Name: a step beyond bret: fluorescence by unbound excitation from luminescence (fuel)
Uploaded: 2014-05-23T14:45:00
Duration: 7 min 4 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Step Beyond BRET: Fluorescence by Unbound Excitation from Luminescence FUEL at JoVE.com

فإن الكتاب أود أن أعرب عن امتنانهم للدعم المالي من مؤسسة باستور نيويورك (دينار، CS، CS)، والاتحاد الأوروبي FP7 برنامج &quot;أتمتة&quot; (لSLS)، وبرنامج معهد كارنو 11 (دينار، ه ، AR، RT، SLS) ومشروع IMNOS (لRT، SLS)، ومؤسسة كوني-مافي الخيرية (SLS)، والماجستير الأوروبي في التصوير الجزيئي (لتقنية المعلومات)، وبرامج منطقة إيل دو فرانس MODEXA (SLS)، السمسم (SLS) وDimMalInf (SLS، RT)، وكالة الاستخبارات الوطنية برنامج جراند INVESTISSEMENT DE L&#39;AVENIR البنى التحتية Nationales أون البيولوجيا-سانتي: فرنسا LifebioImaging (FLI) فرنسا الحياة التصوير (RT، SLS)، فرنسا Bioimaging (دينار، SLS) و معهد باستور في باريس. علاوة على ذلك، فإن الكتاب أود أن أشكر، خوسيه Bengoechea وهربرت شفايتزر للمواد. علاوة على ذلك، فإن الكتاب أود أن أشكر سيندي فيفر الذي ولدت الأجسام المضادة.

1. الكواشف <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شراء أو تطوير البكتيريا الانارة وسائل الإعلام والثقافة المناسبة مثل تعديل القولونية التعبير عن ABCDE لوكس 21، الضمة fischeri، اللميعة س. الكلبسيلة الرئوية 22. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد المالحة الفسيولوجية (0.9٪ كلوريد الصوديوم) والحلول سائل الإعلام والثقافة وفقا لصفات القياسية. E. القولونية وK. كانت تزرع في لوريا BERTANI الرئوية (LB) عند 37 درجة مئوية، وV. fischeri واللميعة س في LB تستكمل مع 0.5 M كلوريد الصوديوم في 22 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شراء أو الاستحواذ على تحقيقات الفلورسنت مثل Q-705 تعقب (40 نانومتر قطر، ويشار إلى QD705)، Q-800 تعقب (40 نانومتر قطر، ويشار إلى QD800)، فلوري (40 نانومتر قطر) والمجهرية البوليسترين غير الفلورسنت ( 48 قطرها نانومتر)، والأصباغ الفلورية التقليدية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد الكواشف اللازمة لوضع العلامات البكتيرية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضمان الوصول إلىككل تصوير تلألؤ بيولوجي الحيوان، مثل الطيف IVIS، التي هي قادرة على الكشف عن إشارة تحت مجموعة واسعة من الأطوال الموجية الانبعاثات ومرات التعرض. وهناك قارئ لوحة قادرة على قياسات تلألؤ بيولوجي تكفي لمعظم التجارب الموصوفة هنا. </li></ol> 2. خلاصة أساسية FUEL <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بدءا من المستعمرات الفردية على لوحات ثقافة القياسية، بدء الثقافات بين عشية وضحاها من البكتيريا الانارة. هنا، V. واستخدمت fischeri. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اليوم من التجريب، والشروع في ثقافات فرعية جديدة، والسماح لهم للتقدم حتى يتحقق على OD 600 من 1-1.5. من أجل تحقيق نتائج قابلة للمقارنة فمن الأفضل لاستخدام البكتيريا في نمو مماثل في الدول التي تنتج إشارات مكثفة. هذا لا يمكن ضمانه عن طريق الحفاظ على OD 600 ثابتة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الجمع بين aliquots من 100 ميكرولتر من كل سواء مع 5 ميكرولتر من QD705 أو المالحة الفسيولوجية (PS)، ثم قم بإضافة إلى 895 ميكرولتر من PS إلى standacuvettes الثالثة الطيفية. ضع cuvettes شغل في الطيف IVIS وتأخذ القياسات تحت مجموعات التصفية المناسبة. هنا، تم استخدام تصفية الانبعاثات 710-730 نانومتر. </li></ol> 3. FUEL أكثر متفاوتة المسافات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ملء اثنين من انخفاض حجم (1 مل) cuvettes الضوئية البلاستيكية التي تحتوي على إما 50 ميكرولتر من QD705 أو 97.2 ميكرولتر من غير الفلورسنت 48 نانومتر المجهرية البوليسترين في إجمالي حجم 1 مل PS. وهذا يضمن مساحة مماثلة الصلبة في الحجم الكلي بين الكيانين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد كفيت مصدر الضوء عن طريق التغليف كوفيت الثالث مع الشريط الأسود القياسي أو بعض المواد الأخرى مبهمة قادرة على حجب الضوء. إعداد بعناية نافذتين البصرية متطابقة على طرفي نقيض من كفيت. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضع cuvettes شغل في السابق مباشرة على جانبي كفيت مصدر الضوء. إضافة قسامة 1 مل من V. ثقافة fischeri أو غيرها (أي كولاي أو الانارة اللميعة قع) من ثقافة فرعية جديدة في كفيت مصدر الضوء، وتغطية ذلك مع مادة مبهمة، مثل ورقة سوداء للحد من أي تلوث الضوء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تصور cuvettes الثلاث في إطار المرشحات الانبعاثات المناسبة مثل ضوء إجمالي و710-730 المرشحات الانبعاثات نانومتر، مع أوقات التعرض لل10، 30، و 30 ثانية، على التوالي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعادة كلا cuvettes الخارجية على مسافات أبعد ما يعادلها من كفيت المركزية، ومن ثم تصور مرة أخرى. كرر حتى يتم التوصل إلى مسافة النهائي وجها لوجه (المركزي إلى انخفاض حجم كفيت) من 3CM. في كل خطوة، والحصول على صورة مضان (450-480 نانومتر الإثارة، 710-730 الانبعاثات نانومتر) للتحقق من صحة موقع QD705. </li></ol> 4. التحقيق أزواج FUEL المحتملة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ملء اثنين من خفض حجم cuvettes مع 1 مل تحتوي على حلول إما fluorophore أو جسيمات متناهية الصغر الفلورسنت من الفائدة في واحد، وPS أو PS مع الجسيمات النانوية غير الفلورسنت مثل سيطرة سلبية في الآخر. في الأظهرت أعمال الإلكترونية هنا، تم التحقيق في مجموعة متنوعة من إمكانات fluorophores FUEL المتاحة تجاريا والنانوية الفلورسنت على النحو المبين في الجدول 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة قسامة 1 مل من V. جديدة fischeri أو البكتيريا الانارة أخرى إلى كفيت ثالث ظلام دامس تحتوي على نافذتين الضوئية تساوي جسديا تقع على طرفي نقيض. تغطية كفيت مع مادة مبهمة مثل قطعة من الورق الأسود. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في مكان بعد مسافة قصيرة ولكن على قدم المساواة انخفاض اثنين من حجم cuvettes على جانبي كفيت-ظلام دامس وتصور تحت الفلاتر المناسبة. هنا، تم استخدام مسافة 0.7 سم. أكرر مع fluorophores الأخرى. </li></ol> 5. FUEL المستهدفة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد الأجسام المضادة البيروكسيديز محددة للبكتيريا الانارة. على سبيل المثال، الأجسام المضادة الأولية هنا محددة لK. تم المعقدة البيروكسيديز الرئوية (α-كيمبرلي) باستخدام محلول يحتوي على EZ-رابط سلفو-NHS-LC-البيوتين. </lط&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة كاشف الزائدة من الأجسام المضادة باستخدام الأعمدة تحلية تحت الطرد المركزي (1،500 x ج) لمدة 2 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام برادفورد مقايسة القياسية لتحديد تركيز البروتين وتحديد درجة الضد biotinylation بواسطة HABA الفحص. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحصول على الضد البيروكسيديز α-KP-بيو (أب) دفعات عن طريق خلط 100 ميكرولتر (10 ملي، وحلت في برنامج تلفزيوني 1X) مع 40 ميكرولتر α-كيمبرلي الأجسام المضادة، مما أدى إلى درجة النهائي إحلال 16 بقايا البيوتين في أب والنهائي تركيز البروتين من 10 ملغ مل -1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام متعددة الثقافات بين عشية وضحاها تكرار، تستهدف البكتيريا غسلها مع الأجسام المضادة المذكورة آنفا التالية البروتوكول المناسب. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> على وجه التحديد، وغسل K. الرئوية في برنامج تلفزيوني 1X، وresuspend في برنامج تلفزيوني 1X إلى OD من 4 (حوالي 4 × 10 8 كفو مل -1 OD -1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لكل تكرار، واحتضان 100 ميكرولتر PBS، α -الأجسام المضادة KP (10 ميكرولتر α-KP-biotB أو 10 ميكرولتر PBS للتحكم)، و 100 ميكرولتر الخلايا لمدة 90 دقيقة في 30 درجة مئوية. غسل الخلايا ثلاث مرات في برنامج تلفزيوني 1X، وresuspend في 196 ميكرولتر PBS. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تسمية الخلايا مع المكورات QD705 streptavidin وتقسيمها إلى مجلدين ما يعادلها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يغسل حل واحد ثلاث مرات وresuspend ثم فإنه في حجم مناسب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> توزيع 100 ميكرولتر من الحلول غسلها وغير مغسولة في الآبار الفردية للأسود لوحة 96 جيدا. قياس التلألؤ الناتجة تحت الضوء إجمالي، 490-510 نانومتر، والمرشحات 710-730 نانومتر. يمكن تحديد تركيز Fluorophore باستخدام 450-480 نانومتر الإثارة وانبعاث 710-730 نانومتر. </li></ol>

<ol>
	<li>Hu, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+human+immunodeficiency+virus+type+1+protease+biosensor+assay+using+bioluminescence+resonance+energy+transfer.">A human immunodeficiency virus type 1 protease biosensor assay using bioluminescence resonance energy transfer.</a> J Virol Methods. 128, 93-103 (2005).</li><li>Contag, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+gene+expression+in+living+mammals+using+a+bioluminescent+reporter.">Visualizing gene expression in living mammals using a bioluminescent reporter.</a> Photochem Photobiol. 66, 523-531 (1997).</li><li>Badr, C. E., Tannous, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioluminescence+imaging:+progress+and+applications.">Bioluminescence imaging: progress and applications.</a> Trends in Biotechnology. 29, 624-633 (2011).</li><li>Maywood, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+core+circadian+feedback+loop+in+suprachiasmatic+nucleus+of+mCry1-luc+transgenic+reporter+mouse.">Analysis of core circadian feedback loop in suprachiasmatic nucleus of mCry1-luc transgenic reporter mouse.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 110, 9547-9552 (2013).</li><li>Condeelis, J., Weissleder, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vivo+Imaging+in+Cancer.">In Vivo Imaging in Cancer.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. , (2010).</li><li>Madero-Visbal, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioluminescence+imaging+correlates+with+tumor+progression+in+an+orthotopic+mouse+model+of+lung+cancer.">Bioluminescence imaging correlates with tumor progression in an orthotopic mouse model of lung cancer.</a> Surgical Oncology. 21, 23-29 (2012).</li><li>Thalhofer, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+transgenic+Leishmania+parasites+in+a+live+host.">In vivo imaging of transgenic Leishmania parasites in a live host.</a> J Vis Exp. 10, (2010).</li><li>Troy, T., Jekic-McMullen, D., Sambucetti, L., Rice, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+comparison+of+the+sensitivity+of+detection+of+fluorescent+and+bioluminescent+reporters+in+animal+models.">Quantitative comparison of the sensitivity of detection of fluorescent and bioluminescent reporters in animal models.</a> Molecular Imaging: Official Journal of the Society for Molecular Imaging. 3, 9-23 (2004).</li><li>Michelini, E., Cevenini, L., Mezzanotte, L., Roda, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Luminescent+probes+and+visualization+of+bioluminescence.">Luminescent probes and visualization of bioluminescence.</a> Methods Mol Biol. 574, 1-13 (2009).</li><li>Branchini, B. R., Ablamsky, D. M., Rosenberg, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemically+Modified+Firefly+Luciferase+Is+an+Efficient+Source+of+Near-Infrared+Light.">Chemically Modified Firefly Luciferase Is an Efficient Source of Near-Infrared Light.</a> Bioconjugate Chemistry. 21, 2023-2030 (2010).</li><li>Saito, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Luminescent+proteins+for+high-speed+single-cell+and+whole-body+imaging.">Luminescent proteins for high-speed single-cell and whole-body imaging.</a> Nat Commun. 3, 1262 (2012).</li><li>Dragulescu-Andrasi, A., Chan, C. T., De, A., Massoud, T. F., Gambhir, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioluminescence+resonance+energy+transfer+(BRET)+imaging+of+protein-protein+interactions+within+deep+tissues+of+living+subjects.">Bioluminescence resonance energy transfer (BRET) imaging of protein-protein interactions within deep tissues of living subjects.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 108, 12060-12065 (2011).</li><li>Bacart, J., Corbel, C., Jockers, R., Bach, S., Couturier, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+BRET+technology+and+its+application+to+screening+assays.">The BRET technology and its application to screening assays.</a> Biotechnology Journal. 3, 311-324 (2008).</li><li>So, M. -. K., Xu, C., Loening, A. M., Gambhir, S. S., Rao, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-illuminating+quantum+dot+conjugates+for+in+vivo+imaging.">Self-illuminating quantum dot conjugates for in vivo imaging.</a> Nat Biotechnol. 24, 339-343 (2006).</li><li>Wu, Q., Chu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-illuminating+quantum+dots+for+highly+sensitive+in+vivo+real-time+luminescent+mapping+of+sentinel+lymph+nodes.">Self-illuminating quantum dots for highly sensitive in vivo real-time luminescent mapping of sentinel lymph nodes.</a> Int J Nanomedicine. 7, 3433-3443 (2012).</li><li>Wu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+far-red+luminescence+imaging+of+a+biomarker+based+on+BRET+from+Cypridina+bioluminescence+to+an+organic+dye.">In vivo far-red luminescence imaging of a biomarker based on BRET from Cypridina bioluminescence to an organic dye.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 106, 15599-15603 (2009).</li><li>Piston, D. W., Kremers, G. -. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+protein+FRET:+the+good,+the+bad+and+the+ugly.">Fluorescent protein FRET: the good, the bad and the ugly.</a> Trends Biochem Sci. 32, 407-414 (2007).</li><li>Dragavon, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=in+Imaging,+Manipulation,+and+Analysis+of+Biomolecules,+Cells,+and+Tissues.">in Imaging, Manipulation, and Analysis of Biomolecules, Cells, and Tissues.</a> , 790210-790219 (2011).</li><li>Dragavon, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+excitation+of+nanoparticles+using+luminescent+bacteria.">In vivo excitation of nanoparticles using luminescent bacteria.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 109, 8890-8895 (2012).</li><li>Holland, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+characterization+of+fluorescence+by+unbound+excitation+from+luminescence:+Broadening+the+scope+of+energy+transfer.">In vitro characterization of fluorescence by unbound excitation from luminescence: Broadening the scope of energy transfer.</a> Methods. , (2013).</li><li>Choi, K. -. H., Schweizer, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mini-Tn7+insertion+in+bacteria+with+single+attTn7+sites:+example+Pseudomonas+aeruginosa.">mini-Tn7 insertion in bacteria with single attTn7 sites: example Pseudomonas aeruginosa.</a> Nat. Prot. 1, 153-161 (2006).</li><li>Riottot, M. M., Fournier, J. M., Jouin, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+evidence+for+the+involvement+of+capsular+polysaccharide+in+the+immunoprotective+activity+of+Klebsiella+pneumoniae+ribosomal+preparations.">Direct evidence for the involvement of capsular polysaccharide in the immunoprotective activity of Klebsiella pneumoniae ribosomal preparations.</a> Infect Immun. 31, 71-77 (1981).</li><li>Becker, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+lifetime+imaging--techniques+and+applications.">Fluorescence lifetime imaging--techniques and applications.</a> J Microsc. 247, 119-136 (2012).</li><li>Rogers, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+local+Ca2++dynamics+with+genetically+encoded+bioluminescent+reporters.">Visualization of local Ca2+ dynamics with genetically encoded bioluminescent reporters.</a> Eur J Neurosci. 21, 597-610 (2005).</li><li>Dubochet, J., McDowall, A. W., Menge, B., Schmid, E. N., Lickfeld, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+microscopy+of+frozen-hydrated+bacteria.">Electron microscopy of frozen-hydrated bacteria.</a> Journal of Bacteriology. 155, 381-390 (1983).</li><li>Graham, L. L., Harris, R., Villiger, W., Beveridge, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Freeze-substitution+of+gram-negative+eubacteria:+general+cell+morphology+and+envelope+profiles.">Freeze-substitution of gram-negative eubacteria: general cell morphology and envelope profiles.</a> Journal of Bacteriology. 173, 1623-1633 (1991).</li><li>Hobot, J. A., Carlemalm, E., Villiger, W., Kellenberger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Periplasmic+gel:+new+concept+resulting+from+the+reinvestigation+of+bacterial+cell+envelope+ultrastructure+by+new+methods.">Periplasmic gel: new concept resulting from the reinvestigation of bacterial cell envelope ultrastructure by new methods.</a> Journal of Bacteriology. 160, 143-152 (1984).</li></ol>

يعلن الكتاب المصالح المالية المتنافسة. ساهم دينار، SB، KLR وSLS لEP10290158.4 الأوروبي للبراءات والمنظمة العالمية للملكية الفكرية براءات الاختراع التطبيق WO/2011/117847.

لا يمكن أن يتحقق المظاهرة الأساسية للFUEL ببساطة عن طريق خلط البكتيريا مع الانارة الفلورسنت النانوية أو QDS. سيتم الكيانين المنفصلين جسديا وتظل أبعد من أي مسافة RET كفاءة. أكثر صعوبة هو الوقود إشارة الأمثل سواء في التجارب المختبرية والحية. تحت ظروف في المختبر، مع ودون امتصاص البصرية الحاضر على حد سواء، وعادة إضافة fluorophore الزائدة سوف تكون كافية لتحقيق أقصى قدر من الاستجابة FUEL. ومع ذلك، في تركيزات عالية ظواهر مثل تبريد ثابت أو الاصطدامية يمكن أن يؤدي إلى فقدان إشارة الفلورسنت. سوف إجراء سلسلة التخفيف بشكل مستقل من قبل متفاوتة تركيز مصدر الانارة وfluorophore تساعد على تحسين تركيز المطلوب. إنشاء والأمثل للوقود تحت تركيزات في الجسم الحي هو أكثر صعوبة وتحتاج إلى معالجة على أساس كل حالة على حدة. يمكن أن يكون من الصعب خلق التعاون<html> ndition حيث يمكن الوصول إلى كيان الفلورسنت بصريا من المصدر الانارة. على هذا النحو، بدءا شارك الحقن المباشر للالأنصاف اثنين يمكن أن توفر معلومات بشأن نجاح FUEL تحت الظروف المثلى. وجود بروتوكولات موحدة لوضع العلامات البكتيريا والخلايا حقيقية النواة مع الكيانات الفلورسنت مثل سلسلة اليكسا وQDS. وغالبا ما يتطلب هذا functionalization السطح أو التنشيط مع الأجسام المضادة، التي يمكن أن تؤدي إلى آثار غير مرغوب فيها مثل تخفيض بقاء الخلية أو تغيير النشاط الأيضي. للتغلب على هذا، فمن المهم لتحديد المبلغ الأمثل من الأجسام المضادة أو وكيل التنشيط اللازمة التي تقلل من الاضطرابات الخلوية مع تعظيم وضع العلامات الفلورية. استخدام QDS هو مفيد لما لها من أطياف واسعة مميز الإثارة والضيقة والانضباطي أطياف الانبعاثات، وإمكانية تحول كبير ستوكس. ومع ذلك، يمكن أن تكون سامة للخلايا وQDS قد لا يكون مرغوبا فيه في بعض الحالات. الطبقة = &quot;jove_content&quot;&gt; FUEL هو ظاهرة موجودة في العديد من التجارب بريت 13 وينطبق على مجموعة متنوعة من الانارة ومصادر الفلورسنت. حتى الآن، كانت تعتبر الفوتونات الناتجة عن الوقود المنتج من التفاعلات غير محددة أو إشارة الخلفية المؤسفة الناتجة عن سوء تصميم التجارب بريت. مع أنها ليست سوى نوع من التجارب أظهرت هنا أن كنا قادرين على تحديد مدى فائدة هذه الإشارة غير المرغوب فيها. في الأمثلة المعروضة، والبكتيريا الانارة بمثابة مصدر الإثارة منتشر قادرة على انتزاع استجابة الفلورسنت القياسية من مجموعة واسعة من الكيانات الفلورسنت. علاوة على ذلك، نظرا لبعد المسافة عمل كبيرة، وأنها آمنة لإبرام أنه في حين أن وقود يمكن بناؤها دون وقوع بريت، بريت في العام لا يمكن ملاحظتها دون مساهمة من الوقود. الأهم من ذلك، نظرا لعدم وجود شرط الاستهداف، FUEL يمكن استخدامها لتغطية الفجوة المكانية القائمة بين بريت وجتقنيات التصوير كله والحيوان onventional.

التعديل الجيني للكائنات، مثل الفيروسات 1، 2، 3 البكتيريا، أو الثدييات الصغيرة 4 إلى إما لحث أو تلألؤ بيولوجي صريحة جوهري، كان ناجحا للغاية وأظهر على نطاق واسع 5-7. تلألؤ بيولوجي، رد فعل في الجسم الحي chemiluminescent تنطوي على الكواشف التي تحدث بشكل طبيعي، لديه ميزة إنتاج الضوء دون الحاجة إلى مصدر ضوء خارجي. على هذا النحو، لا تعاني التصوير إضاءة الحيوية من العيوب شيوعا من السيارات وغير محددة وجدت إشارة من مضان التصوير 8. بالتالي، تلألؤ بيولوجي لديها نسبة كبيرة إشارة إلى الضوضاء لأن أي إشارة الكشف عن تنبع فقط من مصدر المقصود. بينما العديد من النماذج استغلت الاوبرون لوكس من luminescens Photorhabdus (الحد الأقصى الانبعاثات تركزت بين 480 و 490 نانومتر) لفي المختبر والمجراة في التطبيقات 9، واستخدامه في مام الصغيرةوكان المرض إشكالية نظرا لطبيعة الظروف التصوير؛ وجود السائد من امتصاص البصرية، مثل الهيموجلوبين، وكلاء نثر، مثل الأنسجة والعظام، وتؤثر بقوة الأزرق لموجات الأصفر 3. تعبير عن يراعة luciferase هندسيا (الحد الأقصى للانبعاثات في 617nm) تم تطويره مؤخرا وأدرجت، وتوفير الأداة التي يتغلب بشكل كبير امتصاص البصرية 10، ولكن لا تزال تخضع لنثر الآثار. ردا على ذلك، كانت هناك محاولات متعددة لتحويل الحمراء المنبعثة إشارة إلى إطار بصري المطلوب من 650-900 نانومتر، وهي منطقة من امتصاص التقليل والتشرذم، وذلك باستخدام الرنين تلألؤ بيولوجي نقل الطاقة (بريت) 11-13. كأداة لتعزيز الكشف عن إشارة، بريت، والذي يستخدم مصدرا للإضاءة الحيوية مثل المانحة وأضاف fluorophore كما متقبل، وقد وجدت نجاحا محدودا. كمثال المنوية من هذه الظاهرة &quot;، أو النقاط الكم إلقاء الضوء على النفس4؛ (SIQDs) 14 تتكون من تعديل Renilla كلوية الشكل luciferases منضمة إلى طبقة البوليمر يسين الخارجية نقاط الكم المتاحة تجاريا (QDS). بالإضافة إلى ذلك على الركيزة، فإن رد الفعل للإضاءة الحيوية الناتجة يدفع الانبعاثات مضان من QDS، وتوليد إنتاج كبير من الفوتونات الحمراء. ومع ذلك، فإن هذه SIQDs تقتصر على تطبيق التصور في الجسم الحي من الأحداث ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية. ومن المرجح نظرا لصعوبة ربط التحقيق المزدوج إلى الجهاز، الخلية أو الجينات في المصالح، لأن SIQDs لا يمكن ترميز وراثيا وبالتالي يتطلب تعديل الثانوية للقذيفة البوليمر هذا محدودة التطبيق. لتحسين قابليتها للتطبيق، SIQDs البديلة، حيث لا بد من luciferases مباشرة إلى جوهر الانارة، وقد تم مؤخرا توظيف 15. بناء الخروج من مفهوم SIQD، تم التوصل إلى نظام بريت أكثر قابلية للتطبيق عن طريق ربط Cypridina luciferase المراسل إلى فيdocyanine صبغ 16، والتي كانت قادرة على استهداف تحديدا الاورام في الفئران بينما تنتج تحولا حمراء كبيرة من 460 نانومتر إلى 675 نانومتر. للخضوع لنقل الطاقة غير الإشعاعية، بريت يتبع نفس القيود الأولية مثل نظيرتها الفلورسنت: يجب أن يكون هناك تداخل الطيفية القوية بين الانبعاثات المانحة ومتقبل أطياف الإثارة والمسافة العمل بين الأنصاف اثنين يجب أن يكون بناء على أمر من فورستر دائرة نصف قطرها (5-14 نانومتر اعتمادا على الزوج المانحين متقبل، مع أقصى مسافة الفعال لضعف نصف قطر فورستر 17). هذا الاعتماد مسافة يحد كثيرا من أنواع الأحداث التي يمكن ملاحظتها باستخدام بريت كوسيلة لتعزيز الكشف. مؤخرا تم تحديد نهج جديد وتظاهر تحت حد سواء في المختبر وفي ظروف الجسم الحي. بناء قبالة أساس بريت، الإسفار عن طريق الإثارة غير منضم من التلألؤ (FUEL) 18، 19 </suع&gt; أيضا يتطلب التداخل الطيفي قوية بين الانارة ومكونات الفلورسنت. ولكن، خلافا بريت، FUEL هو عملية الإشعاعي تماما حيث يتم امتصاص الفوتون المنبعث من مصدر الانارة من قبل fluorophore الوصول بصريا، والتي تنبعث بعد ذلك الفوتون الأحمر تحول وفقا لالكم العائد fluorophore. أقرب إلى بريت، ويمكن أيضا أن تستخدم هذا النهج من أجل التغلب على معوقات التصوير في وجود امتصاص البصرية. يوفر التحول الأحمر مما أدى إلى زيادة شاملة وخصوصية في إشارة الكشف يرجع ذلك إلى تراجع في تخفيف والحد من آثار تشتت بصري. وقد تم الإبلاغ عن وقود لتحدث بين القولونية إضاءة الحيوية معربا عن الاوبرون لوكس وQDS 18، 19. بينما مماثلة تجريبيا لSIQDs، والفرق الأساسي موجود: في FUEL، فإنه ليس من الضروري لمصدر الانارة ليكون جسديا منضمة إلى fluorophore، والذي يسمح للص الترميز الوراثي لجنة التحقيق الانارة. ويرجع ذلك إلى الكشف الناجح لFUEL بين البكتيريا الانارة وQDS، فمن الممكن أن هذه التقنية يمكن تطبيقها على كلا سطحي (الجلد) والأنسجة العميقة (الرئة، الكبد) مثل التهابات المكورات العنقودية الذهبية وKlebsiellia الرئوية. منذ تقرير أهميتها التجريبية، تطورت لتشمل FUEL نموذج رياضي قوي 20 التي يمكن استخدامها للتنبؤ الانارة مقبولة وأزواج الفلورسنت، وتوسعت لتشمل تطبيقاتها استخدامها في تحديد خصائص photophysical مثل العائد الكم. وصفنا أدناه بعض التقنيات الأساسية من الوقود. الأولى، وتبين لنا الدليل على هذه الظاهرة على حد سواء قصيرة (ميكرون) والطويلة (سم) المسافات العمل، والذي يميز جوهريا FUEL من بريت. الثانية، ونوسع على أزواج FUEL ممكن من خلال دراسة مجموعة واسعة من fluorophores والنانوية الفلورسنت. حجابهند، ويتم التحقيق تطبيقات FUEL بمقارنة أزواج FUEL المستهدفة وغير المستهدفة.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:764px;" width="764">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:175px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="2" height="21" style="height:21px;">Escherichia coli expressing the luxABCDE operon&#160;</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>kindly provided by Jos&#233; A. Bengoechea with permission from Herbert P. Schweizer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Klebsiella pneumoniae 52145&#160;</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>52145 is a serotype K2 reference strain</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Luria Bertani (LB)&#160;</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>standard growth media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Q-Tracker 705&#160;</td>
			<td style="width:175px;">Life Sciences</td>
			<td>Q21061MP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Q-Tracker 800</td>
			<td style="width:175px;">Life Sciences</td>
			<td>Q21071MP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Alexa 555</td>
			<td style="width:175px;">Life Sciences</td>
			<td style="width:119px;">S21381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Alexa 568</td>
			<td style="width:175px;">Life Sciences</td>
			<td style="width:119px;">S11226</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Alexa 633</td>
			<td style="width:175px;">Life Sciences</td>
			<td style="width:119px;">S21375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Alexa 700</td>
			<td style="width:175px;">Life Sciences</td>
			<td style="width:119px;">S21383</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Non-fluorescent microspheres</td>
			<td style="width:175px;">Polysciences, Inc</td>
			<td align="right" style="width:119px;">15913</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Pink microspheres</td>
			<td style="width:175px;">Life Sciences</td>
			<td>F8887</td>
			<td>40nm diameter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">yellow microspheres</td>
			<td style="width:175px;">Life Sciences</td>
			<td style="width:119px;">F8888</td>
			<td>40nm diameter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Ivis Spectrum</td>
			<td style="width:175px;">PerkinElmer</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin</td>
			<td style="width:175px;">Thermo Scientific Pierce</td>
			<td align="right">21425</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Zeba Spin Desalting Columns 7K MWCO</td>
			<td style="width:175px;">Thermo Scientific Pierce</td>
			<td align="right">21425</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HABA assay kit&#160;</td>
			<td style="width:175px;">Thermo Scientific Pierce</td>
			<td align="right">28005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Bradford assay</td>
			<td style="width:175px;">Bio-Rad</td>
			<td>500-0201</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a step beyond bret: fluorescence by unbound excitation from luminescence (fuel)

مضان من قبل غير منضم الإثارة من التلألؤ (FUEL) هو عملية الإثارة الانبعاثات الإشعاعية التي تنتج زيادة إشارة وتعزيز التباين في التجارب المختبرية والحية. أسهم FUEL الكثير من نفس المبادئ الأساسية كما نقل الطاقة الرنين ضوء بارد (بريت)، ولكن يختلف كثيرا في العمل لمسافات مقبولة بين مصدر الانارة والكيان الفلورسنت. بينما بريت تقتصر على نحو فعال إلى حد أقصى قدره 2 مرات في دائرة نصف قطرها فورستر، عادة أقل من 14 نانومتر، ويمكن أن يحدث FUEL على مسافات تصل الى ميكرون أو حتى سم في حالة عدم وجود امتصاص البصرية. نحن هنا على اساس توسيع وتطبيق FUEL من خلال استعراض المبادئ ذات الصلة وراء هذه الظاهرة وإظهار توافقه مع مجموعة واسعة من fluorophores والنانوية الفلورسنت. أبعد من ذلك، هو استكشاف جدوى استهداف الأجسام المضادة FUEL. الأمثلة المعروضة هنا تقدم دليلا على أن وقود يمكن استخدامها لتطبيق ورقةications حيث بريت غير ممكن، وملء الفراغ المكاني القائم بين بريت والتصوير الحيوان كله التقليدية.

Watch this Scientific Journal Video about A Step Beyond BRET: Fluorescence by Unbound Excitation from Luminescence FUEL at JoVE.com

A Step Beyond BRET: Fluorescence by Unbound Excitation from Luminescence FUEL

توسيع المؤسسة وتطبيق الإسفار عن طريق الإثارة غير منضم من التلألؤ (FUEL) من خلال المسح إلى المبادئ ذات الصلة ومما يدل على توافقه مع العديد من fluorophores وظروف استهداف الأجسام المضادة.

خطوة أبعد بريت: الإسفار عن طريق الإثارة غير منضم من التلألؤ (FUEL)

Fluorescence by Unbound Excitation from Luminescence (FUEL) is a radiative excitation-emission process that produces increased signal and contrast ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

A Step Beyond BRET: Fluorescence by Unbound Excitation from Luminescence (FUEL)

Thermodynamics of Membrane Protein Folding Measured by Fluorescence Spectroscopy

الديناميكا الحرارية من البروتين للطي غشاء المقاسة بواسطة التحليل الطيفي الإسفار

Membrane protein folding is an emerging topic with both fundamental and health-related significance.  The abundance of membrane proteins in cells ...

Fluorescence Lifetime Imaging of Molecular Rotors in Living Cells

مضان التصوير عمر الدوار الجزيئية في الخلايا الحية

Diffusion is often an important rate-determining step in chemical reactions or biological processes and plays a role in a wide range of intracellular ...

Generation and Recovery of &beta;-cell Spheroids From Step-growth PEG-peptide Hydrogels

Generation and Recovery of ÃƒÅ½Ã‚Â²-cell Spheroids From Step-growth PEG-peptide Hydrogels

جيل واسترداد خلايا β الأجسام الشبه الكروية من الهلاميات المائية PEG-الببتيد الخطوة النمو

Hydrogels are hydrophilic crosslinked polymers that provide a three-dimensional  microenvironment with tissue-like elasticity and high permeability for  ...

High-resolution Spatiotemporal Analysis of Receptor Dynamics by Single-molecule Fluorescence Microscopy

عالية الدقة تحليل الزمانية المكانية من مستقبلات حيوية من قبل جزيء واحدة الإسفار الميكروسكوب

Single-molecule microscopy is emerging as a powerful approach to analyze the behavior of signaling molecules, in particular concerning those aspect (e.g., ...

3D Orbital Tracking in a Modified Two-photon Microscope: An Application to the Tracking of Intracellular Vesicles

3D تتبع المداري في التعديل المجهر ثنائي الفوتون: دراسة تطبيقية على تتبع من بين الخلايا الحويصلات

The objective of this video protocol is to discuss how to perform and analyze a three-dimensional fluorescent orbital particle tracking experiment using a ...

From Fast Fluorescence Imaging to Molecular Diffusion Law on Live Cell Membranes in a Commercial Microscope

من السريع إلى التصوير الإسفار الجزيئية قانون إنتشار على أغشية الخلايا الحية في المجهر التجاري

It has become increasingly evident that the spatial distribution and the motion of membrane components like lipids and proteins are key factors in the ...

Engineering 'Golden' Fluorescence by Selective Pressure Incorporation of Non-canonical Amino Acids and Protein Analysis by Mass Spectrometry and Fluorescence

هندسة Fluorescence 'الذهبي' بإدراج الضغط الانتقائي من الأحماض الأمينية غير المقبول وتحليل البروتين الكتلي والأسفار

Fluorescent proteins are fundamental tools for the life sciences, in particular for fluorescence microscopy of living cells. While wild-type and ...

Scalable Fabrication of Stretchable, Dual Channel, Microfluidic Organ Chips

تصنيع قابلة المط ومزدوجة القناة، رقائق موائع جزيئية الجهاز

A significant number of lead compounds fail in the pharmaceutical pipeline because animal studies often fail to predict clinical responses in human ...

Conducting Multiple Imaging Modes with One Fluorescence Microscope

إجراء وسائط تصوير متعددة مع واحد Fluorescence المجهر

Fluorescence microscopy is a powerful tool to detect biological molecules in situ and monitor their dynamics and interactions in real-time. In addition to ...

Visualizing Adhesion Formation in Cells by Means of Advanced Spinning Disk-Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

تصور تشكيل الالتصاق في الخلايا من خلال متقدم الغزل مجهرية Fluorescence انعكاس الداخلية القرص--المجموع

In living cells, processes such as adhesion formation involve extensive structural changes in the plasma membrane and the cell interior. In order to ...