Name: a step beyond bret: fluorescence by unbound excitation from luminescence (fuel)
Uploaded: 2014-05-23T14:45:00
Duration: 7 min 4 s
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Die Autoren möchten ihre Dankbarkeit für die finanzielle Unterstützung aus dem Pasteur-Stiftung in New York, um JD, AH erstrecken (JD, CS, CS), der EU-FP7-Programm &quot;Automation&quot; (SLS), dem Institut Carnot Programm 11 ( , AR, RT, SLS) und Projekt IMNOS (RT, SLS), der Conny-Maeve Charitable Foundation (SLS), die European Masters in Molecular Imaging (IT), der Region Ile-de-France-Programme MODEXA (SLS), SESAME (SLS) und DimMalInf (SLS, RT), der ANR-Programm Grandes Investissement de l&#39;avenir Infrastrukturen Nationales de Biologie-Santé: Frankreich LifebioImaging (FLI) Frankreich Life Imaging (RT, SLS), Frankreich Bioimaging (JD, SLS) und der Institut Pasteur in Paris. Außerdem möchten die Autoren zu danken für Reagenzien, José Bengoechea und Herbert Schweizer. Weiterhin würde die Autoren gerne Cindy Fevre, die die Antikörper erzeugt danken.

1. Reagenzien <ol><li> Kauf oder Leuchtbakterien entwickeln und geeignete Kulturmedien wie modifizierte Escherichia coli die Lux ABCDE 21 exprimieren, Vibrio fischeri, Photobacterium sp. Klebsiella pneumoniae 22. </li><li> Bereiten physiologischer Kochsalzlösung (0,9% NaCl) und Kultur-Media-Lösungen nach Standardrezepturen. E. coli und K. pneumoniae wurden in Luria-Bertani (LB) bei 37 º C gezüchtet und V. und Photobacterium fischeri sp in LB, ergänzt mit 0,5 M NaCl bei 22 ° C. </li><li> Kauf erwerben oder Fluoreszenzsonden wie Q-Tracker 705 (40 nm Durchmesser, die als QD705), Q-Tracker 800 (40 nm Durchmesser, die als QD800), Fluoreszenz (40 nm Durchmesser) und nicht fluoreszierenden Polystyrol-Mikrokügelchen ( 48 nm Durchmesser) und herkömmliche Fluoreszenzfarbstoffe. </li><li> Bereiten Sie die notwendigen Reagenzien für die bakterielle Kennzeichnung. </li><li> Stellen Sie Zugriff aufeine ganze Tier Biolumineszenz-Bildgeber, wie beispielsweise ein IVIS Spectrum, ist, dass in der Lage-Erfassungssignal unter einer Vielzahl von Emissionswellenlängen und Belichtungszeiten. Ein Plattenlesegerät für Biolumineszenz-Messungen wird für die meisten der hier beschriebenen Experimente ausreichen. </li></ol> 2. Zusammenfassung der Grund FUEL <ol><li> Ausgehend von einzelnen Kolonien auf Standard-Kulturplatten, Start-Nacht-Kulturen von Leuchtbakterien. Hier V. fischeri verwendet. </li><li> Der Tag des Experimentierens, initiieren neue Subkulturen und es ihnen ermöglichen, den Fortschritt, bis eine OD 600 von 1 bis 1,5 erreicht. Um vergleichbare Ergebnisse zu erzielen ist es am besten, um Bakterien in ähnlichen Wachstums Staaten, in denen sie intensive Signale erzeugen zu verwenden. Dies kann, indem die OD 600 konstant gewährleistet werden. </li><li> Kombinieren von 100 &amp;mgr; l Aliquots von jeweils entweder 5 ul QD705 oder physiologischer Kochsalzlösung (PS), und dann in 895 ul PS hinzufügen in standard spektroskopische Küvetten. Legen Sie die gefüllte Küvetten in das IVIS Spectrum und die Messungen unter den entsprechenden Filtersätze. Hierbei wurde die 710 bis 730 nm-Emissionsfilter verwendet. </li></ol> 3. FUEL über unterschiedliche Entfernungen <ol><li> Füllen zwei reduzierten Volumen (1 ml) aus Kunststoff photometrischer Küvetten mit entweder 50 ul QD705 oder 97,2 ul nicht-fluoreszierenden 48 nm Polystyrolmikrosphären in einem Gesamtvolumen von 1 ml PS. Dies gewährleistet ähnliche feste Oberfläche pro Volumen zwischen den beiden Einheiten. </li><li> Bereiten Sie eine Lichtquelle Küvette durch einschließen eine dritte Küvette mit Standard-Schwarz-Band oder einem anderen undurchsichtigen Material in der Lage ist, Licht zu blockieren. Zwei identische optische Fenster sorgfältig vorzubereiten auf gegenüberliegenden Seiten der Küvette. </li><li> Legen Sie die zuvor gefüllten Küvetten direkt auf jeder Seite der Lichtquelle Küvette. In einer 1 ml-Aliquot V. fischeri oder andere Kultur (dh Leucht E. coli oder Photobacterium sp) aus einer neuen Subkultur in die Lichtquelle einsetzen und decken Sie es mit einem undurchsichtigen Material, wie schwarzes Papier, jede leichte Verschmutzungen zu reduzieren. </li><li> Visualisieren Sie die drei Küvetten unter den entsprechenden Emissionsfilter wie der Gesamt Licht und 710-730 nm Emissionsfilter, mit Belichtungszeiten von 10, 30 und 30 Sekunden auf. </li><li> Neupositionierung sowohl externe Küvetten bei äquivalenten weiteren Abständen von der zentralen Küvette, und dann wieder zu visualisieren. Wiederholen, bis eine endgültige face-to-face (Zentral reduziert Volumen Küvette) Abstand von 3 cm erreicht. Bei jedem Schritt wird ein Fluoreszenzbild erhalten (450-480 nm Anregung, 710 bis 730 nm Emission), um die Lage QD705 validieren. </li></ol> 4. Untersuchung Mögliche FUEL Pairs <ol><li> Füllen zwei reduzierten Volumen Küvetten mit 1 ml Lösung, die entweder ein Fluorophor oder eine fluoreszierende Nanopartikel von Interesse in einem, oder PS und PS mit nicht-fluoreszierende Nanopartikel als negative Kontrolle in die andere. In the Arbeit zeigte hier eine Vielzahl von potentiellen Handel erhältlich FUEL Fluorophore und Fluoreszenz-Nanopartikel wurden untersucht, wie in Tabelle 1 dargestellt. </li><li> In einer 1 ml-Aliquot frisch V. fischeri oder andere Leuchtbakterien zu einem verdunkelten dritten Küvette mit zwei physikalisch gleiche optische Fenster auf gegenüberliegenden Seiten entfernt. Decken Sie die Küvette mit einem undurchsichtigen Substanz, wie ein Stück schwarzes Papier. </li><li> Bei einem kurzen, aber gleichen Abstand Platz die beiden reduzierten Volumen Küvetten auf beiden Seiten des abgedunkelten Küvette und visualisieren unter den entsprechenden Filter. Hier ist ein Abstand von 0,7 cm wurde verwendet. Wiederholen Sie mit den anderen Fluorophore. </li></ol> 5. Gezielte FUEL <ol><li> Bereiten Sie speziell auf die Leuchtbakterien biotinylierten Antikörpern. Zum Beispiel ist hier primären Antikörper spezifisch an K. pneumoniae (α-Kp) wurden mit einer Lösung, die EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin biotinyliert. </li&gt; <li> Überschüssiges Reagenz von den Antikörpern mit Entsalzungssäulen unter Zentrifugation (1500 × g) für 2 min. </li><li> Verwenden Sie ein Standard-Bradford-Test, um die Proteinkonzentration zu bestimmen und bestimmen den Grad der Antikörper Biotinylierung von HABA-Assay. </li><li> Erhalten, die α-KP-Biot biotinylierten Antikörpers (Ab) Chargen durch Mischen von 100 &amp;mgr; l (10 mM, in 1x PBS) mit 40 ul α-Kp Antikörper, was zu einer endgültigen Substitutionsgrad von 16 Biotinresten pro Ak und einem abschließenden Proteinkonzentration von 10 mg ml -1. </li><li> Die Verwendung mehrerer Kulturen über Nacht zu replizieren, zielen die gewaschenen Bakterien, die mit den oben genannten Antikörpern nach dem entsprechenden Protokoll. <ol><li> Insbesondere, waschen Sie die K. pneumoniae in 1x PBS und Resuspendieren in 1 × PBS auf eine OD von 4 (ca. 4 × 10 8 CFU ml -1 OD -1). </li><li> Für jede Wiederholung, Inkubation 100 ul PBS, α -Kp Antikörper (10 ul α-KP-biotB oder 10 ul PBS für die Kontrolle) und 100 &amp;mgr; l Zellen für 90 min bei 30 ° C. In 1x PBS in 196 ul PBS Waschen Sie die Zellen dreimal, und resuspendieren. </li></ol></li><li> Beschriften Sie die Zellen mit dem QD705 Streptavidin-Konjugat und teilen sie in zwei gleichwertige Bände. </li><li> Drei mal waschen und dann eine Lösung resuspendieren sie in die entsprechende Lautstärke. </li><li> Verteilen von 100 &amp;mgr; l der gewaschenen und ungewaschenen Lösungen in einzelne Vertiefungen einer schwarzen 96-Well-Platte. Messen Sie die resultierende Lumineszenz unter der Gesamt Licht, 490-510 nm und 710-730 nm-Filter. Fluorophorkonzentration kann mit 450 bis 480 nm Anregungs-und 710 bis 730 nm Emission bestimmt werden. </li></ol>

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Die Autoren erklären, konkurrierenden Interessen. JD, SB, KLR und SLS beigetragen Europäischen Patent EP10290158.4 und der Weltorganisation für geistiges Eigentum Patentanmeldung WO/2011/117847.

Die fundamentale Demonstration der FUEL kann einfach durch Mischen mit Leuchtbakterien fluoreszierende Nanopartikel oder Quantenpunkte erreicht werden. Die beiden Elemente werden physisch getrennt und bleiben über jeden effizienten RET Distanz. Schwieriger ist die Kraftstoffsignal Optimierung sowohl in vitro als auch in vivo. Unter in vitro Bedingungen, mit und ohne einem vorhandenen optischen Absorber, üblicherweise die Zugabe eines Überschusses Fluorophor ausreicht, um das Brennstoffverhalten zu maximieren. Bei hohen Konzentrationen Phänomene wie statische oder Stoßlöschung kann zu einem Verlust der Fluoreszenzsignal führen. Durchführen einer Verdünnungsreihe durch unabhängiges Variieren der Konzentration der Leuchtquelle und dem Fluorophor wird helfen, die gewünschten Konzentrationen zu optimieren. Der Aufbau und die Optimierung von FUEL unter in vivo-Konzentrationen ist viel schwieriger und muss auf einer Fall-zu-Fall-Basis behandelt werden. Es kann schwierig sein, ein Co erstellenndition wo die fluoreszierenden Einheit kann optisch durch die Leuchtquelle genutzt werden. Als solche kann beginnend mit Injektionen direkte Zusammenarbeit der beiden Gruppierungen geben Auskunft über den Erfolg der FUEL unter optimalen Bedingungen. Standard-Protokolle existieren zum Etikettieren Bakterien und eukaryontische Zellen mit fluoreszierenden Einheiten wie die Alexa Serie und QD. Oft erfordert dies Funktionalisierung von Oberflächen oder Aktivierung mit Antikörpern, die zu unerwünschten Wirkungen wie die Lebensfähigkeit der Zellen reduziert oder verändert Stoffwechselaktivität führen kann. Um dies zu überwinden, ist es wichtig zu bestimmen, die optimale Menge des Antikörpers oder Aktivierungsmittel benötigt, die zellulären Störungen minimiert und maximiert die Fluoreszenzmarkierung. Die Verwendung von Quantenpunkten ist wegen ihrer charakteristischen breiten Anregungsspektren, schmal und abstimmbare Emissionsspektren und der Möglichkeit, eine große Stokes-Verschiebung von Vorteil. Allerdings können QDs zytotoxischen und nicht wünschenswert sein kann in einigen Fällen. <pclass = &quot;jove_content&quot;&gt; FUEL ist ein Phänomen, das in vielen Experimenten BRET 13 vorhanden ist, und ist für eine Vielzahl von Lumineszenz-und Fluoreszenzquellen. Bis jetzt wurden die Photonen von FUEL resultierenden als das Produkt von nicht-spezifischen Wechselwirkungen oder einem unglücklichen Hintergrundsignal von schlecht gestalteten BRET Experimente ergeben. Es ist nur mit der Art von Experimenten zeigte, dass hier konnten wir die Nützlichkeit dieses unerwünschte Signal zu identifizieren. In den gezeigten Beispielen verhalten sich die Leuchtbakterien als diffuses Anregungsquelle, die zur Auslösung einer Standardfluoreszenzantwort von einer Vielzahl von Fluoreszenzeinheiten. Außerdem ist es aufgrund der erheblichen Arbeitsabstand, ist es sicher zu dem Schluss, dass, während Kraftstoff kann ohne das Auftreten von BRET konstruiert werden, im allgemeinen BRET kann nicht ohne eine Beteiligung FUEL beobachtet werden. Wichtig ist, dass aufgrund des Fehlens eines Zielanforderung kann Brennstoff verwendet, um die räumliche Lücke zwischen BRET und c besteht abzudeckenonventional ganze Tier-Bildgebungsverfahren.

Die gentechnische Veränderung von Organismen wie Viren 1, 2, 3 Bakterien oder kleine Säugetiere 4 bis entweder induzieren oder konstitutiv Biolumineszenz, ist sehr erfolgreich und weithin demonstriert 5-7. Biolumineszenz in vivo eine chemilumineszierende Reaktion, die natürlich vorkommende Reagenzien, hat den Vorteil der Erzeugung von Licht, ohne die Notwendigkeit für eine externe Lichtquelle. Als solches ist die Biolumineszenz-Bildgebung nicht von den gemeinsamen Nachteile der automatischen und nicht-spezifische Signal von Fluoreszenz-Bildgebungs 8 gefunden leiden. Folglich hat die Biolumineszenz ein signifikantes Signal-zu-Rausch-Verhältnis, da jeder erfaßte Signal vom beabsichtigten Quelle stammt ausschließlich. Während viele Modelle haben die lux-Operon aus Photorhabdus luminescens (Emissionsmaximum zwischen 480 und 490 nm zentriert) für in-vitro-und in vivo-Anwendungen 9 genutzt, deren Verwendung in kleinen mammALS ist aufgrund der Natur der Abbildungsbedingungen problematisch; der durchdringenden Existenz von optischen Absorber, wie Hämoglobin und Streumittel, wie Gewebe und Knochen, stark beeinflussen blau nach gelb 3 Wellenlängen. Der Ausdruck eines konstruierten Leuchtkäfer-Luciferase (Emissionsmaximum bei 617 nm) wurde vor kurzem entwickelt und verarbeitet, die für ein Werkzeug, das stark überwindet optische Absorption 10, ist aber noch unter dem Vorbehalt Streueffekte. In Reaktion gab es mehrere Versuche, Rotverschiebung des emittierten Signals in das gewünschte optische Fenster 650-900 nm, einem Bereich minimiert Absorption und Streuung, mit Biolumineszenz-Resonanz-Energie-Transfer (BRET) 11-13. Als Mittel zur Signalerfassung zu verbessern, BRET, die ein Biolumineszenz-Quelle als dem Donor-Fluorophor und einem zusätzlichen als Akzeptor verwendet wurden begrenzte Erfolge verzeichnet. Ein Samen Beispiel für dieses Phänomen, &quot;selbstleuchtende Quantenpunkte4; (SIQDs) 14 bestehen aus modifizierten Renilla reniformis Luciferase mit dem externen Polymer-Lysin-Schicht gebunden von kommerziell verfügbaren Quantenpunkte (QP). Nach Substratzugabe, die resultierende Biolumineszenzreaktion induziert Fluoreszenzemission aus den Quantenpunkten, wodurch eine signifikante Produktion von roten Photonen. Allerdings sind diese SIQDs haben Anwendbarkeit in vivo Darstellung von physiologisch relevanten Ereignisse beschränkt. Diese begrenzte Anwendbarkeit ist wahrscheinlich auf die Schwierigkeiten bei der Verknüpfung der dualen Sonde mit der Organ-, Zell-oder Gen von Interesse, da die SIQDs nicht genetisch codiert werden, und daher wäre eine sekundäre Modifikation der Polymerhülle erforderlich. Um ihre Anwendbarkeit zu verbessern, alternative SIQDs, wo die Luciferasen sind direkt mit dem lumineszierenden Kern gebunden ist, wurden kürzlich 15 eingesetzt. Aufbauend auf der SIQD Konzept wurde ein mehr für BRET-System durch das Anbringen Cypridina Luciferase auf einen dadurch erreichtdocyanine Farbstoff 16, der in der Lage gezielt Tumore in Mäusen während eine beträchtliche Rotverschiebung von 460 nm bis 675 nm war. Nicht-strahlenden Energietransfer durchlaufen ist, folgt BRET die gleichen Einschränkungen wie die primäre Leuchtstoffgegen: es muss eine starke spektrale Überlappung zwischen der Donor-Emission und Akzeptor-Anregungsspektren und der Arbeitsabstand zwischen den beiden Einheiten sein müssen, in der Größenordnung von BE Förster-Radius (5-14 nm in Abhängigkeit von der Donor-Akzeptor-Paar, mit einer wirksamen maximalen Abstand von zweimal der Förster-Radius 17). Diese Abstandsabhängigkeit stark begrenzt die Ereignistypen, die mit BRET als Mittel zur Erkennung zu verbessern beobachtet werden können. Kürzlich wurde ein neuer Ansatz identifiziert und sowohl in vitro als auch in vivo Bedingungen, unter Beweis gestellt. Aufbauend auf den Grundstein für BRET, Fluoreszenz von Unbound Anregung von Lumineszenz (FUEL) 18, 19 </sup&gt; erfordert auch eine starke spektrale Überlappung zwischen der Lumineszenz-und Fluoreszenzkomponenten. Jedoch anders als BRET wird Kraftstoff völlig Strahlungsprozess, wobei die emittierten Photonen von der Leuchtquelle durch eine optisch zugänglichen Fluorophor, das anschließend emittiert ein Photon rotverschoben gemäß der Quantenausbeute Fluorophor absorbiert. Akin zu BRET kann dieser Ansatz auch verwendet, um die Zwänge der Bildgebung in der Gegenwart von optischen Absorber überwunden werden. Die resultierende rote Verschiebung gibt einen Gesamtanstieg und Spezifität in dem erfassten Signal aufgrund einer Abnahme der Dämpfung und eine Verringerung der optischen Streueffekte. Treibstoff wurde berichtet, dass zwischen Biolumineszenz Escherichia coli das lux-Operon und QD 18, 19 exprimieren auftreten. Während experimentell ähnlich den SIQDs besteht ein wesentlicher Unterschied: bei Kraftstoff, ist es nicht notwendig, daß die lumineszierenden Quelle zu sein physikalisch gebunden an das Fluorophor, das ermöglicht for genetischen Kodierung des Leuchtsonde. Aufgrund der erfolgreichen Erkennung von FUEL zwischen Leuchtbakterien und Quantenpunkte ist es möglich, dass diese Technik sowohl oberflächlich (Haut) und tiefe Gewebe (Lunge, Leber) Infektionen wie Staphylococcus aureus und Klebsiellia pneumoniae angewendet werden. Seit dem Bericht seiner experimentellen Bedeutung hat FUEL entwickelt, um eine robuste mathematische Modell 20, die verwendet werden können, um eine akzeptable Lumineszenz-und Fluoreszenzpaare vorherzusagen sind, und ihre Anwendungen haben erweitert, um den Einsatz bei der Identifizierung von photophysikalischen Eigenschaften wie Quantenausbeute aufweisen. Wir beschreiben im Folgenden einige der grundlegenden Techniken der FUEL. Zuerst zeigen wir Beweise für dieses Phänomen über kurz (um) und lang (cm) Arbeitsabstände, die sich grundlegend unterscheidet von FUEL BRET. Zweitens haben wir auf die mögliche Kraftstoffpaare zu erweitern durch die Untersuchung einer Vielzahl von Fluorophoren und fluoreszierende Nanopartikel. Third werden die Kraftstoffanwendungen durch den Vergleich gezielte und nicht gezielte FUEL Paare untersucht.

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		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:175px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="2" height="21" style="height:21px;">Escherichia coli expressing the luxABCDE operon&#160;</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>kindly provided by Jos&#233; A. Bengoechea with permission from Herbert P. Schweizer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Klebsiella pneumoniae 52145&#160;</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>52145 is a serotype K2 reference strain</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Luria Bertani (LB)&#160;</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>standard growth media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Q-Tracker 705&#160;</td>
			<td style="width:175px;">Life Sciences</td>
			<td>Q21061MP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Q-Tracker 800</td>
			<td style="width:175px;">Life Sciences</td>
			<td>Q21071MP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Alexa 555</td>
			<td style="width:175px;">Life Sciences</td>
			<td style="width:119px;">S21381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Alexa 568</td>
			<td style="width:175px;">Life Sciences</td>
			<td style="width:119px;">S11226</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Alexa 633</td>
			<td style="width:175px;">Life Sciences</td>
			<td style="width:119px;">S21375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Alexa 700</td>
			<td style="width:175px;">Life Sciences</td>
			<td style="width:119px;">S21383</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Non-fluorescent microspheres</td>
			<td style="width:175px;">Polysciences, Inc</td>
			<td align="right" style="width:119px;">15913</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Pink microspheres</td>
			<td style="width:175px;">Life Sciences</td>
			<td>F8887</td>
			<td>40nm diameter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">yellow microspheres</td>
			<td style="width:175px;">Life Sciences</td>
			<td style="width:119px;">F8888</td>
			<td>40nm diameter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Ivis Spectrum</td>
			<td style="width:175px;">PerkinElmer</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin</td>
			<td style="width:175px;">Thermo Scientific Pierce</td>
			<td align="right">21425</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Zeba Spin Desalting Columns 7K MWCO</td>
			<td style="width:175px;">Thermo Scientific Pierce</td>
			<td align="right">21425</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HABA assay kit&#160;</td>
			<td style="width:175px;">Thermo Scientific Pierce</td>
			<td align="right">28005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Bradford assay</td>
			<td style="width:175px;">Bio-Rad</td>
			<td>500-0201</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a step beyond bret: fluorescence by unbound excitation from luminescence (fuel)

Fluoreszenz von Unbound Anregung von Lumineszenz (FUEL) ist ein Strahlungs Anregungs-Emissions-Prozess, erhöhte Signal-und Kontrastverbesserung in vitro und in vivo produziert. FUEL teilt viele der gleichen Grundprinzipien wie Biolumineszenz-Resonanz-Energie-Transfer (BRET), jedoch unterscheidet sich stark in den zulässigen Arbeitsabstand zwischen der Leuchtquelle und dem fluoreszierenden Einheit. Während BRET effektiv auf ein Maximum von 2 mal dem Förster-Radius, üblicherweise weniger als 14 nm beschränkt ist, kann Kraftstoff bei Entfernungen von bis zu &amp;mgr; m oder sogar cm in Abwesenheit eines optischen Absorbers erfolgen. Hier werden wir auf das Fundament und die Anwendbarkeit der FUEL erweitern durch die Prüfung des relevanten Prinzipien, die hinter dem Phänomen und zeigen die Kompatibilität mit einer Vielzahl von Fluorophore und fluoreszierende Nanopartikel. Ferner ist die Nützlichkeit der Antikörper-bezogene FUEL sucht. Die hier gezeigten Beispiele belegen, dass FUEL für appl genutzt werdenikationen wo BRET nicht möglich ist, füllt die räumliche Lücke, die zwischen BRET und traditionelle ganze Tierbildgebung existiert.

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A Step Beyond BRET: Fluorescence by Unbound Excitation from Luminescence FUEL

Erweiterung der Grundlagen und Anwendbarkeit der Fluoreszenz von Unbound Anregung von Lumineszenz (FUEL) durch Vermessung der einschlägigen Grundsätze und demonstriert seine Kompatibilität mit einer Vielzahl von Fluorophore und Antikörper-bezogene Bedingungen.

A Step Beyond BRET: Fluoreszenz von Unbound Anregung von Lumineszenz (FUEL)

Fluorescence by Unbound Excitation from Luminescence (FUEL) is a radiative excitation-emission process that produces increased signal and contrast ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

A Step Beyond BRET: Fluorescence by Unbound Excitation from Luminescence (FUEL)

Thermodynamics of Membrane Protein Folding Measured by Fluorescence Spectroscopy

Thermodynamik der Membrane Protein Folding durch Fluoreszenz-Spektroskopie

Membrane protein folding is an emerging topic with both fundamental and health-related significance.  The abundance of membrane proteins in cells ...

Forschung

Biotechnik

Fluorescence Lifetime Imaging of Molecular Rotors in Living Cells

Fluorescence Lifetime Imaging für molekulare Rotoren in lebenden Zellen

Diffusion is often an important rate-determining step in chemical reactions or biological processes and plays a role in a wide range of intracellular ...

Generation and Recovery of &beta;-cell Spheroids From Step-growth PEG-peptide Hydrogels

Generation and Recovery of ÃƒÅ½Ã‚Â²-cell Spheroids From Step-growth PEG-peptide Hydrogels

Erzeugung und Verwertung von β-Zellen Spheroids Von Step-Wachstum PEG-Peptid-Hydrogele

Hydrogels are hydrophilic crosslinked polymers that provide a three-dimensional  microenvironment with tissue-like elasticity and high permeability for  ...

High-resolution Spatiotemporal Analysis of Receptor Dynamics by Single-molecule Fluorescence Microscopy

Hochauflösende Räumlich-zeitliche Analyse der Rezeptordynamik von Einzelmolekül-Fluoreszenzmikroskopie

Single-molecule microscopy is emerging as a powerful approach to analyze the behavior of signaling molecules, in particular concerning those aspect (e.g., ...

3D Orbital Tracking in a Modified Two-photon Microscope: An Application to the Tracking of Intracellular Vesicles

3D-Tracking-Orbital in einer modifizierten Zwei-Photonen-Mikroskop: einen Antrag bei der Verfolgung von intrazellulären Vesikeln

The objective of this video protocol is to discuss how to perform and analyze a three-dimensional fluorescent orbital particle tracking experiment using a ...

From Fast Fluorescence Imaging to Molecular Diffusion Law on Live Cell Membranes in a Commercial Microscope

Von Fast Fluoreszenz-Imaging, um molekulare Diffusion Gesetz über Live Cell Membrane in einem kommerziellen Mikroskop

It has become increasingly evident that the spatial distribution and the motion of membrane components like lipids and proteins are key factors in the ...

Engineering 'Golden' Fluorescence by Selective Pressure Incorporation of Non-canonical Amino Acids and Protein Analysis by Mass Spectrometry and Fluorescence

Engineering-"Golden" Fluoreszenz durch Selektionsdruck Einbeziehung der nicht-kanonischen Aminosäuren und Protein-Analyse durch Massenspektrometrie und Fluoreszenz

Fluorescent proteins are fundamental tools for the life sciences, in particular for fluorescence microscopy of living cells. While wild-type and ...

Scalable Fabrication of Stretchable, Dual Channel, Microfluidic Organ Chips

Skalierbare Fertigung von dehnbar, Dual Channel, mikrofluidischen Orgel Chips

A significant number of lead compounds fail in the pharmaceutical pipeline because animal studies often fail to predict clinical responses in human ...

Conducting Multiple Imaging Modes with One Fluorescence Microscope

Durchführung von mehreren Imaging-Modi mit einem Fluoreszenzmikroskop

Fluorescence microscopy is a powerful tool to detect biological molecules in situ and monitor their dynamics and interactions in real-time. In addition to ...

Visualizing Adhesion Formation in Cells by Means of Advanced Spinning Disk-Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

Visualisierung von Adhäsion Bildung in den Zellen durch erweiterte Spinning-Disk-Total Internal Reflection-Fluoreszenz-Mikroskopie

In living cells, processes such as adhesion formation involve extensive structural changes in the plasma membrane and the cell interior. In order to ...