Name: linear amplification mediated pcr &#8211; localization of genetic elements and characterization of unknown flanking dna
Uploaded: 2014-06-25T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Linear Amplification Mediated PCR Ã¢â‚¬â€œ Localization of Genetic Elements and Characterization of Unknown Flanking DNA at JoVE.com

Funding was provided by the Deutsche Forschungsgemeinschaft (SPP1230, grant of the Tumor Center Heidelberg/Mannheim), by the Bundesministerium f&#252;r Bildung und Forschung (iGene), by the VIth + VIIth Framework Programs of the European Commission (CONSERT, CLINIGENE and PERSIST). We thank Ina Kutschera for demonstrating the protocol technique in the video.

1. إعداد رابط كاسيت (LC) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مزيج 40 ميكرولتر من LC1 قليل النوكليوتيد (الجدول 1)، و 40 ميكرولتر من LC2 قليل النوكليوتيد (الجدول 1، مع تقييد انزيم عبء السليم)، و 110 ميكرولتر تريس، حمض الهيدروكلوريك (100 ملم، ودرجة الح...

<ol>
	<li>Schmidt, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+and+direct+genomic+sequencing+of+multiple+rare+unknown+flanking+DNA+in+highly+complex+samples.">Detection and direct genomic sequencing of multiple rare unknown flanking DNA in highly complex samples.</a> Hum Gene Ther. 12, 743-749 (2001).</li><li>Schmidt, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+insertion-site+analysis+by+linear+amplification-mediated+PCR+(LAM-PCR).">High-resolution insertion-site analysis by linear amplification-mediated PCR (LAM-PCR).</a> Nat Methods. 4, 1051-1057 (2007).</li><li>Schroeder, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+integration+in+the+human+genome+favors+active+genes+and+local+hotspots.">HIV-1 integration in the human genome favors active genes and local hotspots.</a> Cell. 110, 521-529 (2002).</li><li>Wu, X., Li, Y., Crise, B., Burgess, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+start+regions+in+the+human+genome+are+favored+targets+for+MLV+integration.">Transcription start regions in the human genome are favored targets for MLV integration.</a> Science. 300, 1749-1751 (2003).</li><li>Vigdal, T. J., Kaufman, C. D., Izsvak, Z., Voytas, D. F., Ivics, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Common+physical+properties+of+DNA+affecting+target+site+selection+of+sleeping+beauty+and+other+Tc1/mariner+transposable+elements.">Common physical properties of DNA affecting target site selection of sleeping beauty and other Tc1/mariner transposable elements.</a> J Mol Biol. 323, 441-452 (2002).</li><li>Lewinski, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retroviral+DNA+integration:+viral+and+cellular+determinants+of+target-site+selection.">Retroviral DNA integration: viral and cellular determinants of target-site selection.</a> PLoS Pathog. 2, (2006).</li><li>Mueller, P. R., Wold, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+footprinting+of+a+muscle+specific+enhancer+by+ligation+mediated+PCR.">In vivo footprinting of a muscle specific enhancer by ligation mediated PCR.</a> Science. 246, 780-786 (1989).</li><li>Silver, J., Keerikatte, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+use+of+polymerase+chain+reaction+to+amplify+cellular+DNA+adjacent+to+an+integrated+provirus.">Novel use of polymerase chain reaction to amplify cellular DNA adjacent to an integrated provirus.</a> Journal of virology. 63, 1924-1928 (1989).</li><li>Gabriel, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+genomic+access+to+vector+integration+in+clinical+gene+therapy.">Comprehensive genomic access to vector integration in clinical gene therapy.</a> Nature medicine. 15, 1431-1436 (2009).</li><li>Harkey, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiarm+high-throughput+integration+site+detection:+limitations+of+LAM-PCR+technology+and+optimization+for+clonal+analysis.">Multiarm high-throughput integration site detection: limitations of LAM-PCR technology and optimization for clonal analysis.</a> Stem Cells Dev. 16, 381-392 (2007).</li><li>Wang, G. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+bar+coding+and+pyrosequencing+to+analyze+adverse+events+in+therapeutic+gene+transfer.">DNA bar coding and pyrosequencing to analyze adverse events in therapeutic gene transfer.</a> Nucleic acids research. 36, (2008).</li><li>Paruzynski, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+high-throughput+integrome+analyses+by+nrLAM-PCR+and+next-generation+sequencing.">Genome-wide high-throughput integrome analyses by nrLAM-PCR and next-generation sequencing.</a> Nat. Protocols. 5, 1379-1395 (2010).</li><li>Hacein-Bey-Abina, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insertional+oncogenesis+in+4+patients+after+retrovirus-mediated+gene+therapy+of+SCID-X1.">Insertional oncogenesis in 4 patients after retrovirus-mediated gene therapy of SCID-X1.</a> J Clin Invest. , 3132-3142 (2008).</li><li>Hacein-Bey-Abina, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LMO2-associated+clonal+T+cell+proliferation+in+two+patients+after+gene+therapy+for+SCID-X1.">LMO2-associated clonal T cell proliferation in two patients after gene therapy for SCID-X1.</a> Science. 302, 415-419 (2003).</li><li>Howe, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insertional+mutagenesis+combined+with+acquired+somatic+mutations+causes+leukemogenesis+following+gene+therapy+of+SCID-X1+patients.">Insertional mutagenesis combined with acquired somatic mutations causes leukemogenesis following gene therapy of SCID-X1 patients.</a> J Clin Invest. 118, 3143-3150 (2008).</li><li>Cartier, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoietic+stem+cell+gene+therapy+with+a+lentiviral+vector+in+X-linked+adrenoleukodystrophy.">Hematopoietic stem cell gene therapy with a lentiviral vector in X-linked adrenoleukodystrophy.</a> Science. 326, 818-823 (2009).</li><li>Matrai, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatocyte-targeted+expression+by+integrase-defective+lentiviral+vectors+induces+antigen-specific+tolerance+in+mice+with+low+genotoxic+risk.">Hepatocyte-targeted expression by integrase-defective lentiviral vectors induces antigen-specific tolerance in mice with low genotoxic risk.</a> Hepatology. 53, 1696-1707 (2011).</li><li>Penaud-Budloo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adeno-associated+virus+vector+genomes+persist+as+episomal+chromatin+in+primate+muscle.">Adeno-associated virus vector genomes persist as episomal chromatin in primate muscle.</a> Journal of virology. 82, 7875-7885 (2008).</li><li>Kaeppel, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+largely+random+AAV+integration+profile+after+LPLD+gene+therapy.">A largely random AAV integration profile after LPLD gene therapy.</a> Nature medicine. 19, 889-891 (2013).</li><li>Voigt, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retargeting+sleeping+beauty+transposon+insertions+by+engineered+zinc+finger+DNA-binding+domains.">Retargeting sleeping beauty transposon insertions by engineered zinc finger DNA-binding domains.</a> Mol Ther. 20, 1852-1862 (2012).</li><li>Yanez-Munoz, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effective+gene+therapy+with+nonintegrating+lentiviral+vectors.">Effective gene therapy with nonintegrating lentiviral vectors.</a> Nature medicine. 12, 348-353 (2006).</li><li>Boztug, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem-Cell+Gene+Therapy+for+the+Wiskott-Aldrich+Syndrome.">Stem-Cell Gene Therapy for the Wiskott-Aldrich Syndrome.</a> N Engl J Med. 363, 1918-1927 (2010).</li><li>Deichmann, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vector+integration+is+nonrandom+and+clustered+and+influences+the+fate+of+lymphopoiesis+in+SCID-X1+gene+therapy.">Vector integration is nonrandom and clustered and influences the fate of lymphopoiesis in SCID-X1 gene therapy.</a> J Clin Invest. 117, 2225-2232 (2007).</li><li>Schwarzwaelder, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gammaretrovirus-mediated+correction+of+SCID-X1+is+associated+with+skewed+vector+integration+site+distribution+in+vivo.">Gammaretrovirus-mediated correction of SCID-X1 is associated with skewed vector integration site distribution in vivo.</a> J Clin Invest. 117, 2241-2249 (2007).</li><li>Gabriel, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+unbiased+genome-wide+analysis+of+zinc-finger+nuclease+specificity.">An unbiased genome-wide analysis of zinc-finger nuclease specificity.</a> Nat Biotechnol. 29, 816-823 (2011).</li><li>Dieter, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+types+of+tumor-initiating+cells+form+human+colon+cancer+tumors+and+metastases.">Distinct types of tumor-initiating cells form human colon cancer tumors and metastases.</a> Cell Stem Cell. 9, 357-365 (2011).</li><li>Montini, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoietic+stem+cell+gene+transfer+in+a+tumor-prone+mouse+model+uncovers+low+genotoxicity+of+lentiviral+vector+integration.">Hematopoietic stem cell gene transfer in a tumor-prone mouse model uncovers low genotoxicity of lentiviral vector integration.</a> Nature biotechnology. 24, 687-696 (2006).</li><li>Zavidij, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+long-term+blood+formation+by+stem+cells+in+murine+steady-state+hematopoiesis.">Stable long-term blood formation by stem cells in murine steady-state hematopoiesis.</a> Stem Cells. 30, 1961-1970 (2012).</li><li>Martins, V. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thymus-autonomous+T+cell+development+in+the+absence+of+progenitor+import.">Thymus-autonomous T cell development in the absence of progenitor import.</a> J Exp Med. 209, 1409-1417 (2012).</li><li>Arens, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioinformatic+clonality+analysis+of+next-generation+sequencing-derived+viral+vector+integration+sites.">Bioinformatic clonality analysis of next-generation sequencing-derived viral vector integration sites.</a> Hum Gene Ther Methods. 23, 111-118 (2012).</li></ol>

تقنية LAM-PCR يسمح تحديد تسلسل الحمض النووي المجهولة التي تكتنف المنطقة الحمض النووي المعروف. بسبب حساسية عالية الناجمة عن preamplification من تقاطعات مع الاشعال محددة التهجين في تسلسل الحمض النووي المعروف، فمن الممكن لتضخيم وكشف حتى تقاطعات نادرة وصولا الى مستوى خلية واحدة. ?...

الخطي التضخيم بوساطة PCR (LAM-PCR) يسمح تحديد وتوصيف غير معروف الحمض النووي DNA المرافقة مجاورة ليعرف من أي منشأ. وبشكل أكثر تحديدا، تم تطوير LAM-PCR في توطين مواقع التكامل ناقلات فيروسية (IS) في الجينوم المضيف 1،2. العناصر الجينية مثل الفيروسات القهقرية أو ترانسبوزونات دمج الجينوم الخاصة بهم في جينوم المضيف في (شبه) بطريقة عشوائية 3-6. في كثير من الحالات هو حاسمة أن يعرف بالضبط الموقف حيث تتكامل هذه النواقل. وقد ثبت LAM-PCR لتكون متفوقة على التقنيات البديلة مثل بوساطة ربط PCR 7 ومشتقاته أو العكسية PCR 8. حساسية ومتانة هذه الطريقة ينشأ من preamplification الأولي للتقاطعات ناقلات الجينوم واختيار المغناطيسي من المنتجات PCR تضخيمها. مثل الطرق البديلة المذكورة، تعتمد LAM-PCR على استخدام إنزيمات التقييد، وإدخال التحيز في قدرة استرجاع IS 9-11. وبالتالي،ويمكن الكشف عن مجموعة فرعية فقط من مرجع هي (integrome) في رد فعل واحد. يتم التقليل من هذا التحيز من خلال تحليل مواز لعينة معينة باستخدام تركيبات الأمثل للأنزيمات تقييد 9. في الآونة الأخيرة، وهو البديل من التكنولوجيا يطلق عليه غير المقيدة وقد تم تطوير LAM-PCR (nrLAM-PCR) التي تلتف استخدام إنزيمات التقييد ويسمح تحليل الجينوم على نطاق غير منحازة لعينة في رد فعل واحد 9،12. في الماضي، استخدمت LAM-PCR لتحديد فيروس المسبب للمرض هو مما أدى إلى سرطان الدم في عدد قليل من المرضى في التجارب السريرية العلاج الجيني 13-15. منذ ذلك الحين، تم تكييفها LAM-PCR لتحديد IS من ناقلات أخرى دمج (ناقلات lentiviral، ترانسبوزونات) وأيضا لتحديد أنماط التكامل دمج سلبي مثل ناقلات ناقلات الغدة المرتبطة (AAV) أو integrase معيبة ناقلات lentiviral (IDLV) 16 -21. واسعة تنتشر تطبيقات LAM-PCR: التقليديةلاي، ويستخدم على نطاق واسع هذه التقنية لدراسة تكوين نسيلي خلايا الجينات المعدلة في المرضى الذين خضعوا لعلاج الجينات أو لتقييم السلامة الأحيائية أنظمة النواقل رواية كشف السلوك اندماجهم 15،16،22-24. في الآونة الأخيرة، تمكين LAM-PCR تحديد خصوصية وبعيدا عن الهدف من النشاط nucleases مصمم من قبل IDLV محاصرة مقايسة 25. علاوة على ذلك، LAM-PCR يسمح بسهولة لمتابعة مصير الخلايا transduced مع مرور الوقت في كائن حي. وهذا يسمح لتحديد بروتو الجينات المسرطنة وكذلك الورم الجينات القامع وأيضا لدراسة تكون الدم أو سرطان الخلايا الجذعية والبيولوجيا 26-28. أخيرا وليس آخرا، تم تكييفها LAM-PCR لدراسة التنوع مستقبلات خلايا T في الإنسان 29 (وبيانات غير منشورة). ومما يعزز قوة لا يتجزأ من التكنولوجيا من خلال ربط الأسلوب لتقنيات التسلسل العميقة التي تسمح تميز الملايين من المجهول المرافقة الحمض النووي مع واحد النوكليوتيدات صesolution في الجينوم بأكمله. في بروتوكول التالية، ونحن تصف خطوة بخطوة التضخيم وتحديد المرافقة الحمض النووي غير معروف exemplarily لتحديد ناقلات lentiviral IS. يتم سرد أليغنوكليوتيد] المستخدمة في البروتوكول في الجدول 1. المستخلصة الحمض النووي أو كدنا] من أي مصدر يمكن استخدامها كقالب الحمض النووي لLAM-PCR وnrLAM-PCR.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1209">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:203px;">Company</td>
			<td style="width:120px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:527px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">Taq DNA Polymerase</td>
			<td style="width:203px;">Genaxxon Bioscience GmbH</td>
			<td style="width:120px;">M3001.5000</td>
			<td>Alternative Taq Polymerases may be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">PCR Buffer</td>
			<td style="width:203px;">Qiagen</td>
			<td style="width:120px;">201203</td>
			<td>Use of this buffer is recommended</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">dNTP-Mixture</td>
			<td style="width:203px;">Genaxxon Bioscience GmbH</td>
			<td style="width:120px;">M3015.4020</td>
			<td>or any other dNTPs</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">Oligonucleotides (Primers)</td>
			<td style="width:203px;">MWG Biotech</td>
			<td style="width:120px;"></td>
			<td>HPLC purified</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">Dynabeads M-280 Streptavidin&#160;</td>
			<td style="width:203px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:120px;">11206D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">PBS</td>
			<td style="width:203px;">Gibco</td>
			<td style="width:120px;">14190-086</td>
			<td>0.1 % wt/vol BSA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">6M LiCl</td>
			<td style="width:203px;">Roth</td>
			<td style="width:120px;">3739.1</td>
			<td>10 mM Tris-HCl&#160; (pH 7.5)/1 mM EDTA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">Tris-HCl, pH 7.5</td>
			<td style="width:203px;">USB Corporation&#160;</td>
			<td style="width:120px;">22637</td>
			<td>or any other supplier</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">EDTA</td>
			<td style="width:203px;">Applichem</td>
			<td style="width:120px;">A1103,0250</td>
			<td>or any other supplier</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">Klenow Polymerase</td>
			<td style="width:203px;">Roche Diagnostics</td>
			<td style="width:120px;">10104523001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">Hexanucleotide mixture</td>
			<td style="width:203px;">Roche Diagnostics</td>
			<td style="width:120px;">11277081001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">Restriction endonuclease</td>
			<td style="width:203px;">NEB</td>
			<td style="width:120px;"></td>
			<td>or any other supplier</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">Fast-Link DNA ligation kit</td>
			<td style="width:203px;">Epicentre Biotechnologies</td>
			<td style="width:120px;">LK11025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">CircLigase ssDNA Ligase Kit</td>
			<td style="width:203px;">Epicentre Biotechnologies</td>
			<td style="width:120px;">CL4111K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">NaOH</td>
			<td style="width:203px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">72068</td>
			<td>or any other supplier</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">Agarose LE</td>
			<td style="width:203px;">Roche Diagnostics</td>
			<td style="width:120px;">11685660001</td>
			<td>or any other supplier</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">TBE buffer</td>
			<td style="width:203px;">Amresco</td>
			<td style="width:120px;">0658</td>
			<td>or any other supplier</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">Ethidium bromide</td>
			<td style="width:203px;">Applichem</td>
			<td style="width:120px;">A2273,0005</td>
			<td>Ethidium bromide is mutagenic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">100 bp DNA Ladder</td>
			<td style="width:203px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:120px;">15628-050</td>
			<td>or any other DNA ladder</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">20 mM NaCl</td>
			<td style="width:203px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">71393-1L</td>
			<td>or any other supplier</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">Magna-Sep Magnetic Particle Separator&#160;</td>
			<td style="width:203px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:120px;">K158501</td>
			<td>for use with 1.5 ml Tubes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">Magna-Sep Magnetic Particle Separator&#160;</td>
			<td style="width:203px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:120px;">K158696</td>
			<td>for use with 96 well plates</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Amicon Ultra-0.5, Ultracel-30 membrane</td>
			<td style="width:203px;">Millipore</td>
			<td>UFC503096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">PerfectBlue Gelsystem Midi S</td>
			<td style="width:203px;">PeqLab</td>
			<td style="width:120px;">40-1515</td>
			<td>or other electrophoresis system&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">TProfessional 96</td>
			<td style="width:203px;">Biometra</td>
			<td style="width:120px;">050-551</td>
			<td>or other Thermocycler for 96-well plates</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">Orbital shaker KS 260 basic</td>
			<td style="width:203px;">IKA</td>
			<td style="width:120px;">2980200</td>
			<td>or other horizontal shaker</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">PCR softtubes 0.2 ml</td>
			<td style="width:203px;">Biozym Scientific GmbH</td>
			<td style="width:120px;">711082</td>
			<td>or other 0.2 ml PCR tubes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">1.5 ml tubes</td>
			<td style="width:203px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:120px;">12682</td>
			<td>or other 1.5 ml tubes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">Gel documentation system</td>
			<td style="width:203px;">PeqLab</td>
			<td style="width:120px;"></td>
			<td>or any other gel documentation system</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">Nanodrop ND-1000 spectrophotometer</td>
			<td style="width:203px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:120px;">ND-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">Spreadex EL1200 precast gel</td>
			<td style="width:203px;">Elchrom Scientific</td>
			<td style="width:120px;">3497</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:360px;">Submerged gel electrophoresis apparatus SEA 2000&#160;</td>
			<td style="width:203px;">Elchrom Scientific</td>
			<td style="width:120px;">2001E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">2100 Electrophoresis Bioanalyzer</td>
			<td style="width:203px;">Agilent Technologies</td>
			<td>G2939AA</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

linear amplification mediated pcr &#8211; localization of genetic elements and characterization of unknown flanking dna

Linear-amplification mediated PCR (LAM-PCR) has been developed to study hematopoiesis in gene corrected cells of patients treated by gene therapy with integrating vector systems. Due to the stable integration of retroviral vectors, integration sites can be used to study the clonal fate of individual cells and their progeny. LAM- PCR for the first time provided evidence that leukemia in gene therapy treated patients originated from provirus induced overexpression of a neighboring proto-oncogene. The high sensitivity and specificity of LAM-PCR compared to existing methods like inverse PCR and ligation mediated (LM)-PCR is achieved by an initial preamplification step (linear PCR of 100 cycles) using biotinylated vector specific primers which allow subsequent reaction steps to be carried out on solid phase (magnetic beads). LAM-PCR is currently the most sensitive method available to identify&#160;unknown DNA which is located in the proximity of known DNA. Recently, a variant of LAM-PCR has been developed that circumvents restriction digest thus abrogating retrieval bias of integration sites and enables a comprehensive analysis of provirus locations in host genomes. The following protocol explains step-by-step the amplification of both 3&#8217;- and 5&#8217;- sequences adjacent to the integrated lentiviral vector.

النتائج LAM-PCR في التضخيم من ناقلات تقاطعات مع حجم الجينوم جزء المحدد لكل تقاطع. حجم الفردية شظايا PCR يعتمد على المسافة بين موقع الحمض النووي المعروف في الجينوم وأقرب موقع تقييد الاعتراف الانزيم. وهذا يسمح تصور تنوع تقاطعات تضخيم في العينات التي تم تحليلها من قبل الكهر?...

Watch this Scientific Journal Video about Linear Amplification Mediated PCR Ã¢â‚¬â€œ Localization of Genetic Elements and Characterization of Unknown Flanking DNA at JoVE.com

Linear Amplification Mediated PCR ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â‚¬Å“ Localization of Genetic Elements and Characterization of Unknown Flanking DNA

الخطي التضخيم وساطة PCR - توطين العناصر الجينية وتوصيف غير معروف المرافقة الحمض النووي

الخطي التضخيم بوساطة (LAM)-PCR هو طريقة تم تطويرها لتحديد مواقع الدقيق لدمج ناقلات فيروسية في الجينوم. وقد تطورت هذه التقنية لتكون طريقة متفوقة لدراسة ديناميات النسيلي في المرضى العلاج الجيني، والسلامة البيولوجية التكنولوجيات رواية ناقلات، والتنوع تي خلية، ونماذج الخلايا الجذعية السرطانية، الخ

Linear-amplification mediated PCR (LAM-PCR) has been developed to study hematopoiesis in gene corrected cells of patients treated by gene therapy with ...

Research

JoVE Journal

Biology

Linear Amplification Mediated PCR &#8211; Localization of Genetic Elements and Characterization of Unknown Flanking DNA

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo (New Culture)

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo New Culture

طريقة لثقافة الفرخ المبكر فيفو السابقين الأجنة (الثقافة الجديدة)

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Double Whole Mount in situ Hybridization of Early Chick Embryos

الجامعة جبل مزدوجة في الموقع التهجين لافراخ الدجاج في وقت مبكر

Genetic Studies of Human DNA Repair Proteins Using Yeast as a Model System 

الدراسات الجينية البشرية البروتينات إصلاح الحمض النووي باستخدام خميرة كنظام النموذجي

Understanding the roles of human DNA repair proteins in genetic pathways is a formidable challenge to many researchers.  Genetic studies in mammalian ...

Adenovirus-mediated Genetic Removal of Signaling Molecules in Cultured Primary Mouse Embryonic Fibroblasts

اتش بوساطة إزالة الجزيئات الجينية في اشارة الى مثقف الخلايا الليفية الماوس الأولية الجنينية

The ability to genetically remove specific components of various cell signalling cascades has been an integral tool in modern signal transduction ...

DNA Extraction from Paraffin Embedded Material for Genetic and Epigenetic Analyses

استخراج الحمض النووي من مادة البارافين جزءا لا يتجزأ من التحليلات الجينية واللا جيني

Disease development and progression are characterized by frequent genetic and epigenetic aberrations including chromosomal rearrangements, copy number ...

Determining Genetic Expression Profiles in C. elegans Using Microarray and Real-time PCR

Determining Genetic Expression Profiles in C. elegans Using Microarray and Real-time PCR

تحديد ملامح التعبير الجيني في C. ايليجانس استخدام ميكروأري وPCR الوقت الحقيقي

Synapses are composed of a presynaptic active zone in the signaling cell and a postsynaptic terminal in the target cell. In the case of chemical synapses, ...

Combining Single-molecule Manipulation and Imaging for the Study of Protein-DNA Interactions

الجمع بين التلاعب جزيء واحدة والتصوير لدراسة التفاعلات-DNA البروتين

The paper describes the combination of optical tweezers and single molecule fluorescence detection for the study of protein-DNA interaction. The method ...

DNA Electroporation, Isolation and Imaging of Myofibers

DNA Electroporation لل، عزل والتصوير من Myofibers

Mature muscle has a unique structure that is amenable to live cell imaging. Herein, we describe the experimental protocol for expressing fluorescently ...

In Vivo Alkaline Comet Assay and Enzyme-modified Alkaline Comet Assay for Measuring DNA Strand Breaks and Oxidative DNA Damage in Rat Liver

In Vivo Alkaline Comet Assay and Enzyme-modified Alkaline Comet Assay for Measuring DNA Strand Breaks and Oxidative DNA Damage in Rat Liver

في فيفو القلوية المذنب الفحص وأنزيم المعدلة القلوية المذنب الفحص لقياس فواصل حبلا الحمض النووي والحمض النووي الضرر التأكسدي في كبد الفئران

Unrepaired DNA damage can lead to genetic instability, which in turn may enhance cancer development. Therefore, identifying potential DNA damaging agents ...

Amplification, Next-generation Sequencing, and Genomic DNA Mapping of Retroviral Integration Sites

التضخيم، الجيل التالي من التسلسل، والحمض النووي الجينوم رسم خرائط مواقع التكامل فيروسات الرجعية

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of ...