Name: linear amplification mediated pcr &#8211; localization of genetic elements and characterization of unknown flanking dna
Uploaded: 2014-06-25T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Linear Amplification Mediated PCR Ã¢â‚¬â€œ Localization of Genetic Elements and Characterization of Unknown Flanking DNA at JoVE.com

Funding was provided by the Deutsche Forschungsgemeinschaft (SPP1230, grant of the Tumor Center Heidelberg/Mannheim), by the Bundesministerium f&#252;r Bildung und Forschung (iGene), by the VIth + VIIth Framework Programs of the European Commission (CONSERT, CLINIGENE and PERSIST). We thank Ina Kutschera for demonstrating the protocol technique in the video.

1. הכנת קלטות לינקר (LC) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים 40 μl של oligonucleotide LC1 (טבלת 1), 40 μl של oligonucleotide LC2 (טבלת 1, עם הסככה אנזים הגבלה מתאימה), 110 μl טריס-HCl (100 מ&quot;מ, pH 7.5), ו10 μl 250 מ&quot;מ MgCl 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדגור על 95 מ?...

<ol>
	<li>Schmidt, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+and+direct+genomic+sequencing+of+multiple+rare+unknown+flanking+DNA+in+highly+complex+samples.">Detection and direct genomic sequencing of multiple rare unknown flanking DNA in highly complex samples.</a> Hum Gene Ther. 12, 743-749 (2001).</li><li>Schmidt, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+insertion-site+analysis+by+linear+amplification-mediated+PCR+(LAM-PCR).">High-resolution insertion-site analysis by linear amplification-mediated PCR (LAM-PCR).</a> Nat Methods. 4, 1051-1057 (2007).</li><li>Schroeder, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+integration+in+the+human+genome+favors+active+genes+and+local+hotspots.">HIV-1 integration in the human genome favors active genes and local hotspots.</a> Cell. 110, 521-529 (2002).</li><li>Wu, X., Li, Y., Crise, B., Burgess, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+start+regions+in+the+human+genome+are+favored+targets+for+MLV+integration.">Transcription start regions in the human genome are favored targets for MLV integration.</a> Science. 300, 1749-1751 (2003).</li><li>Vigdal, T. J., Kaufman, C. D., Izsvak, Z., Voytas, D. F., Ivics, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Common+physical+properties+of+DNA+affecting+target+site+selection+of+sleeping+beauty+and+other+Tc1/mariner+transposable+elements.">Common physical properties of DNA affecting target site selection of sleeping beauty and other Tc1/mariner transposable elements.</a> J Mol Biol. 323, 441-452 (2002).</li><li>Lewinski, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retroviral+DNA+integration:+viral+and+cellular+determinants+of+target-site+selection.">Retroviral DNA integration: viral and cellular determinants of target-site selection.</a> PLoS Pathog. 2, (2006).</li><li>Mueller, P. R., Wold, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+footprinting+of+a+muscle+specific+enhancer+by+ligation+mediated+PCR.">In vivo footprinting of a muscle specific enhancer by ligation mediated PCR.</a> Science. 246, 780-786 (1989).</li><li>Silver, J., Keerikatte, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+use+of+polymerase+chain+reaction+to+amplify+cellular+DNA+adjacent+to+an+integrated+provirus.">Novel use of polymerase chain reaction to amplify cellular DNA adjacent to an integrated provirus.</a> Journal of virology. 63, 1924-1928 (1989).</li><li>Gabriel, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+genomic+access+to+vector+integration+in+clinical+gene+therapy.">Comprehensive genomic access to vector integration in clinical gene therapy.</a> Nature medicine. 15, 1431-1436 (2009).</li><li>Harkey, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiarm+high-throughput+integration+site+detection:+limitations+of+LAM-PCR+technology+and+optimization+for+clonal+analysis.">Multiarm high-throughput integration site detection: limitations of LAM-PCR technology and optimization for clonal analysis.</a> Stem Cells Dev. 16, 381-392 (2007).</li><li>Wang, G. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+bar+coding+and+pyrosequencing+to+analyze+adverse+events+in+therapeutic+gene+transfer.">DNA bar coding and pyrosequencing to analyze adverse events in therapeutic gene transfer.</a> Nucleic acids research. 36, (2008).</li><li>Paruzynski, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+high-throughput+integrome+analyses+by+nrLAM-PCR+and+next-generation+sequencing.">Genome-wide high-throughput integrome analyses by nrLAM-PCR and next-generation sequencing.</a> Nat. Protocols. 5, 1379-1395 (2010).</li><li>Hacein-Bey-Abina, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insertional+oncogenesis+in+4+patients+after+retrovirus-mediated+gene+therapy+of+SCID-X1.">Insertional oncogenesis in 4 patients after retrovirus-mediated gene therapy of SCID-X1.</a> J Clin Invest. , 3132-3142 (2008).</li><li>Hacein-Bey-Abina, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LMO2-associated+clonal+T+cell+proliferation+in+two+patients+after+gene+therapy+for+SCID-X1.">LMO2-associated clonal T cell proliferation in two patients after gene therapy for SCID-X1.</a> Science. 302, 415-419 (2003).</li><li>Howe, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insertional+mutagenesis+combined+with+acquired+somatic+mutations+causes+leukemogenesis+following+gene+therapy+of+SCID-X1+patients.">Insertional mutagenesis combined with acquired somatic mutations causes leukemogenesis following gene therapy of SCID-X1 patients.</a> J Clin Invest. 118, 3143-3150 (2008).</li><li>Cartier, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoietic+stem+cell+gene+therapy+with+a+lentiviral+vector+in+X-linked+adrenoleukodystrophy.">Hematopoietic stem cell gene therapy with a lentiviral vector in X-linked adrenoleukodystrophy.</a> Science. 326, 818-823 (2009).</li><li>Matrai, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatocyte-targeted+expression+by+integrase-defective+lentiviral+vectors+induces+antigen-specific+tolerance+in+mice+with+low+genotoxic+risk.">Hepatocyte-targeted expression by integrase-defective lentiviral vectors induces antigen-specific tolerance in mice with low genotoxic risk.</a> Hepatology. 53, 1696-1707 (2011).</li><li>Penaud-Budloo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adeno-associated+virus+vector+genomes+persist+as+episomal+chromatin+in+primate+muscle.">Adeno-associated virus vector genomes persist as episomal chromatin in primate muscle.</a> Journal of virology. 82, 7875-7885 (2008).</li><li>Kaeppel, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+largely+random+AAV+integration+profile+after+LPLD+gene+therapy.">A largely random AAV integration profile after LPLD gene therapy.</a> Nature medicine. 19, 889-891 (2013).</li><li>Voigt, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retargeting+sleeping+beauty+transposon+insertions+by+engineered+zinc+finger+DNA-binding+domains.">Retargeting sleeping beauty transposon insertions by engineered zinc finger DNA-binding domains.</a> Mol Ther. 20, 1852-1862 (2012).</li><li>Yanez-Munoz, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effective+gene+therapy+with+nonintegrating+lentiviral+vectors.">Effective gene therapy with nonintegrating lentiviral vectors.</a> Nature medicine. 12, 348-353 (2006).</li><li>Boztug, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem-Cell+Gene+Therapy+for+the+Wiskott-Aldrich+Syndrome.">Stem-Cell Gene Therapy for the Wiskott-Aldrich Syndrome.</a> N Engl J Med. 363, 1918-1927 (2010).</li><li>Deichmann, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vector+integration+is+nonrandom+and+clustered+and+influences+the+fate+of+lymphopoiesis+in+SCID-X1+gene+therapy.">Vector integration is nonrandom and clustered and influences the fate of lymphopoiesis in SCID-X1 gene therapy.</a> J Clin Invest. 117, 2225-2232 (2007).</li><li>Schwarzwaelder, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gammaretrovirus-mediated+correction+of+SCID-X1+is+associated+with+skewed+vector+integration+site+distribution+in+vivo.">Gammaretrovirus-mediated correction of SCID-X1 is associated with skewed vector integration site distribution in vivo.</a> J Clin Invest. 117, 2241-2249 (2007).</li><li>Gabriel, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+unbiased+genome-wide+analysis+of+zinc-finger+nuclease+specificity.">An unbiased genome-wide analysis of zinc-finger nuclease specificity.</a> Nat Biotechnol. 29, 816-823 (2011).</li><li>Dieter, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+types+of+tumor-initiating+cells+form+human+colon+cancer+tumors+and+metastases.">Distinct types of tumor-initiating cells form human colon cancer tumors and metastases.</a> Cell Stem Cell. 9, 357-365 (2011).</li><li>Montini, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoietic+stem+cell+gene+transfer+in+a+tumor-prone+mouse+model+uncovers+low+genotoxicity+of+lentiviral+vector+integration.">Hematopoietic stem cell gene transfer in a tumor-prone mouse model uncovers low genotoxicity of lentiviral vector integration.</a> Nature biotechnology. 24, 687-696 (2006).</li><li>Zavidij, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+long-term+blood+formation+by+stem+cells+in+murine+steady-state+hematopoiesis.">Stable long-term blood formation by stem cells in murine steady-state hematopoiesis.</a> Stem Cells. 30, 1961-1970 (2012).</li><li>Martins, V. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thymus-autonomous+T+cell+development+in+the+absence+of+progenitor+import.">Thymus-autonomous T cell development in the absence of progenitor import.</a> J Exp Med. 209, 1409-1417 (2012).</li><li>Arens, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioinformatic+clonality+analysis+of+next-generation+sequencing-derived+viral+vector+integration+sites.">Bioinformatic clonality analysis of next-generation sequencing-derived viral vector integration sites.</a> Hum Gene Ther Methods. 23, 111-118 (2012).</li></ol>

הטכניקה לאם-PCR מאפשרת זיהוי רצפי DNA ידועים כי האגף אזור ה-DNA ידוע. בגלל הרגישות הגבוהה וכתוצאה מpreamplification של צמתים עם הכלאת פריימרים ספציפיים ברצף ה-DNA הידוע, אפשר להגביר ולזהות אפילו צמתים נדירים עד לרמת התא הבודד. להיפך, במצב polyclonal לאם-PCR הוא מסוגל להגביר אלפי צמתים שונ?...

ליניארי הגברה בתיווך PCR (לאם-PCR) מאפשר זיהוי ואפיון DNA איגוף לא ידוע הסמוך לDNA ידוע מכל מקור. באופן ספציפי יותר, לאם-PCR פותח כדי לבצע לוקליזציה של אתרי אינטגרציה וקטור ויראלי (IS) בתוך הגנום המארח 1,2. אלמנטים גנטיים כמו רטרווירוסים או transposons לשלב הגנום שלהם לתוך הגנום המארח באופן אקראי (למחצה) 3-6. במקרים רבים זה הוא מכריע לדעת בדיוק המצב שבו הווקטורים האלה משולבים. לאם-PCR הוכח להיות עדיף על שיטות אלטרנטיביות כמו בתיווך קשירת PCR 7 וגרסותיה או PCR ההפוך 8. הרגישות וחוסנה של שיטה זו נובעים מpreamplification הראשוני של צמתים וקטור הגנום ובחירה מגנטית של מוצרי ה-PCR מוגבר. כמו השיטות חלופיות שהוזכרו, לאם-PCR מסתמך על השימוש באנזימי הגבלה, מציג נטייה ליכולת אחזור של IS 9-11. כך,רק קבוצת משנה של הרפרטואר (integrome) ניתן לאתרם בתגובה אחת. הטיה זו היא למזער על ידי הניתוח המקביל של מדגם נתון באמצעות שילובים אופטימליים של אנזימי הגבלה 9. לאחרונה, גרסה של הטכנולוגיה שמכונה שאינם מגבילה לאם-PCR (nrLAM-PCR) פותח שעוקפת את השימוש באנזימי הגבלה ומאפשרת ניתוח הגנום משוחד של מדגם בתגובה אחת 9,12. בעבר, לאם-PCR נעשה שימוש כדי לזהות את רטרווירלי סיבתי נותן עלייה לוקמיה בכמה חולים בניסויים בריפוי גנטי קליניים 13-15. מאז, לאם-PCR הותאם לזהות IS מוקטורים אחרים שילוב (וקטורי lentiviral, transposons) וגם לזהות דפוסי השתלבות של פסיבי שילוב וקטורים כמו וקטורי adeno קשור (AAV) או וקטורי lentiviral אינטגראז פגום (IDLV) 16 -21. יישומים של האם-PCR הם רחב התפשטו: מסורתיly, הטכניקה היא בשימוש נרחב כדי לחקור את ההרכב המשובט של תאי גנים שונה בחולים שעברו טיפול גנטי או להעריך את הבטיחות הביולוגית של מערכות וקטור רומן של התרת האינטגרציה שלהם התנהגות 15,16,22-24. לאחרונה, לאם-PCR אפשר קביעת הספציפיות ופעילות מחוץ היעד של nucleases מעצב ידי assay השמנת IDLV 25. יתר על כן, לאם-PCR מאפשר לעקוב בקלות את גורלו של תא transduced לאורך הזמן באורגניזם. זה מאפשר לזהות אב - אונקוגנים כמו גם גנים מדכאי סרטן וגם ללמוד ביולוגיה של תא גזע סרטני hematopoiesis או 26-28. אחרון אך לא פחות חשוב, לאם-PCR הותאם ללמוד גיוון קולט תא T בבני אדם 29 (ונתונים שלא פורסמו). הכוח הפנימי של הטכנולוגיה מקבל חיזוק על ידי קישור השיטה לטכנולוגיות רצף עמוקים המאפשרות אפיון מיליונים DNA ידוע איגוף עם r נוקלאוטיד יחידesolution בגנומים שלמים. בפרוטוקול הבא, אנו מתארים צעד אחר צעד ההגברה וזיהוי של איגוף DNA ידוע exemplarily לזהות וקטור lentiviral IS. Oligonucleotides שימוש בפרוטוקול מפורטת בטבלה 1. חולץ DNA או cDNA של כל מקור יכול לשמש כתבנית ה-DNA לאם-PCR וnrLAM-PCR.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1209">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:203px;">Company</td>
			<td style="width:120px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:527px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">Taq DNA Polymerase</td>
			<td style="width:203px;">Genaxxon Bioscience GmbH</td>
			<td style="width:120px;">M3001.5000</td>
			<td>Alternative Taq Polymerases may be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">PCR Buffer</td>
			<td style="width:203px;">Qiagen</td>
			<td style="width:120px;">201203</td>
			<td>Use of this buffer is recommended</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">dNTP-Mixture</td>
			<td style="width:203px;">Genaxxon Bioscience GmbH</td>
			<td style="width:120px;">M3015.4020</td>
			<td>or any other dNTPs</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">Oligonucleotides (Primers)</td>
			<td style="width:203px;">MWG Biotech</td>
			<td style="width:120px;"></td>
			<td>HPLC purified</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">Dynabeads M-280 Streptavidin&#160;</td>
			<td style="width:203px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:120px;">11206D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">PBS</td>
			<td style="width:203px;">Gibco</td>
			<td style="width:120px;">14190-086</td>
			<td>0.1 % wt/vol BSA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">6M LiCl</td>
			<td style="width:203px;">Roth</td>
			<td style="width:120px;">3739.1</td>
			<td>10 mM Tris-HCl&#160; (pH 7.5)/1 mM EDTA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">Tris-HCl, pH 7.5</td>
			<td style="width:203px;">USB Corporation&#160;</td>
			<td style="width:120px;">22637</td>
			<td>or any other supplier</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">EDTA</td>
			<td style="width:203px;">Applichem</td>
			<td style="width:120px;">A1103,0250</td>
			<td>or any other supplier</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">Klenow Polymerase</td>
			<td style="width:203px;">Roche Diagnostics</td>
			<td style="width:120px;">10104523001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">Hexanucleotide mixture</td>
			<td style="width:203px;">Roche Diagnostics</td>
			<td style="width:120px;">11277081001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">Restriction endonuclease</td>
			<td style="width:203px;">NEB</td>
			<td style="width:120px;"></td>
			<td>or any other supplier</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">Fast-Link DNA ligation kit</td>
			<td style="width:203px;">Epicentre Biotechnologies</td>
			<td style="width:120px;">LK11025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">CircLigase ssDNA Ligase Kit</td>
			<td style="width:203px;">Epicentre Biotechnologies</td>
			<td style="width:120px;">CL4111K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">NaOH</td>
			<td style="width:203px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">72068</td>
			<td>or any other supplier</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">Agarose LE</td>
			<td style="width:203px;">Roche Diagnostics</td>
			<td style="width:120px;">11685660001</td>
			<td>or any other supplier</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">TBE buffer</td>
			<td style="width:203px;">Amresco</td>
			<td style="width:120px;">0658</td>
			<td>or any other supplier</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">Ethidium bromide</td>
			<td style="width:203px;">Applichem</td>
			<td style="width:120px;">A2273,0005</td>
			<td>Ethidium bromide is mutagenic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">100 bp DNA Ladder</td>
			<td style="width:203px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:120px;">15628-050</td>
			<td>or any other DNA ladder</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">20 mM NaCl</td>
			<td style="width:203px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">71393-1L</td>
			<td>or any other supplier</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">Magna-Sep Magnetic Particle Separator&#160;</td>
			<td style="width:203px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:120px;">K158501</td>
			<td>for use with 1.5 ml Tubes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">Magna-Sep Magnetic Particle Separator&#160;</td>
			<td style="width:203px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:120px;">K158696</td>
			<td>for use with 96 well plates</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Amicon Ultra-0.5, Ultracel-30 membrane</td>
			<td style="width:203px;">Millipore</td>
			<td>UFC503096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">PerfectBlue Gelsystem Midi S</td>
			<td style="width:203px;">PeqLab</td>
			<td style="width:120px;">40-1515</td>
			<td>or other electrophoresis system&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">TProfessional 96</td>
			<td style="width:203px;">Biometra</td>
			<td style="width:120px;">050-551</td>
			<td>or other Thermocycler for 96-well plates</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">Orbital shaker KS 260 basic</td>
			<td style="width:203px;">IKA</td>
			<td style="width:120px;">2980200</td>
			<td>or other horizontal shaker</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">PCR softtubes 0.2 ml</td>
			<td style="width:203px;">Biozym Scientific GmbH</td>
			<td style="width:120px;">711082</td>
			<td>or other 0.2 ml PCR tubes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">1.5 ml tubes</td>
			<td style="width:203px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:120px;">12682</td>
			<td>or other 1.5 ml tubes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">Gel documentation system</td>
			<td style="width:203px;">PeqLab</td>
			<td style="width:120px;"></td>
			<td>or any other gel documentation system</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">Nanodrop ND-1000 spectrophotometer</td>
			<td style="width:203px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:120px;">ND-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">Spreadex EL1200 precast gel</td>
			<td style="width:203px;">Elchrom Scientific</td>
			<td style="width:120px;">3497</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:360px;">Submerged gel electrophoresis apparatus SEA 2000&#160;</td>
			<td style="width:203px;">Elchrom Scientific</td>
			<td style="width:120px;">2001E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">2100 Electrophoresis Bioanalyzer</td>
			<td style="width:203px;">Agilent Technologies</td>
			<td>G2939AA</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

linear amplification mediated pcr &#8211; localization of genetic elements and characterization of unknown flanking dna

Linear-amplification mediated PCR (LAM-PCR) has been developed to study hematopoiesis in gene corrected cells of patients treated by gene therapy with integrating vector systems. Due to the stable integration of retroviral vectors, integration sites can be used to study the clonal fate of individual cells and their progeny. LAM- PCR for the first time provided evidence that leukemia in gene therapy treated patients originated from provirus induced overexpression of a neighboring proto-oncogene. The high sensitivity and specificity of LAM-PCR compared to existing methods like inverse PCR and ligation mediated (LM)-PCR is achieved by an initial preamplification step (linear PCR of 100 cycles) using biotinylated vector specific primers which allow subsequent reaction steps to be carried out on solid phase (magnetic beads). LAM-PCR is currently the most sensitive method available to identify&#160;unknown DNA which is located in the proximity of known DNA. Recently, a variant of LAM-PCR has been developed that circumvents restriction digest thus abrogating retrieval bias of integration sites and enables a comprehensive analysis of provirus locations in host genomes. The following protocol explains step-by-step the amplification of both 3&#8217;- and 5&#8217;- sequences adjacent to the integrated lentiviral vector.

לאם-PCR תוצאות בהגברה של צמתים הגנום וקטור עם גודל שבר שהוגדר עבור כל צומת. הגודל של שברי PCR פרט תלוי במרחק בין המיקום של ה-DNA הידוע בגנום ואתר ההכרה הקרוב ביותר הגבלת האנזים. זה מאפשר לדמיין את המגוון של צמתים מוגברות בדגימות נותחו על ידי ג&#39;ל אלקטרופורזה, למשל., אם ...

Watch this Scientific Journal Video about Linear Amplification Mediated PCR Ã¢â‚¬â€œ Localization of Genetic Elements and Characterization of Unknown Flanking DNA at JoVE.com

Linear Amplification Mediated PCR ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â‚¬Å“ Localization of Genetic Elements and Characterization of Unknown Flanking DNA

ליניארי ההגברה המתווכת PCR - לוקליזציה של אלמנטים גנטיים ואפיון ידוע האיגוף DNA

ליניארי הגברה בתיווך (לאם)-PCR היא שיטה שפותחה כדי לזהות את העמדות של שילוב וקטורים ויראליים בגנום המדויקות. הטכניקה התפתחה להיות השיטה מעולה ללמוד דינמיקה משובט בחולי ריפוי גנטי, בטיחות ביולוגית של טכנולוגיות חדישות וקטורית, גיוון תא T, מודלים תא גזע סרטני, וכו &#39;

Linear-amplification mediated PCR (LAM-PCR) has been developed to study hematopoiesis in gene corrected cells of patients treated by gene therapy with ...

Research

JoVE Journal

Biology

Linear Amplification Mediated PCR &#8211; Localization of Genetic Elements and Characterization of Unknown Flanking DNA

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo (New Culture)

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo New Culture

שיטת לתרבות מוקדם של עוברים צ&#39;יק לשעבר vivo (תרבות חדש)

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Double Whole Mount in situ Hybridization of Early Chick Embryos

הר שלם כפול באתרו הכלאה של עוברים צ&#39;יק מוקדם

Genetic Studies of Human DNA Repair Proteins Using Yeast as a Model System 

מחקרים גנטיים של חלבונים תיקון דנ&quot;א אנושי באמצעות שמרים כמודל למערכת

Understanding the roles of human DNA repair proteins in genetic pathways is a formidable challenge to many researchers.  Genetic studies in mammalian ...

Adenovirus-mediated Genetic Removal of Signaling Molecules in Cultured Primary Mouse Embryonic Fibroblasts

Adenovirus בתיווך הסרת גנטית של מולקולות איתות ב Cultured Fibroblasts עכבר ראשיים עובריים

The ability to genetically remove specific components of various cell signalling cascades has been an integral tool in modern signal transduction ...

DNA Extraction from Paraffin Embedded Material for Genetic and Epigenetic Analyses

הפקת DNA מחומר פרפין Embedded עבור ניתוח גנטי epigenetic

Disease development and progression are characterized by frequent genetic and epigenetic aberrations including chromosomal rearrangements, copy number ...

Determining Genetic Expression Profiles in C. elegans Using Microarray and Real-time PCR

Determining Genetic Expression Profiles in C. elegans Using Microarray and Real-time PCR

קביעת פרופילים ביטוי גנטיים ג elegans שימוש microarray בזמן אמת PCR

Synapses are composed of a presynaptic active zone in the signaling cell and a postsynaptic terminal in the target cell. In the case of chemical synapses, ...

Combining Single-molecule Manipulation and Imaging for the Study of Protein-DNA Interactions

שילוב מניפולציה מולקולה בודדת והדמיה לחקר אינטראקציות החלבון-DNA

The paper describes the combination of optical tweezers and single molecule fluorescence detection for the study of protein-DNA interaction. The method ...

DNA Electroporation, Isolation and Imaging of Myofibers

DNA Electroporation, בידוד והדמיה של Myofibers

Mature muscle has a unique structure that is amenable to live cell imaging. Herein, we describe the experimental protocol for expressing fluorescently ...

In Vivo Alkaline Comet Assay and Enzyme-modified Alkaline Comet Assay for Measuring DNA Strand Breaks and Oxidative DNA Damage in Rat Liver

In Vivo Alkaline Comet Assay and Enzyme-modified Alkaline Comet Assay for Measuring DNA Strand Breaks and Oxidative DNA Damage in Rat Liver

In vivo אלקליין השביט Assay ואנזים-modified אלקליין השביט Assay עבור מדידת Breaks Strand דנ&quot;א נזק חמצוני דנ&quot;א עכברוש הכבד

Unrepaired DNA damage can lead to genetic instability, which in turn may enhance cancer development. Therefore, identifying potential DNA damaging agents ...

Amplification, Next-generation Sequencing, and Genomic DNA Mapping of Retroviral Integration Sites

הגברה, רצף הדור הבא, ואת הגנום מיפוי ה- DNA של אתרי אינטגרצית retroviral

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of ...