Name: a step beyond bret: fluorescence by unbound excitation from luminescence (fuel)
Uploaded: 2014-05-23T14:45:00
Duration: 7 min 4 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Step Beyond BRET: Fluorescence by Unbound Excitation from Luminescence FUEL at JoVE.com

Os autores gostariam de alargar a sua gratidão pelo apoio financeiro da Fundação Pasteur de Nova York (a JD, CS, CS), a UE-FP7 Programa &quot;Automação&quot; (a SLS), o Programa de Carnot Institut 11 (de JD, AH , AR, RT, SLS) e Projeto IMNOS (a RT, SLS), a Fundação de Caridade Conny-Maeve (SLS), o mestrado europeu em Imagem Molecular (a ele), os programas Região Ile de France MODEXA (SLS), gergelim (SLS) e DimMalInf (SLS, RT), a ANR Programa Grandes Investissement de l&#39;avenir Infraestruturas Nationales en Biologie-Santé: França LifebioImaging (FLI) França Vida Imagem (RT, SLS), França Bioimaging (JD, SLS) eo Institut Pasteur, Paris. Além disso, os autores gostariam de agradecer, José Bengoechea e Herbert Schweizer para reagentes. Além disso, os autores gostariam de agradecer a Cindy Fevre que gerou os anticorpos.

1. Reagentes <ol><li> Compra ou desenvolver bactérias luminescentes e meios de cultura apropriados, tais como Escherichia coli modificada expressando a ABCDE 21 lux, Vibrio fischeri, Photobacterium sp. Klebsiella pneumoniae 22. </li><li> Prepare uma solução salina fisiológica (NaCl 0,9%) e as soluções de meios de cultura de acordo com receitas-padrão. E. coli e K. pneumoniae foram cultivadas em meio Luria Bertani (LB) a 37 ° C, e V. fischeri e Photobacterium sp em LB suplementado com 0,5 M de NaCl a 22 ° C. </li><li> Aquisição ou adquirir sondas fluorescentes, tais como Q-rastreador 705 (40 nm de diâmetro, que se refere a como QD705), Q-rastreador 800 (40 nm de diâmetro, que se refere a como QD800), fluorescente (40 nm de diâmetro) e microesferas de poliestireno não-fluorescente ( 48 nm de diâmetro), e corantes fluorescentes convencionais. </li><li> Prepare os reagentes necessários para a rotulagem bacteriana. </li><li> Assegurar o acesso aosum gerador de imagens de bioluminescência animal inteiro, tal como um IVIS Spectrum, que é capaz de detectar o sinal em uma ampla gama de comprimentos de onda de emissão e os tempos de exposição. Um leitor de placas capaz de medições bioluminescência é suficiente para a maioria das experiências aqui descritas. </li></ol> 2. Recapitulation Básico de COMBUSTÍVEL <ol><li> A partir de colônias individuais em placas de cultura padrão, comece culturas durante a noite de bactérias luminescentes. Aqui, V. Foram utilizados fischeri. </li><li> No dia da experimentação, iniciar subculturas frescos e permitir-lhes a progredir até uma DO600 de 1-1,5 é alcançado. De modo a produzir resultados comparáveis, é melhor utilizar as bactérias nos estados de crescimento semelhantes em que se produzem os sinais intensos. Isto pode ser assegurado por manter o 600 constante OD. </li><li> Combinar alíquotas de 100 ul de cada, quer com 5 ul de QD705 ou solução salina fisiológica (PS), e, em seguida, adicionar a 895 mL de PS em Standatinas rd espectroscópicas. Coloque as tinas cheias no IVIS Spectrum e tomar as medidas de acordo com as filtros adequados. Aqui, utilizou-se o filtro de emissão de 710-730 nm. </li></ol> 3. Combustível sobre diferentes distâncias <ol><li> Encha dois reduziu o volume (1 ml) fotométricos cuvetes de plástico, quer com 50 ul de QD705 ou 97,2 ul de não fluorescentes 48 nm microesferas de poliestireno, num volume total de 1 ml de PS. Isto assegura semelhante superfície sólida por volume total entre as duas entidades. </li><li> Prepara-se uma cuvete de fonte de luz encerrando uma terceira tina com fita preta padrão ou outro material opaco capaz de bloquear a luz. Preparar-se cuidadosamente duas janelas ópticas idênticas em lados opostos da cuvete. </li><li> Colocar as cuvettes previamente enchidos directamente para qualquer dos lados da tina de fonte de luz. Adicionar uma parte alíquota de 1 ml de V. cultura fischeri ou outra (isto é, E. coli ou luminescente Photobacterium sp) a partir de uma nova subcultura na cuvete de fonte de luz e cobri-lo com um material opaco, tal como o papel preto para reduzir a contaminação de luz. </li><li> Visualize os três tinas sob os filtros de emissão adequadas, tais como a Luz total e 710-730 nm filtros de emissão, com tempos de exposição de 10, 30 e 30 segundos, respectivamente. </li><li> Reposicionar os tinas externas equivalentes a distâncias maiores da cuba central, e, em seguida, visualizar novamente. Repita até uma distância de 3 centímetros definitivo face-a-face (central para reduzir o volume da cuvete) seja alcançada. A cada passo, adquirir uma imagem de fluorescência (excitação 450-480 nm, 710-730 nm de emissão) para validar o local QD705. </li></ol> 4. Investigando pares potenciais COMBUSTÍVEL <ol><li> Encha duas cuvetes de volume reduzido, com soluções de 1 ml contendo quer um fluoróforo ou uma nanopartícula fluorescente de interesse em uma, e PS ou PS com nanopartículas não fluorescentes como o controlo negativo na outra. Em diae trabalho demonstrou aqui, uma variedade de potenciais fluoróforos combustível disponível comercialmente e nanopartículas fluorescentes foram investigadas conforme descrito na Tabela 1. </li><li> Adicionar uma parte alíquota de 1 ml de fresco V. fischeri ou outras bactérias luminescentes para uma terceira tina escurecidas contendo duas janelas ópticas fisicamente iguais situados em lados opostos. Cobrir a cuvete com uma substância opaca tal como uma folha de papel branco. </li><li> A uma curta distância, mas iguais lugar as duas tinas de volume reduzido em ambos os lados da tina escurecidas e visualizar sob os filtros apropriados. Aqui, foi utilizada uma distância de 0,7 cm. Repita com os outros fluoróforos. </li></ol> 5. FUEL alvejado <ol><li> Preparar anticorpos biotinilados específicos para as bactérias luminescentes. Por exemplo, os anticorpos aqui primárias específicas para K. pneumoniae (α-Kp) foram biotinilados utilizando uma solução contendo o EZ-link Sulfo-NHS-LC-biotina. </li&gt; <li> Remover o excesso de reagente a partir dos anticorpos usando colunas de dessalinização sob centrifugação (1500 x g) durante 2 min. </li><li> Usar um ensaio de Bradford padrão para determinar a concentração de proteína e determinar o grau de biotinilação do anticorpo por ensaio HABA. </li><li> Obter o anticorpo biotinilado α-Kp-biot (AB) por mistura de lotes de 100 mL (10 mM, dissolvido em PBS 1x), com 40 ul de anticorpo α-Kp, o que resulta em um grau final de substituição de 16 resíduos de biotina por Ab e uma última concentração de proteína de 10 mg ml -1. </li><li> Usando múltipla durante a noite replicar culturas, alvo das bactérias lavado com os anticorpos acima mencionados a seguir o protocolo apropriado. <ol><li> Especificamente, a lavagem K. pneumoniae em 1x PBS, e ressuspender em 1x PBS a uma DO de 4 (ca. 4 x 10 8 UFC ml-1 OD-1). </li><li> Para cada repetição, incubar 100 mL PBS, α -Anticorpos kp (10 ul α-Kp-biotB ou 10 ul de PBS para o controlo) e 100 ul de células durante 90 min a 30 ° C. Lave as células três vezes em 1x PBS, e ressuspender em 196 ul de PBS. </li></ol></li><li> Rotular as células com o conjugado estreptavidina QD705 e dividi-los em dois volumes equivalentes. </li><li> Lavar uma solução três vezes e em seguida ressuspender em que o volume apropriado. </li><li> Distribuir 100 ul das soluções lavadas e não lavadas em poços individuais de um negro placa de 96 poços. Meça a luminescência resultante sob a Luz Total, 490-510 nm e 710-730 nm filtros. Concentração de fluoróforo pode ser determinada utilizando 450-480 nm de excitação e de emissão de 710-730 nm. </li></ol>

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	<li>Hu, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+human+immunodeficiency+virus+type+1+protease+biosensor+assay+using+bioluminescence+resonance+energy+transfer.">A human immunodeficiency virus type 1 protease biosensor assay using bioluminescence resonance energy transfer.</a> J Virol Methods. 128, 93-103 (2005).</li><li>Contag, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+gene+expression+in+living+mammals+using+a+bioluminescent+reporter.">Visualizing gene expression in living mammals using a bioluminescent reporter.</a> Photochem Photobiol. 66, 523-531 (1997).</li><li>Badr, C. E., Tannous, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioluminescence+imaging:+progress+and+applications.">Bioluminescence imaging: progress and applications.</a> Trends in Biotechnology. 29, 624-633 (2011).</li><li>Maywood, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+core+circadian+feedback+loop+in+suprachiasmatic+nucleus+of+mCry1-luc+transgenic+reporter+mouse.">Analysis of core circadian feedback loop in suprachiasmatic nucleus of mCry1-luc transgenic reporter mouse.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 110, 9547-9552 (2013).</li><li>Condeelis, J., Weissleder, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vivo+Imaging+in+Cancer.">In Vivo Imaging in Cancer.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. , (2010).</li><li>Madero-Visbal, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioluminescence+imaging+correlates+with+tumor+progression+in+an+orthotopic+mouse+model+of+lung+cancer.">Bioluminescence imaging correlates with tumor progression in an orthotopic mouse model of lung cancer.</a> Surgical Oncology. 21, 23-29 (2012).</li><li>Thalhofer, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+transgenic+Leishmania+parasites+in+a+live+host.">In vivo imaging of transgenic Leishmania parasites in a live host.</a> J Vis Exp. 10, (2010).</li><li>Troy, T., Jekic-McMullen, D., Sambucetti, L., Rice, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+comparison+of+the+sensitivity+of+detection+of+fluorescent+and+bioluminescent+reporters+in+animal+models.">Quantitative comparison of the sensitivity of detection of fluorescent and bioluminescent reporters in animal models.</a> Molecular Imaging: Official Journal of the Society for Molecular Imaging. 3, 9-23 (2004).</li><li>Michelini, E., Cevenini, L., Mezzanotte, L., Roda, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Luminescent+probes+and+visualization+of+bioluminescence.">Luminescent probes and visualization of bioluminescence.</a> Methods Mol Biol. 574, 1-13 (2009).</li><li>Branchini, B. R., Ablamsky, D. M., Rosenberg, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemically+Modified+Firefly+Luciferase+Is+an+Efficient+Source+of+Near-Infrared+Light.">Chemically Modified Firefly Luciferase Is an Efficient Source of Near-Infrared Light.</a> Bioconjugate Chemistry. 21, 2023-2030 (2010).</li><li>Saito, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Luminescent+proteins+for+high-speed+single-cell+and+whole-body+imaging.">Luminescent proteins for high-speed single-cell and whole-body imaging.</a> Nat Commun. 3, 1262 (2012).</li><li>Dragulescu-Andrasi, A., Chan, C. T., De, A., Massoud, T. F., Gambhir, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioluminescence+resonance+energy+transfer+(BRET)+imaging+of+protein-protein+interactions+within+deep+tissues+of+living+subjects.">Bioluminescence resonance energy transfer (BRET) imaging of protein-protein interactions within deep tissues of living subjects.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 108, 12060-12065 (2011).</li><li>Bacart, J., Corbel, C., Jockers, R., Bach, S., Couturier, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+BRET+technology+and+its+application+to+screening+assays.">The BRET technology and its application to screening assays.</a> Biotechnology Journal. 3, 311-324 (2008).</li><li>So, M. -. K., Xu, C., Loening, A. M., Gambhir, S. S., Rao, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-illuminating+quantum+dot+conjugates+for+in+vivo+imaging.">Self-illuminating quantum dot conjugates for in vivo imaging.</a> Nat Biotechnol. 24, 339-343 (2006).</li><li>Wu, Q., Chu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-illuminating+quantum+dots+for+highly+sensitive+in+vivo+real-time+luminescent+mapping+of+sentinel+lymph+nodes.">Self-illuminating quantum dots for highly sensitive in vivo real-time luminescent mapping of sentinel lymph nodes.</a> Int J Nanomedicine. 7, 3433-3443 (2012).</li><li>Wu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+far-red+luminescence+imaging+of+a+biomarker+based+on+BRET+from+Cypridina+bioluminescence+to+an+organic+dye.">In vivo far-red luminescence imaging of a biomarker based on BRET from Cypridina bioluminescence to an organic dye.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 106, 15599-15603 (2009).</li><li>Piston, D. W., Kremers, G. -. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+protein+FRET:+the+good,+the+bad+and+the+ugly.">Fluorescent protein FRET: the good, the bad and the ugly.</a> Trends Biochem Sci. 32, 407-414 (2007).</li><li>Dragavon, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=in+Imaging,+Manipulation,+and+Analysis+of+Biomolecules,+Cells,+and+Tissues.">in Imaging, Manipulation, and Analysis of Biomolecules, Cells, and Tissues.</a> , 790210-790219 (2011).</li><li>Dragavon, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+excitation+of+nanoparticles+using+luminescent+bacteria.">In vivo excitation of nanoparticles using luminescent bacteria.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 109, 8890-8895 (2012).</li><li>Holland, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+characterization+of+fluorescence+by+unbound+excitation+from+luminescence:+Broadening+the+scope+of+energy+transfer.">In vitro characterization of fluorescence by unbound excitation from luminescence: Broadening the scope of energy transfer.</a> Methods. , (2013).</li><li>Choi, K. -. H., Schweizer, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mini-Tn7+insertion+in+bacteria+with+single+attTn7+sites:+example+Pseudomonas+aeruginosa.">mini-Tn7 insertion in bacteria with single attTn7 sites: example Pseudomonas aeruginosa.</a> Nat. Prot. 1, 153-161 (2006).</li><li>Riottot, M. M., Fournier, J. M., Jouin, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+evidence+for+the+involvement+of+capsular+polysaccharide+in+the+immunoprotective+activity+of+Klebsiella+pneumoniae+ribosomal+preparations.">Direct evidence for the involvement of capsular polysaccharide in the immunoprotective activity of Klebsiella pneumoniae ribosomal preparations.</a> Infect Immun. 31, 71-77 (1981).</li><li>Becker, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+lifetime+imaging--techniques+and+applications.">Fluorescence lifetime imaging--techniques and applications.</a> J Microsc. 247, 119-136 (2012).</li><li>Rogers, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+local+Ca2++dynamics+with+genetically+encoded+bioluminescent+reporters.">Visualization of local Ca2+ dynamics with genetically encoded bioluminescent reporters.</a> Eur J Neurosci. 21, 597-610 (2005).</li><li>Dubochet, J., McDowall, A. W., Menge, B., Schmid, E. N., Lickfeld, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+microscopy+of+frozen-hydrated+bacteria.">Electron microscopy of frozen-hydrated bacteria.</a> Journal of Bacteriology. 155, 381-390 (1983).</li><li>Graham, L. L., Harris, R., Villiger, W., Beveridge, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Freeze-substitution+of+gram-negative+eubacteria:+general+cell+morphology+and+envelope+profiles.">Freeze-substitution of gram-negative eubacteria: general cell morphology and envelope profiles.</a> Journal of Bacteriology. 173, 1623-1633 (1991).</li><li>Hobot, J. A., Carlemalm, E., Villiger, W., Kellenberger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Periplasmic+gel:+new+concept+resulting+from+the+reinvestigation+of+bacterial+cell+envelope+ultrastructure+by+new+methods.">Periplasmic gel: new concept resulting from the reinvestigation of bacterial cell envelope ultrastructure by new methods.</a> Journal of Bacteriology. 160, 143-152 (1984).</li></ol>

Os autores declaram a competir interesses financeiros. JD, SB, KLR e SLS contribuiu para EP10290158.4 Europeu de Patentes e Organização Mundial da Propriedade Intelectual pedido de patente WO/2011/117847.

A manifestação fundamental do combustível pode ser alcançado simplesmente através da mistura de bactérias luminescentes com nanopartículas fluorescentes ou QDs. As duas entidades vão ser fisicamente separado e permanecem para além de qualquer distância RET eficiente. Mais difícil é a optimização do sinal COMBUSTÍVEL tanto in vitro como in vivo. Sob condições in vitro, com ou sem um absorvedor óptico presente, geralmente a adição de excesso de fluoróforo será suficiente para maximizar a resposta COMBUSTÍVEL. No entanto, em concentrações elevadas, tais como os fenómenos de têmpera ou de colisão estática pode levar a uma perda de sinal fluorescente. Realizando uma série de diluições variando independentemente da concentração da fonte luminescente e o fluoróforo irá contribuir para optimizar as concentrações desejadas. A criação e otimização de combustível sob nas concentrações in vivo é muito mais difícil e precisa ser tratada numa base caso-a-caso. Pode ser difícil criar um condition em que a entidade fluorescente pode ser acedida opticamente pela fonte luminescente. Como tal, a começar pelo co-injeções diretas dos dois grupos pode fornecer informações sobre o sucesso do combustível em condições ideais. Existem protocolos padrão para as bactérias de rotulagem e células eucarióticas com entidades fluorescentes, como a série Alexa e QDs. Muitas vezes, isto requer a funcionalização da superfície ou a activação com os anticorpos, o que pode levar a efeitos indesejados, como reduziu a viabilidade celular ou a actividade metabólica alterada. Para superar isto, é importante para determinar a quantidade óptima de anticorpo ou agente de activação necessário que minimiza as perturbações celulares e maximizar a marcação fluorescente. O uso de QDs é vantajoso por causa do seu amplo espectro de excitação caracteristicamente, os espectros de emissão e estreita sintonizável, e a possibilidade de um grande deslocamento de Stokes. No entanto, QDs pode ser citotóxico e pode não ser desejável em alguns casos. <pclass = &quot;jove_content&quot;&gt; FUEL é um fenômeno que está presente em muitos experimentos BRET 13 e é aplicável a uma variedade de fontes luminescentes e fluorescentes. Até agora, os fótons resultantes da FUEL foram considerados o produto de interações não-específicas ou um sinal de fundo infeliz resultante de experiências BRET mal concebidos. É somente com o tipo de experiências demonstraram aqui que foram capazes de identificar a utilidade deste sinal indesejado. Nos exemplos mostrados, as bactérias luminescentes agir como uma fonte de excitação difusa capaz de desencadear uma resposta fluorescente padrão a partir de uma grande variedade de entidades fluorescentes. Além disso, devido à distância de trabalho substancial, é seguro concluir que, enquanto combustível pode ser construída sem a ocorrência de BRET, em BRET geral não pode ser observado sem a contribuição do combustível. Mais importante, devido à falta de um requisito de segmentação, o combustível pode ser usada para cobrir a abertura do espaço que existe entre BRET e ctécnicas de imagem de todo o onventional animais.

A modificação genética de organismos, tais como os vírus 1, 2, 3, bactérias ou pequenos mamíferos ou 4 para induzir ou bioluminescência constitutivamente expresso, tem sido muito bem sucedido e amplamente demonstrado 5-7. A bioluminescência, uma reacção quimioluminescente in vivo envolvendo reagentes que ocorrem naturalmente, tem a vantagem de produzir luz sem a necessidade de uma fonte de luz externa. Como tal, a imagem de bioluminescência não sofre os inconvenientes comuns de sinal de auto-e não específica encontrados a partir de imagens de fluorescência 8. Por conseguinte, a bioluminescência tem uma proporção significativa de sinal-para-ruído, uma vez detectado qualquer sinal proveniente apenas da fonte destinada. Enquanto muitos modelos têm explorado o operon lux de luminescens Photorhabdus (máximo de emissão centrado entre 480 e 490 nm) para in vitro e in vivo 9 aplicações, seu uso em pequena mammals tem sido problemática devido à própria natureza das condições de imagem; a existência de impregnante absorvedores ópticas, tais como a hemoglobina, e agentes de dispersão, tais como tecidos e ossos, fortemente afectar azul para os comprimentos de onda amarelas 3. A expressão de uma luciferase de pirilampo engenharia (máximo de emissão a 617nm) foi desenvolvido recentemente e incorporada, fornecendo uma ferramenta que ultrapassa grandemente a absorção óptica 10, mas ainda está sujeito a efeitos de espalhamento. Em resposta, tem havido várias tentativas para vermelho-deslocar o sinal emitido para a janela óptica desejada de 650-900 nm, uma região de absorção e dispersão minimizado, utilizando transferência de energia de ressonância de bioluminescência (BRET) 11-13. Como uma ferramenta para melhorar a detecção do sinal, BRET, que utiliza uma fonte bioluminescente como o dador e um fluoróforo adicionado como o aceitador, tem encontrado um sucesso limitado. Como um exemplo seminal desse fenômeno &quot;, auto-iluminação pontos quânticos4; (SIQDs) 14 consistem modificado Renilla reniformis luciferases ligados à camada de polímero-lisina externo quântica de disponível comercialmente pontos (QDs). Após a adição do substrato, a reacção bioluminescente induz a emissão de fluorescência a partir de QDs, gerando uma produção significativa de fotões vermelhos. No entanto, estes SIQDs têm limitado a aplicabilidade na visualização in vivo de eventos fisiologicamente relevantes. Esta aplicabilidade limitada, é provavelmente devido à dificuldade de se ligar a sonda dupla para o órgão, célula ou do gene de interesse, uma vez que os SIQDs não pode ser geneticamente codificado e, portanto, seria necessária uma modificação secundária do material de cobertura polimérica. Para melhorar a sua aplicabilidade, SIQDs alternativos, onde as luciferases estão vinculados diretamente ao núcleo luminescente, recentemente foram empregadas 15. Construindo fora do conceito SIQD, um sistema BRET mais aplicável foi alcançada ligando Cypridina luciferase de um emdocyanine corante 16, que era capaz de se direccionar especificamente tumores em ratinhos, enquanto a produção de um desvio para o vermelho substancial de 460 nm a 675 nm. Para submeter a transferência de energia não-radiativos, BRET segue os mesmos constrangimentos primárias como sua contraparte fluorescente: deve haver uma forte sobreposição espectral entre a emissão de dador e o aceitador de espectros de excitação e a distância de trabalho entre as duas porções deve ser da ordem do raio de Förster (5-14 nm dependendo do par dador-aceitador, com uma distância máxima eficaz de duas vezes o raio de Förster 17). Esta dependência distância limita muito os tipos de eventos que podem ser observadas usando BRET como um meio para melhorar a detecção. Recentemente, uma nova abordagem foi identificado e demonstrados com estudos in vitro e em condições in vivo. Aproveitando a fundação de BRET, Fluorescência por Excitação Unbound de luminescência (FUEL) 18, 19 </sup&gt; também requer uma forte sobreposição espectral entre o luminescente e componentes fluorescentes. No entanto, ao contrário BRET, o combustível é um processo completamente radiativa em que o fotão emitido a partir da fonte luminescente é absorvida por um fluoróforo opticamente acessíveis, o que posteriormente emite um fotão vermelho deslocado de acordo com o rendimento quântico de fluoróforo. Semelhante a BRET, esta abordagem também pode ser utilizada para ultrapassar as limitações de imagiologia, na presença de absorventes ópticos. O desvio para o vermelho resultante proporciona um aumento global e especificidade do sinal detectado, devido a uma diminuição da atenuação e de uma redução dos efeitos de dispersão óptica. COMBUSTÍVEL foi relatado para ocorrer entre Escherichia coli bioluminescentes expressando o operon lux e QDs 18, 19. Enquanto experimentalmente semelhante aos SIQDs, existe uma diferença fundamental: em combustível, ele não é necessário para a fonte luminescente estar fisicamente ligado ao fluoróforo, o qual permite que for codificação genética da sonda luminescente. Devido ao êxito da detecção de combustível entre as bactérias luminescentes e QDs, é possível que esta técnica pode ser aplicada a ambos superficial (pele) e profunda do tecido (pulmão, fígado) infecções, tais como Staphylococcus aureus e Klebsiellia pneumoniae. Desde o relatório do seu significado experimental, COMBUSTÍVEL evoluiu para incluir um modelo matemático robusta 20, que pode ser utilizado para prever luminescente aceitável e pares fluorescentes, e as suas aplicações foram expandidas para incluir o uso na identificação das características fotofísicas, tais como o rendimento quântico. Nós descrevemos abaixo algumas das técnicas básicas de combustível. Primeiro, vamos mostrar evidências para esse fenômeno sobre a curto (mm) e comprimento (cm) distâncias de trabalho, o que fundamentalmente distingue COMBUSTÍVEL de BRET. Em segundo lugar, expandir os possíveis pares de combustível em examinar uma ampla variedade de fluoróforos e nanopartículas fluorescentes. Third, aplicações de combustível são investigados, comparando pares COMBUSTÍVEL alvo e não-alvo.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:764px;" width="764">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:175px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="2" height="21" style="height:21px;">Escherichia coli expressing the luxABCDE operon&#160;</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>kindly provided by Jos&#233; A. Bengoechea with permission from Herbert P. Schweizer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Klebsiella pneumoniae 52145&#160;</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>52145 is a serotype K2 reference strain</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Luria Bertani (LB)&#160;</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>standard growth media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Q-Tracker 705&#160;</td>
			<td style="width:175px;">Life Sciences</td>
			<td>Q21061MP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Q-Tracker 800</td>
			<td style="width:175px;">Life Sciences</td>
			<td>Q21071MP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Alexa 555</td>
			<td style="width:175px;">Life Sciences</td>
			<td style="width:119px;">S21381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Alexa 568</td>
			<td style="width:175px;">Life Sciences</td>
			<td style="width:119px;">S11226</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Alexa 633</td>
			<td style="width:175px;">Life Sciences</td>
			<td style="width:119px;">S21375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Alexa 700</td>
			<td style="width:175px;">Life Sciences</td>
			<td style="width:119px;">S21383</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Non-fluorescent microspheres</td>
			<td style="width:175px;">Polysciences, Inc</td>
			<td align="right" style="width:119px;">15913</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Pink microspheres</td>
			<td style="width:175px;">Life Sciences</td>
			<td>F8887</td>
			<td>40nm diameter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">yellow microspheres</td>
			<td style="width:175px;">Life Sciences</td>
			<td style="width:119px;">F8888</td>
			<td>40nm diameter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Ivis Spectrum</td>
			<td style="width:175px;">PerkinElmer</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin</td>
			<td style="width:175px;">Thermo Scientific Pierce</td>
			<td align="right">21425</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Zeba Spin Desalting Columns 7K MWCO</td>
			<td style="width:175px;">Thermo Scientific Pierce</td>
			<td align="right">21425</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HABA assay kit&#160;</td>
			<td style="width:175px;">Thermo Scientific Pierce</td>
			<td align="right">28005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Bradford assay</td>
			<td style="width:175px;">Bio-Rad</td>
			<td>500-0201</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a step beyond bret: fluorescence by unbound excitation from luminescence (fuel)

Fluorescência por Excitação Unbound de luminescência (FUEL) é um processo de emissão de excitação radiativa que produz um aumento do sinal e realce de contraste in vitro e in vivo. Ações de combustível Muitos dos mesmos princípios subjacentes como Transferência Bioluminescência Resonance Energy (BRET), mas é muito diferente nas distâncias de trabalho aceitáveis ​​entre a fonte luminescente ea entidade fluorescente. Enquanto BRET que se encontra limitada a um máximo de duas vezes o raio de Förster, geralmente menos do que 14 nm, o combustível pode ocorrer a distâncias até ao fim ou mesmo centímetros na ausência de um absorvedor óptico. Aqui vamos expandir sobre o fundamento e aplicabilidade do FUEL, revendo os princípios relevantes por trás do fenômeno e demonstrar a sua compatibilidade com uma ampla variedade de fluoróforos e nanopartículas fluorescentes. Além disso, a utilidade de COMBUSTÍVEL alvo-anticorpo é explorado. Os exemplos mostrados aqui fornecem evidências de que o combustível pode ser utilizado para applications onde BRET não é possível, preenchendo o vazio espacial que existe entre BRET e toda tradicional imagem dos animais.

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A Step Beyond BRET: Fluorescence by Unbound Excitation from Luminescence FUEL

Expandindo a fundação e aplicabilidade da fluorescência por Unbound excitação de luminescência (FUEL) através do levantamento os princípios relevantes e demonstrar a sua compatibilidade com uma infinidade de fluoróforos e condições alvo de anticorpos.

A Step Beyond BRET: Fluorescência por Excitação Unbound de luminescência (FUEL)

Fluorescence by Unbound Excitation from Luminescence (FUEL) is a radiative excitation-emission process that produces increased signal and contrast ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

A Step Beyond BRET: Fluorescence by Unbound Excitation from Luminescence (FUEL)

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