцета 33. Со многими улучшения, Minitweezers отображения чрезвычайной устойчивостью по сравнению с оптического пинцета первого поколения. Ряд научно-исследовательских групп в ряде стран использовать Minitweezers в своих исследованиях одиночных молекул 14,15,34-37. Детали конструкции, калибровки и работы устройства, в том числе инструкции видео, доступны на веб-сайте &quot;Пинцет Lab&quot; (http://tweezerslab.unipr.it). Здесь, улучшения и процедуры калибровки, которые должны быть выполнены на ежедневной основе, описаны в деталях.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="745">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;width:249px;">Minitweezers</td>
			<td style="width:211px;">Steven B. Smith Engineering</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"><a href="http://tweezerslab.unipr.it/">http://tweezerslab.unipr.it</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">Data acquisition card</td>
			<td style="width:211px;">National Instruments</td>
			<td style="width:119px;">USB-6351</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">Video card</td>
			<td style="width:211px;">National Instruments</td>
			<td style="width:119px;">PCI-1407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">Labview programming software</td>
			<td style="width:211px;">National Instruments</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">NI Vision Builder</td>
			<td style="width:211px;">National Instruments</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">Laser engraver</td>
			<td style="width:211px;">Epilogue laser systems</td>
			<td style="width:119px;">Zing-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;"></td>
			<td style="width:211px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">PCR purification kit</td>
			<td style="width:211px;">Qiagen</td>
			<td style="width:119px;">28104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;width:249px;">MEGAscript T7 kit</td>
			<td style="width:211px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">AM1334</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">MEGAclear kit</td>
			<td style="width:211px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">AM1908</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">Biotin-11-UTP</td>
			<td style="width:211px;">Thermo Fisher</td>
			<td>FERR0081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">T4 DNA polymerase</td>
			<td style="width:211px;">New England Labs</td>
			<td style="width:119px;">M0203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;width:249px;">Streptavidin coated microsphere</td>
			<td style="width:211px;">Spherotech</td>
			<td style="width:119px;">SVP-20-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">Antidigoxigenin coated microsphere</td>
			<td style="width:211px;">Spherotech</td>
			<td style="width:119px;">DIGP-20-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">Size standard microspheres</td>
			<td style="width:211px;">Spherotech</td>
			<td style="width:119px;">PPS-6K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">Kapton tape</td>
			<td style="width:211px;">Kaptontape.com</td>
			<td>KPPTDE-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">No. 2 cover glass</td>
			<td style="width:211px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">12-543D</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

nanomanipulation of single rna molecules by optical tweezers

Большая часть человеческого генома транскрибируется, но не переведены. В этом почтовом геномной эры, регуляторные функции РНК, как было показано, чтобы быть более важным. В функции РНК часто зависит от его способности принимать альтернативные структуры, трудно предсказать РНК трехмерные структуры непосредственно из последовательности. Одиночных молекул подходы показывают потенциал для решения проблемы РНК структурной полиморфизма путем мониторинга молекулярных структур одну молекулу в то время. Эта работа представляет собой метод, чтобы точно управлять складывание и структуру отдельных молекул РНК с использованием оптических пинцет. Во-первых, методы синтеза молекулы, пригодные для одиночных молекул механическую работу описаны. Обсуждаются Следующая, различные процедуры калибровки для обеспечения надлежащей работы оптического пинцета. Далее, различные эксперименты объясняются. Чтобы продемонстрировать полезность техники, результаты механически разворачивающихся РНК шпильки и одна РНК целуемсяг комплекс используются в качестве доказательств. В этих примерах, техника наноманипулирование был использован для изучения складывания каждого структурного домена, в том числе вторичные и третичные, независимо. Наконец, обсуждаются ограничения и будущие применения метода.

Ограничено пространства, наноманипулирование одиночных молекул РНК демонстрируется, показав только механические, разворачивающиеся примеры РНК шпильки и РНК с третичной структуры. Манипулирование Одноместный шпилька Molecules После троса устана...

Watch this Scientific Journal Video about Nanomanipulation of Single RNA Molecules by Optical Tweezers at JoVE.com

Nanomanipulation of Single RNA Molecules by Optical Tweezers

Optical tweezers have been used to study RNA folding by stretching individual molecules from their 5&#8217; and 3&#8217; ends. Here common procedures are described to synthesize RNA molecules for tweezing, calibration of the instrument, and methods to manipulate single molecules.

Наноманипулирование Единого РНК молекул на оптический пинцет

A large portion of the human genome is transcribed but not translated. In this post genomic era, regulatory functions of RNA have been shown to be ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Stretching Short Sequences of DNA with Constant Force Axial Optical Tweezers

Растяжение коротких последовательностей ДНК с постоянной силой осевой оптический пинцет

Single-molecule techniques for stretching DNA of contour lengths  less than a kilobase are fraught with experimental difficulties. However, many ...

Multiplexed Single-molecule Force Proteolysis Measurements Using Magnetic Tweezers

Мультиплексный одиночных молекул группы Протеолиз измерений с использованием магнитных пинцет

The  generation and detection of mechanical forces is a ubiquitous aspect of cell physiology,  with direct relevance to cancer metastasis1, atherogenesis2 ...

In vitro Synthesis of Native, Fibrous Long Spacing and Segmental Long Spacing Collagen

In vitro Synthesis of Native, Fibrous Long Spacing and Segmental Long Spacing Collagen

В пробирке Синтез Родные, волокнистых длинные интервалы и Сегментные Длинные Коллаген Расстояние

Collagen fibrils are present in the  extracellular matrix of animal tissue to provide structural scaffolding and  mechanical strength. These native ...

Optical Detection of E. coli Bacteria by Mesoporous Silicon Biosensors

Optical Detection of E. coli Bacteria by Mesoporous Silicon Biosensors

Оптический Обнаружение<em&gt; Е. палочка</em&gt; Бактерии по Мезопористые Silicon биосенсоров

A label-free optical biosensor based on a nanostructured porous Si is designed for rapid capture and detection of Escherichia coli K12 bacteria, as a ...

Use of Label-free Optical Biosensors to Detect Modulation of Potassium Channels by G-protein Coupled Receptors

Использование этикеток без оптические биосенсоры для обнаружения модуляции калиевых каналов на G-белком рецепторов

Ion channels control the electrical properties of neurons and other excitable cell types by selectively allowing ions to flow through the plasma ...

Magnetic Tweezers for the Measurement of Twist and Torque

Магнитные Пинцет для измерения Twist и крутящий момент

Single-molecule techniques make it possible to investigate the behavior of individual biological molecules in solution in real time. These techniques ...

Fluorescence Biomembrane Force Probe: Concurrent Quantitation of Receptor-ligand Kinetics and Binding-induced Intracellular Signaling on a Single Cell

Флуоресценции зонда биомембрана Сила: Параллельное Количественное рецептор-лиганд кинетики и привязка вызванной внутриклеточной сигнализации на одну ячейку

Membrane receptor-ligand interactions mediate many cellular functions. Binding kinetics and downstream signaling triggered by these molecular interactions ...

Delivery of Proteins, Peptides or Cell-impermeable Small Molecules into Live Cells by Incubation with the Endosomolytic Reagent dfTAT

Доставка белки, пептиды или сотовых непроницаемый малых молекул в живых клетках при инкубации с эндосомолитического реагента dfTAT

Macromolecular delivery strategies typically utilize the endocytic pathway as a route of cellular entry. However, endosomal entrapment severely limits the ...

Label-free Single Molecule Detection Using Microtoroid Optical Resonators

Этикетка без одной молекулы обнаружения, используя Microtoroid оптических резонаторов

Detecting small concentrations of molecules down to the single molecule limit has impact on areas such as early detection of disease, and fundamental ...

Optical Control of Living Cells Electrical Activity by Conjugated Polymers

Оптический контроль живых клеток электрической активности по сопряженных полимеров

Hybrid interfaces between organic semiconductors and living tissues represent a new tool for in-vitro and in-vivo applications. In particular, conjugated ...