Name: real-time imaging of single engineered rna transcripts in living cells using ratiometric bimolecular beacons
Uploaded: 2014-08-06T14:30:00
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この作品は、国立科学財団キャリア賞（0953583）と健康NCI / R21-CA116102総合研究所、NCI / R21-CA125088、NIBIB / R01-EB012065、NCI / R01-CA157766によってサポートされていました。

このプロトコルでは、一つのオリゴヌクレオチド（RBMB1）はCF640Rレポーター色素とその5 &#39;末端で標識され、配列：5&#39;mCmUmUmC mGmUmC mCmAmC mAmAmA mCmAmC mAmAmC mUmCmC mUのmGmAmAmG mGmAmC mGmGmC mAmGmC mGmUmG mCmAmG mCmUmC MUMU-3&#39;。ヘアピン構造の形成を推進自己相補的ドメインは、太字で示しています。第二のオリゴヌクレオチド（RBMB2）はアイオワブラックRQ-Spをクエンチャーとの3 &#...

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	<li>Tyagi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+intracellular+RNA+distribution+and+dynamics+in+living+cells.">Imaging intracellular RNA distribution and dynamics in living cells.</a> Nat Methods. 6 (5), 331-338 (2009).</li><li>Bertrand, E., Chartrand, P., Schaefer, M., Shenoy, S. M., Singer, R. H., Long, R. 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H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+pulsing+of+a+developmental+gene.">Transcriptional pulsing of a developmental gene.</a> Curr Biol. 16 (10), 1018-1025 (2006).</li><li>Muramoto, T., Cannon, D., Gierlinski, M., Corrigan, A., Barton, G. J., Chubb, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+nascent+RNA+dynamics+reveals+distinct+types+of+transcriptional+pulse+regulation.">Live imaging of nascent RNA dynamics reveals distinct types of transcriptional pulse regulation.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 109 (19), 7350-7355 (2012).</li><li>Ewers, H., Smith, A. E., Sbalzarini, I. F., Lilie, H., Koumoutsakos, P., Helenius, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-particle+tracking+of+murine+polyoma+virus-like+particles+on+live+cells+and+artificial+membranes.">Single-particle tracking of murine polyoma virus-like particles on live cells and artificial membranes.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 102 (42), 15110-15115 (2005).</li><li>Forrest, K. M., Gavis, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+endogenous+RNA+reveals+a+diffusion+and+entrapment+mechanism+for+nanos+mRNA+localization+in+Drosophila.">Live imaging of endogenous RNA reveals a diffusion and entrapment mechanism for nanos mRNA localization in Drosophila.</a> Curr Biol. 13 (14), 1159-1168 (2003).</li><li>Weil, T. T., Forrest, K. M., Gavis, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+bicoid+mRNA+in+late+oocytes+is+maintained+by+continual+active+transport.">Localization of bicoid mRNA in late oocytes is maintained by continual active transport.</a> Dev Cell. 11 (2), 251-262 (2006).</li><li>Yamagishi, M., Ishihama, Y., Shirasaki, Y., Kurama, H., Funatsu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+imaging+of+beta-actin+mRNAs+in+the+cytoplasm+of+a+living+cell.">Single-molecule imaging of beta-actin mRNAs in the cytoplasm of a living cell.</a> Exp Cell Res. 315 (7), 1142-1147 (2009).</li><li>Fusco, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+mRNA+molecules+demonstrate+probabilistic+movement+in+living+mammalian+cells.">Single mRNA molecules demonstrate probabilistic movement in living mammalian cells.</a> Curr Biol. 13 (2), 161-167 (2003).</li><li>Ozawa, T., Natori, Y., Sato, M., Umezawa, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+dynamics+of+endogenous+mitochondrial+RNA+in+single+living+cells.">Imaging dynamics of endogenous mitochondrial RNA in single living cells.</a> Nat Methods. 4 (5), 413-419 (2007).</li><li>Daigle, N., Ellenberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LambdaN-GFP:+an+RNA+reporter+system+for+live-cell+imaging.">LambdaN-GFP: an RNA reporter system for live-cell imaging.</a> Nat Methods. 4 (8), 633-636 (2007).</li><li>Bogaard, P. T., Tyagi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+molecular+beacons+to+study+dispersal+of+mRNPs+from+the+gene+locus.">Using molecular beacons to study dispersal of mRNPs from the gene locus.</a> Methods Mol Biol. 464, 91-103 (2009).</li><li>Vargas, D. Y., Raj, A., Marras, S. A., Kramer, F. R., Tyagi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+mRNA+transport+in+the+nucleus.">Mechanism of mRNA transport in the nucleus.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 102 (47), 17008-17013 (2005).</li><li>Chen, A. K., Davydenko, O., Behlke, M. A., Tsourkas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ratiometric+bimolecular+beacons+for+the+sensitive+detection+of+RNA+in+single+living+cells.">Ratiometric bimolecular beacons for the sensitive detection of RNA in single living cells.</a> Nucleic Acids Res. 38 (14), e148 (2010).</li><li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+assessment+of+ratiometric+bimolecular+beacons+as+a+tool+for+imaging+single+engineered+RNA+transcripts+and+measuring+gene+expression+in+living+cells.">Quantitative assessment of ratiometric bimolecular beacons as a tool for imaging single engineered RNA transcripts and measuring gene expression in living cells.</a> Nucleic Acids Res. , (2013).</li><li>Tsourkas, A., Behlke, M. A., Bao, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure-function+relationships+of+shared-stem+and+conventional+molecular+beacons.">Structure-function relationships of shared-stem and conventional molecular beacons.</a> Nucleic Acids Res. 30 (19), 4208-4215 (2002).</li><li>Tsourkas, A., Behlke, M. A., Rose, S. D., Bao, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hybridization+kinetics+and+thermodynamics+of+molecular+beacons.">Hybridization kinetics and thermodynamics of molecular beacons.</a> Nucleic Acids Res. 31 (4), 1319-1330 (2003).</li><li>Bao, G., Rhee, W. J., Tsourkas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+probes+for+live-cell+RNA+detection.">Fluorescent probes for live-cell RNA detection.</a> Annu Rev Biomed Eng. 11, 25-47 (2009).</li><li>Zuker, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mfold+web+server+for+nucleic+acid+folding+and+hybridization+prediction.">Mfold web server for nucleic acid folding and hybridization prediction.</a> Nucleic Acids Res. 31 (13), 3406-3415 (2003).</li><li>Chen, A. K., Behlke, M. A., Tsourkas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+cytosolic+delivery+of+molecular+beacon+conjugates+and+flow+cytometric+analysis+of+target+RNA.">Efficient cytosolic delivery of molecular beacon conjugates and flow cytometric analysis of target RNA.</a> Nucleic Acids Res. 36 (12), e69 (2008).</li><li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+assessment+of+ratiometric+bimolecular+beacons+as+a+tool+for+imaging+single+engineered+RNA+transcripts+and+measuring+gene+expression+in+living+cells.">Quantitative assessment of ratiometric bimolecular beacons as a tool for imaging single engineered RNA transcripts and measuring gene expression in living cells.</a> Nucleic Acids Res. 41 (15), e152 (2013).</li><li>Ainger, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transport+and+localization+of+exogenous+myelin+basic+protein+mRNA+microinjected+into+oligodendrocytes.">Transport and localization of exogenous myelin basic protein mRNA microinjected into oligodendrocytes.</a> J Cell Biol. 123 (2), 431-441 (1993).</li><li>Weil, T. 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A., Tsourkas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Avoiding+false-positive+signals+with+nuclease-vulnerable+molecular+beacons+in+single+living+cells.">Avoiding false-positive signals with nuclease-vulnerable molecular beacons in single living cells.</a> Nucleic Acids Res. 35 (16), e105 (2007).</li><li>Chen, A. K., Tsourkas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+RNA+in+living+cells+with+molecular+beacons:+current+perspectives+and+challenges.">Imaging RNA in living cells with molecular beacons: current perspectives and challenges.</a> Journal of Innovative Optical Health Sciences. 2 (4), 315 (2009).</li><li>Nitin, N., Santangelo, P. J., Kim, G., Nie, S., Bao, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptide-linked+molecular+beacons+for+efficient+delivery+and+rapid+mRNA+detection+in+living+cells.">Peptide-linked molecular beacons for efficient delivery and rapid mRNA detection in living cells.</a> Nucleic Acids Res. 32 (6), e58 (2004).</li><li>Santangelo, P. J., Nix, B., Tsourkas, A., Bao, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+FRET+molecular+beacons+for+mRNA+detection+in+living+cells.">Dual FRET molecular beacons for mRNA detection in living cells.</a> Nucleic Acids Res. 32 (6), e57 (2004).</li><li>Altman, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyanine+fluorophore+derivatives+with+enhanced+photostability.">Cyanine fluorophore derivatives with enhanced photostability.</a> Nat Methods. 9 (1), 68-71 (2012).</li><li>Kumaraswamy, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent-conjugated+polymer+superquenching+facilitates+highly+sensitive+detection+of+proteases.">Fluorescent-conjugated polymer superquenching facilitates highly sensitive detection of proteases.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 101 (20), 7511-7515 (2004).</li><li>Yang, C. J., Pinto, M., Schanze, K., Tan, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+synthesis+of+an+oligonucleotide-poly(phenylene+ethynylene)+conjugate+with+a+precise+one-to-one+molecular+ratio.">Direct synthesis of an oligonucleotide-poly(phenylene ethynylene) conjugate with a precise one-to-one molecular ratio.</a> Angew Chem Int Ed Engl. 44 (17), 2572-2576 (2005).</li><li>Lu, J., Tsourkas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+individual+microRNAs+in+single+mammalian+cells+in+situ.">Imaging individual microRNAs in single mammalian cells in situ.</a> Nucleic Acids Res. 37 (14), e100 (2009).</li><li>Raj, A., Peskin, C. S., Tranchina, D., Vargas, D. Y., Tyagi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stochastic+mRNA+synthesis+in+mammalian+cells.">Stochastic mRNA synthesis in mammalian cells.</a> PLoS Biol. 4 (10), e309 (2006).</li></ol>

従来の広視野顕微鏡を用いて、生きた細胞内の画像の単一設計されたRNA転写する能力は、各RNA転写物と結合していない蛍光プローブから発せられる低蛍光バックグラウンドに関連付けられる、明るく光安定蛍光シグナルを必要とします。この方法では、明るい蛍光シグナルは、各RNA転写物の上に、（96まで）の複数のオリゴヌクレオチドに基づく蛍光プローブ、 すなわち RBMBsをハイブ?...

RNA転写物の発現および調節は、細胞の挙動と運命を制御するための主な原因であり、複雑で動的なプロセスである。細胞機能を口述におけるRNAの重要性は以前から知​​られているが、ほとんどのRNAの解析ツールは、このような転写破裂、RNAなどの重要な調節事象を捕捉するために必要な空間および時間分解能を欠いているので、両者の間に明確な接続を描画することはしばしば困難である人身売買、およびローカライズされたRNAプロセシング。これは、個別のRNA転写物がリアルタイム1に生細胞内で可視化することを可能にするいくつかの技術の出現につながっている。おそらく、これらの技術の最も顕著な3&#39;-UTR 2,3にMS2結合部位の縦列反復を含むように操作されたRNAを標的とGFP-MS2融合タンパク質を利用する。近接さ、複数のGFP分子をもたらすことで、個別のRNA転写物は、明るい蛍光スポットとして表示され蛍光顕微鏡を経由。 GFP-MS2システムは、直接可視化および転写の測定値4,5破裂 、ユニークな細胞内局在および処理6-9の検出、およびRNA輸送10のリアルタイムイメージングを含む、RNAの挙動に前例のない洞察を、提供してきました。しかし、GFP-MS2システムの大きな可能性にもかかわらず、結合していないGFP-MS2融合タンパク質は汎用性とこの技術のダイナミックレンジを制限する高いバックグラウンド蛍光信号を生成することができる。いくつかのアプローチは、タンパク質断片相補11、及び代替RNA結合タンパク質と12を標的に結合していないGFP-MS2 10の細胞内区画化を含む、このバックグラウンド信号を制限するために開発されてきた。しかしながら、これらのアプローチの全ては、RNA標的とGFP-MS2融合タンパク質の相対的な総発現に対して感受性のままである。 AとしてGFP-MS2システムにlternative、分子ビーコンはまた、3&#39;-UTR 13,14における相補的な結合部位の縦列反復して操作されたRNA転写物を検出するために使用されてきた。分子ビーコンは、クエンチャーで、蛍光レポーターと他方の端部に一端で標識されているヘアピン形成オリゴヌクレオチドプローブである。標的RNAに結合されていない場合には蛍光レポーターとクエンチャーは、低蛍光状態になり、すぐ近くに残っています。ハイブリダイゼーションの際、蛍光レポーターとクエンチャーが離れて強制されると蛍光が復元されます。 GFP-MS2システムと同様、蛍光顕微鏡によって同定することができる明るい蛍光スポットにおける単一のRNA転写産物をもたらす上に複数の分子ビーコンの結合;しかしながら、バックグラウンド蛍光は、未結合の分子ビーコンの急冷構成に起因はるかに低いことが期待される。残念なことに、m個に組み込まれる巧妙な活性化メカニズムにもかかわらずolecularビーコンデザイン、生きている細胞に導入された場合にハイブリダイズしていない分子ビーコンは、ヘアピンコンフォメーションに残っていないことを成長している証拠がある。したがって、それらは有意にシグナル対バックグラウンドを低減する偽陽性シグナルを生成する。 15,16;この欠点を克服するために、私たちは最近、生きている細胞、レシオメトリック二分子ビーコン（ 図1A RBMBs）で画像化RNAのための新しい合成プローブを開発しました。 RBMBsは、短いヘアピンRNA（shRNA）、および分子ビーコンの両方から特徴を有するハイブリッド構造を形成する2つの2&#39;-O-メチルオリゴヌクレオチド鎖から構成されている。 3&#39;-UUオーバーハングの長い二本鎖ドメインはshRNAのより特徴的である間ループし、蛍光活性化機構は、分子ビーコンに似ています。 shRNAの機能は、核輸出を駆動するように設計されている私たちは&gt; 24時間に増加した細胞内寿命を見つけている、最小限の観察劣化し、ループの非特異的な開口を防止する。結果RBMBsは、分子ビーコンよりも有意に高いシグナル対バックグラウンドを示した。 これは、DNAベースのプローブは、RNAベースのプローブと同じ核外輸送機能を有していないのでRBMBsは、DNAオリゴヌクレオチドを​​用いて調製することができないことに留意すべきである。構造的に、RBMBループは、典型的には、RNAのハイブリダイゼーションの際の特異性および選択性の間のバランスを作成するために、長い15と21塩基の間であるように設計されている。 2つの自己相補的なドメインから構成する短いステムは、通常、4塩基であるように設計されている。長いステムが選択されている場合、RBMBループと標的RNAとのハイブリダイゼーションの速度は著しく17,18を減速される。より短いステム配列が選択されたとき、逆に溶融温度が高いバックグラウンドシグナルをもたらす、37℃でステムループ構造を維持するために頻繁に低すぎる。 RBMBの特異性も赤です茎長が短くなるようにuced。 RBMBステム-ループの配列はまた、RBMB性能に影響を与えることができるので、19を慎重に選択しなければならない。具体的には、理想的なループ配列は、最小の二次構造を有するべきである最小の二次構造を有するRNA配列にハイブリダイズし、タンパク質結合部位を回避し、および結合オフターゲットを回避する。 RBMBおよびRNA二次構造の両方の予測は、MFOLD 20などのソフトウェアを使用して得ることができる。コンプリメンタリオフターゲット部位は、ヌクレオチドの基本的なローカル割り付け検索ツール（BLAST）を使用して識別することができます。しかし、モデル予測およびタンパク質入札機関部位を同定することが困難に不整合により、すべてのRBMBsの特異性は、最終的には実験的に検証する必要があります。 望ましい場合には、ハイブリダイゼーション状態の影響を受けない非消光参照色素はRBMB 15に加えることができる。参照色素の添加は、PRができるプローブの配信のためにマーカーをovide全細胞蛍光のより正確な測定が必要な場合は、レシオメトリックイメージングに使用される。リファレンス色素は測定が送達細胞間のばらつきに起因バックグラウンドの差を調整することができる。しかし、個別のRNAを撮像する際は、参照色素を必要としない転写産物。注目すべきことに、いくつかの基準色素は核内でわずかに高いバックグラウンドシグナルをもたらし、核からRBMBsの輸出を妨害する可能性がある。 適切に設計されたときに、標的RNAは、少なくとも4つのRBMB結合部位（ 図1B）16 を含むように操作された場合、RBMBsは、単一の生細胞内の画像個別のRNA転写物に使用することができる。 RBMBsを効率的に細胞生存率21全く影響がほとんどで、マイクロポレーションを介して細胞タイプの広い範囲内に送達することができ、遺伝子発現の定量的測定であることができる30分以内に取得しました。結合していないRBMBsからの蛍光を効率的に消光されるので、方法論は、RBMB濃度と標的RNAのレベルにかなり鈍感である。ここでは、マイクロポリアルタイムで単一のRNA転写物の画像化を介して生細胞へRBMBsを準備し、精製するために使用される方法の詳細な説明、ならびにRBMBsの送達のための一般的な手順を提供する。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="977">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Nuclease-free Water</td>
			<td style="width:207px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:220px;">AM9932</td>
			<td style="width:244px;">no DEPC-treated</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">DPBS</td>
			<td style="width:207px;">Life Technologies</td>
			<td>14190-144</td>
			<td>No Ca2+ and Mg2+</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Cary 100 UV-Vis Spectrophotometer</td>
			<td style="width:207px;">Agilent Technologies</td>
			<td style="width:220px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Potassium Phosphate Dibasic</td>
			<td style="width:207px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:220px;">P290-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Potassium Phosphate Monobasic</td>
			<td style="width:207px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:220px;">P284-500&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Sodium Phosphate Monobasic</td>
			<td style="width:207px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:220px;">S381-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Microcentrifuge tubes</td>
			<td style="width:207px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:220px;">22364111</td>
			<td>1.5mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Chromatography Column</td>
			<td style="width:207px;">Kimble Chase Life Science</td>
			<td style="width:220px;">420400-0720</td>
			<td>0.7x20cm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Superdex 75 Prep Grade</td>
			<td style="width:207px;">GE healthcare</td>
			<td style="width:220px;">17-1044-01&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Syringe Pump</td>
			<td style="width:207px;">Braintree Scientific</td>
			<td style="width:220px;">BS-300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Syringe</td>
			<td style="width:207px;">BD</td>
			<td style="width:220px;">301035</td>
			<td>60mL, Luer-lok tip</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Centrifugal Filter Units</td>
			<td style="width:207px;">Millipore</td>
			<td style="width:220px;">UFC501096</td>
			<td>Mw 10,000 cutoff</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Centrifuge 5418</td>
			<td style="width:207px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:220px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Poly-D-lysine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:220px;">P7280-5MG</td>
			<td>lyophilized powder, g-irradiated</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">8-well chambered coverglass</td>
			<td style="width:207px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:220px;">155409</td>
			<td>Working volume 0.2-0.5mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">HT1080</td>
			<td style="width:207px;">ATCC</td>
			<td style="width:220px;">CCL-121</td>
			<td>Human Fibrosarcoma cell line</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Cell Culture Flask</td>
			<td style="width:207px;">Corning</td>
			<td style="width:220px;">430639</td>
			<td>25cm2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">DMEM</td>
			<td style="width:207px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:220px;">11965084</td>
			<td>High glucose</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">DMEM without Phenol Red</td>
			<td style="width:207px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:220px;">21063029</td>
			<td>High glucose</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:207px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:220px;">F2442-500ML&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Penecillin/Streptomycin</td>
			<td style="width:207px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:220px;">15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Trypsin</td>
			<td style="width:207px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:220px;">25300054</td>
			<td>0.05% Trypsin-EDTA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Neon transfection system</td>
			<td style="width:207px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:220px;">MPK5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Neon transfection system kit&#160;</td>
			<td style="width:207px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:220px;">MPK1096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Hemacytometer</td>
			<td style="width:207px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:220px;">02-671-10&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hoescht 33342</td>
			<td style="width:207px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:220px;">H1399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">IX-81 Inverted fluorescence microscope&#160;</td>
			<td style="width:207px;">Olympus</td>
			<td style="width:220px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">SOLA light engine</td>
			<td style="width:207px;">Lumencor</td>
			<td style="width:220px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Metamorph</td>
			<td style="width:207px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:220px;"></td>
			<td>Software controlling microscope</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Immersol oil 518F</td>
			<td style="width:207px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:220px;">12-624-66B&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

real-time imaging of single engineered rna transcripts in living cells using ratiometric bimolecular beacons

両方の遺伝子発現の時間的および空間的調節は細胞機能に重要な影響を持つことができ、成長の実現は、単一の生細胞内の個別のRNA転写産物を視覚化するために多様な技術が開発された。最近記載されている一つの有望な技術は、3 &#39;非翻訳領域におけるRBMB標的配列の少なくとも4つのタンデムリピートを含むように操作されたRNA転写産物を検出するためのオリゴヌクレオチドベースの光プローブ、レシオメトリック二分子ビーコン（RBMB）を利用する。 RBMBsを具体的に相補的なRNAへのハイブリダイゼーションの際に、明るい蛍光シグナルを発するように設計されているが、それ以外は急冷されたままになります。この方法で合成プローブの使用は、赤方偏移し、光安定性を可能にし、高度に発光性有機染料は、画像形成に使用される。広視野蛍光顕微鏡下で見たときの離散蛍光スポットにおける工学的RNA転写産物の結果を複数のRBMBsの結合。したがって、個別のRNA転写物の移動が容易に蛍光画像の時系列を取ることによって、リアルタイムで可視化することができる。ここでは、マイクロポと単一のRNA転写物の生細胞イメージングによる細胞への送達、RBMBsの調製および精製を記載している。

広視野蛍光顕微鏡で画像化する際まもなくRBMBsの存在下で、HT1080細胞のマイクロポ以下、それらの3&#39;-UTR内の複数RBMB結合部位を含むように操作された個別のRNA転写物（ 図2）のように明るい蛍光スポットとして表示されます。わずか4つのRBMB結合部位を有する個別のRNA転写物は、生細胞内で画像化することができるが、3&#39;-UTRにおける結合部位よりRBMB、強い蛍光シグナル。信号?...

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Real-time Imaging of Single Engineered RNA Transcripts in Living Cells Using Ratiometric Bimolecular Beacons

レシオメトリック二分子ビーコンを使用して、生細胞における単エンジニアのRNA転写物のリアルタイムイメージング

レシオメトリック二分子ビーコン（RBMBs）は、生細胞内の画像の単一操作されたRNA転写物に使用することができる。ここでは、マイクロポリアルタイムで単一のRNA転写物の蛍光イメージングによる細胞内へのRBMBsの配信、RBMBsの調製および精製を記載している。

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the ...

Research

JoVE Journal

Biology

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

リビングでのイメージング、細胞の形状の変更ショウジョウバエ胚

The developing Drosophila melanogaster embryo undergoes a number of cell shape changes that are highly amenable to live confocal imaging.  Cell shape ...

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で遺伝子発現プロファイルを決定 C.エレガンスマイクロアレイとリアルタイムPCRを用いて

Synapses are composed of a presynaptic active zone in the signaling cell and a postsynaptic terminal in the target cell. In the case of chemical synapses, ...

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The transcriptional activity of RNA polymerase II (Pol II) is a dynamic process and therefore measuring the kinetics of the transcriptional process in ...

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単分子バイオセンサーを用いた生細胞中のシグナル伝達事象をリアルタイムで監視するための顕微鏡のFRET

F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET) microscopy  continues to gain increasing interest as a technique for real-time monitoring  of biochemical ...

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病変の特異的分子ビーコンを活用した細胞ライセート中の塩基除去修復活性の定量、リアルタイム分析

We describe a method for the quantitative, real-time measurement of DNA glycosylase and AP endonuclease activities in cell nuclear lysates using base ...

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Application of Genetically Encoded Fluorescent Nitric Oxide NOÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬Ãƒâ€šÃ‚Â¢ Probes, the geNOps, for Real-time Imaging of NOÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬Ãƒâ€šÃ‚Â¢ Signals in Single Cells

遺伝的にコードされた蛍光一酸化窒素の応用（•NO）シングル細胞におけるNO•信号のリアルタイムイメージングのためのプローブ、geNOps、

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単一分子蛍光In Situハイブリダイゼーション実験のため個々 の大腸菌細胞の転写物を自動ラベリング手法

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