Name: a step beyond bret: fluorescence by unbound excitation from luminescence (fuel)
Uploaded: 2014-05-23T14:45:00
Duration: 7 min 4 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Step Beyond BRET: Fluorescence by Unbound Excitation from Luminescence FUEL at JoVE.com

Авторы хотели бы выразить свою благодарность за финансовую поддержку от Пастера фонда Нью-Йорка (в JD, CS, CS), ЕС-FP7 Программа «Автоматизация&quot; (для SLS), Программы Института Карно 11 (в JD, АГ , АР, РТ, SLS) и проекта IMNOS (до комнатной температуры, SLS), Конни-Мейв благотворительный фонд (SLS), европейские мастера в молекулярной визуализации (ИТ), программы Регион Иль-де-Франс MODEXA (SLS), СЕЗАМ (SLS) и DimMalInf (SLS, RT), ANR Программа Grandes Investissement де L&#39;Avenir инфраструктуры Nationales ан Biologie-Santé: Франция LifebioImaging (FLI) Франция Жизнь томография (КТ, SLS), Франция Bioimaging (JD, SLS) и Институт Пастера, Париж. Кроме того, авторы хотели бы поблагодарить, Хосе Bengoechea и Герберт Швейцер для реагентов. Кроме того, авторы хотели бы поблагодарить Синди Fevre которые сгенерированный антитела.

1. Реагенты <ol><li> Покупка или разработать люминесцентные бактерии и соответствующие питательных сред, таких как модифицированный кишечной палочки, выражающей лк ABCDE 21, Vibrio ПзсЬеп, Photobacterium зр. Klebsiella пневмонии 22. </li><li> Подготовка физиологический раствор (0,9% NaCl) и питательных сред решения в соответствии со стандартными рецептов. E. палочка и К. пневмонии были выращены в Luria Bertani (LB) при 37 ° С и V. ПзсЬеп и Photobacterium зр в LB с добавлением 0,5 М NaCl при 22 ° С. </li><li> Покупка или приобрести флуоресцентных зондов, таких как Q-слежения 705 (диаметр 40 нм, называют QD705), Q-слежения 800 (диаметр 40 нм, называют QD800), флуоресцентный (диаметр 40 нм) и не-люминесцентные полистирольные микросферы ( 48 нм в диаметре), и обычные красители флуоресцентные. </li><li> Подготовьте необходимые реагенты для бактериальной маркировки. </li><li> Обеспечить доступ квсе животное биолюминесценции формирования изображения, такое как IVIS Spectrum, который способен обнаруживать сигнал в широком диапазоне длин волн излучения и времени экспозиции. Ридер способен измерений биолюминесценции хватит для большинства экспериментов, описанных здесь. </li></ol> 2. Основные Рекапитуляция топлива <ol><li> Начиная с отдельных колоний на стандартных планшетах для культивирования, начать Ночные культуры светящихся бактерий. Здесь В. были использованы ПзсЬеп. </li><li> В день эксперимента, инициировать новые субкультуры и дать им возможность развиваться, пока OD 600 из 1-1,5 не будет достигнута. Для того чтобы получить сопоставимые результаты лучше использовать бактерии в подобных состояний роста, в которых они производят интенсивные сигналы. Это могут быть уверены, сохраняя OD 600 константу. </li><li> Комбинат аликвоты 100 мкл из каждой или с 5 мкл QD705 или физиологического раствора (PS), а затем добавить в 895 мкл PS в Standaй спектроскопические кюветы. Поместите заполненные кювет в IVIS Spectrum и принять измерения в рамках соответствующих наборов фильтров. Здесь был использован фильтр излучение 710-730 нм. </li></ol> 3. ТОПЛИВО За различных расстояниях <ol><li> Заполните два уменьшенный объем (1 мл) пластиковые фотометрические кюветы с либо 50 мкл QD705 или 97,2 мкл нефлуоресцентных 48 нм полистирола микросфер в общем объеме 1 мл ПС. Это гарантирует аналогичную площадь с твердой поверхностью за общего объема между двумя структурами. </li><li> Подготовка источника света кювету по тэгов третью кювету со стандартной черной лентой или какого-либо другого непрозрачного материала, способного блокировать свет. Тщательно подготовить две идентичные оптические окна на противоположных сторонах кюветы. </li><li> Поместите предварительно заполненные кюветы непосредственно на обе стороны от источника света кюветы. Добавить 1 мл аликвоты V. ПзсЬеп или другой культуры (то есть люминесцентные кишечная палочка или Photobacterium ср) из свежего субкультуры в кювете источника света и покрыть ее непрозрачного материала, например, черную бумагу, чтобы уменьшить любое света загрязнения. </li><li> Визуализация три кюветы при соответствующих фильтров выбросов, таких как общий свет и 710-730 нм фильтров выбросов, с временем экспозиции от 10, 30 и 30 с соответственно. </li><li> Измените как внешние, так кювет в эквивалентных дальнейших расстояниях от центральной кювете, а затем визуализировать снова. Повторяйте, пока окончательное лицом к лицу (центральной к снижению объема кюветы) расстояние 3 см не будет достигнута. На каждом шаге приобрести флуоресценции изображение (450-480 нм возбуждения, 710-730 нм излучения) для проверки расположение QD705. </li></ol> 4. Исследование потенциальным топливом пар <ol><li> Заполните два снижение кювет громкости с 1 мл растворов, содержащих либо флуорофор или флуоресцентный наночастицы интереса к одной и PS или PS с нефлуоресцентных наночастиц в качестве отрицательного контроля в другой. В гоэ работа продемонстрировала здесь, разнообразие потенциальных коммерчески доступных ТОПЛИВА флуорофорами и флуоресцентных наночастиц были исследованы как указано в таблице 1. </li><li> Добавить 1 мл аликвоты свежего V. ПзсЬеп или других светящихся бактерий к затемненным третьей кювету, содержащую два физически равные оптические окна, расположенные на противоположных сторонах. Крышка кювету с непрозрачным веществом, например на лист черной бумаги. </li><li> В короткой, но равном расстоянии месте два снижение кюветы громкости на обе стороны от затемненной кюветы и визуализировать при соответствующих фильтров. Здесь была использована на расстоянии 0,7 см. Повторите с другой флуорофорами. </li></ol> 5. Целевые ТОПЛИВА <ol><li> Подготовка биотинилированных антител, специфичных к люминесцирующих бактерий. Например, здесь первичные антитела, специфичные к К. пневмонии (α-Кр) биотинилировали использованием раствора, содержащего EZ-Link сульфо-NHS-LC-биотина. </lя&gt; <li> Удалить избыток реагента от антител с использованием колонки обессоливания под центрифугирования (1500 мкг) в течение 2 мин. </li><li> С помощью стандартного Бредфорда для определения концентрации белка и определить степень антител биотинилирования по HABA анализа. </li><li> Получение α-KP-Био биотинилированного антитела (AB) порциями при смешивании 100 мкл (10 мМ, растворенного в 1 × PBS) с 40 мкл α-КП антитела, в результате чего в конечном степенью замещения остатков 16 биотина в АВ и окончательное Концентрацию белка 10 мг мл-1. </li><li> Использование нескольких ночь повторить культур, нацелены на вымытые бактерии с вышеупомянутыми антител следующие соответствующего протокола. <ol><li> В частности, мыть К. пневмонии в 1х PBS и ресуспендируют в 1 × PBS до оптической плотности (около 4 4 х 10 8 КОЕ мл -1 OD -1). </li><li> Для каждого из одинаковых, инкубировать 100 мкл PBS, α -Kp антитела (10 мкл α-Кр-biotB или 10 мкл PBS для контроля) и 100 мкл клеток в течение 90 мин при 30 ° C. Вымойте клетки три раза в 1x PBS, и ресуспендируют в 196 мкл PBS. </li></ol></li><li> Этикетка клетки с QD705 стрептавидин конъюгату и разделить их на две эквивалентных объемов. </li><li> Вымойте одно решение в три раза, а затем ресуспендируйте его в соответствующем объеме. </li><li> Распределить 100 мкл промытый и немытых решений на отдельные лунки черного 96-луночного планшета. Измерьте полученный свечение под общий свет, 490-510 нм, и 710-730 нм фильтров. Концентрация флуорофора можно определить, используя 450-480 нм возбуждение и 710-730 нм излучение. </li></ol>

<ol>
	<li>Hu, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+human+immunodeficiency+virus+type+1+protease+biosensor+assay+using+bioluminescence+resonance+energy+transfer.">A human immunodeficiency virus type 1 protease biosensor assay using bioluminescence resonance energy transfer.</a> J Virol Methods. 128, 93-103 (2005).</li><li>Contag, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+gene+expression+in+living+mammals+using+a+bioluminescent+reporter.">Visualizing gene expression in living mammals using a bioluminescent reporter.</a> Photochem Photobiol. 66, 523-531 (1997).</li><li>Badr, C. E., Tannous, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioluminescence+imaging:+progress+and+applications.">Bioluminescence imaging: progress and applications.</a> Trends in Biotechnology. 29, 624-633 (2011).</li><li>Maywood, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+core+circadian+feedback+loop+in+suprachiasmatic+nucleus+of+mCry1-luc+transgenic+reporter+mouse.">Analysis of core circadian feedback loop in suprachiasmatic nucleus of mCry1-luc transgenic reporter mouse.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 110, 9547-9552 (2013).</li><li>Condeelis, J., Weissleder, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vivo+Imaging+in+Cancer.">In Vivo Imaging in Cancer.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. , (2010).</li><li>Madero-Visbal, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioluminescence+imaging+correlates+with+tumor+progression+in+an+orthotopic+mouse+model+of+lung+cancer.">Bioluminescence imaging correlates with tumor progression in an orthotopic mouse model of lung cancer.</a> Surgical Oncology. 21, 23-29 (2012).</li><li>Thalhofer, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+transgenic+Leishmania+parasites+in+a+live+host.">In vivo imaging of transgenic Leishmania parasites in a live host.</a> J Vis Exp. 10, (2010).</li><li>Troy, T., Jekic-McMullen, D., Sambucetti, L., Rice, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+comparison+of+the+sensitivity+of+detection+of+fluorescent+and+bioluminescent+reporters+in+animal+models.">Quantitative comparison of the sensitivity of detection of fluorescent and bioluminescent reporters in animal models.</a> Molecular Imaging: Official Journal of the Society for Molecular Imaging. 3, 9-23 (2004).</li><li>Michelini, E., Cevenini, L., Mezzanotte, L., Roda, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Luminescent+probes+and+visualization+of+bioluminescence.">Luminescent probes and visualization of bioluminescence.</a> Methods Mol Biol. 574, 1-13 (2009).</li><li>Branchini, B. R., Ablamsky, D. M., Rosenberg, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemically+Modified+Firefly+Luciferase+Is+an+Efficient+Source+of+Near-Infrared+Light.">Chemically Modified Firefly Luciferase Is an Efficient Source of Near-Infrared Light.</a> Bioconjugate Chemistry. 21, 2023-2030 (2010).</li><li>Saito, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Luminescent+proteins+for+high-speed+single-cell+and+whole-body+imaging.">Luminescent proteins for high-speed single-cell and whole-body imaging.</a> Nat Commun. 3, 1262 (2012).</li><li>Dragulescu-Andrasi, A., Chan, C. T., De, A., Massoud, T. F., Gambhir, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioluminescence+resonance+energy+transfer+(BRET)+imaging+of+protein-protein+interactions+within+deep+tissues+of+living+subjects.">Bioluminescence resonance energy transfer (BRET) imaging of protein-protein interactions within deep tissues of living subjects.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 108, 12060-12065 (2011).</li><li>Bacart, J., Corbel, C., Jockers, R., Bach, S., Couturier, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+BRET+technology+and+its+application+to+screening+assays.">The BRET technology and its application to screening assays.</a> Biotechnology Journal. 3, 311-324 (2008).</li><li>So, M. -. K., Xu, C., Loening, A. M., Gambhir, S. S., Rao, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-illuminating+quantum+dot+conjugates+for+in+vivo+imaging.">Self-illuminating quantum dot conjugates for in vivo imaging.</a> Nat Biotechnol. 24, 339-343 (2006).</li><li>Wu, Q., Chu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-illuminating+quantum+dots+for+highly+sensitive+in+vivo+real-time+luminescent+mapping+of+sentinel+lymph+nodes.">Self-illuminating quantum dots for highly sensitive in vivo real-time luminescent mapping of sentinel lymph nodes.</a> Int J Nanomedicine. 7, 3433-3443 (2012).</li><li>Wu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+far-red+luminescence+imaging+of+a+biomarker+based+on+BRET+from+Cypridina+bioluminescence+to+an+organic+dye.">In vivo far-red luminescence imaging of a biomarker based on BRET from Cypridina bioluminescence to an organic dye.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 106, 15599-15603 (2009).</li><li>Piston, D. W., Kremers, G. -. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+protein+FRET:+the+good,+the+bad+and+the+ugly.">Fluorescent protein FRET: the good, the bad and the ugly.</a> Trends Biochem Sci. 32, 407-414 (2007).</li><li>Dragavon, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=in+Imaging,+Manipulation,+and+Analysis+of+Biomolecules,+Cells,+and+Tissues.">in Imaging, Manipulation, and Analysis of Biomolecules, Cells, and Tissues.</a> , 790210-790219 (2011).</li><li>Dragavon, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+excitation+of+nanoparticles+using+luminescent+bacteria.">In vivo excitation of nanoparticles using luminescent bacteria.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 109, 8890-8895 (2012).</li><li>Holland, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+characterization+of+fluorescence+by+unbound+excitation+from+luminescence:+Broadening+the+scope+of+energy+transfer.">In vitro characterization of fluorescence by unbound excitation from luminescence: Broadening the scope of energy transfer.</a> Methods. , (2013).</li><li>Choi, K. -. H., Schweizer, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mini-Tn7+insertion+in+bacteria+with+single+attTn7+sites:+example+Pseudomonas+aeruginosa.">mini-Tn7 insertion in bacteria with single attTn7 sites: example Pseudomonas aeruginosa.</a> Nat. Prot. 1, 153-161 (2006).</li><li>Riottot, M. M., Fournier, J. M., Jouin, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+evidence+for+the+involvement+of+capsular+polysaccharide+in+the+immunoprotective+activity+of+Klebsiella+pneumoniae+ribosomal+preparations.">Direct evidence for the involvement of capsular polysaccharide in the immunoprotective activity of Klebsiella pneumoniae ribosomal preparations.</a> Infect Immun. 31, 71-77 (1981).</li><li>Becker, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+lifetime+imaging--techniques+and+applications.">Fluorescence lifetime imaging--techniques and applications.</a> J Microsc. 247, 119-136 (2012).</li><li>Rogers, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+local+Ca2++dynamics+with+genetically+encoded+bioluminescent+reporters.">Visualization of local Ca2+ dynamics with genetically encoded bioluminescent reporters.</a> Eur J Neurosci. 21, 597-610 (2005).</li><li>Dubochet, J., McDowall, A. W., Menge, B., Schmid, E. N., Lickfeld, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+microscopy+of+frozen-hydrated+bacteria.">Electron microscopy of frozen-hydrated bacteria.</a> Journal of Bacteriology. 155, 381-390 (1983).</li><li>Graham, L. L., Harris, R., Villiger, W., Beveridge, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Freeze-substitution+of+gram-negative+eubacteria:+general+cell+morphology+and+envelope+profiles.">Freeze-substitution of gram-negative eubacteria: general cell morphology and envelope profiles.</a> Journal of Bacteriology. 173, 1623-1633 (1991).</li><li>Hobot, J. A., Carlemalm, E., Villiger, W., Kellenberger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Periplasmic+gel:+new+concept+resulting+from+the+reinvestigation+of+bacterial+cell+envelope+ultrastructure+by+new+methods.">Periplasmic gel: new concept resulting from the reinvestigation of bacterial cell envelope ultrastructure by new methods.</a> Journal of Bacteriology. 160, 143-152 (1984).</li></ol>

Авторы заявляют конкурирующих финансовых интересов. Доктор юридических наук, СО, KLR и SLS способствовали Европейского патентного EP10290158.4 и Всемирная организация интеллектуальной собственности заявки на патент WO/2011/117847.

Фундаментальная демонстрация топлива может быть достигнуто лишь путем смешивания светящихся бактерий с люминесцентными наночастиц или КТ. Эти две организации будут физически отделены и остаются вне всякого эффективного расстояния RET. Более сложным является оптимизация сигнал ТОПЛИВА как в пробирке и в естественных условиях. В условиях ин витро, так и без оптической абсорбционной настоящее время обычно добавление избыточного флуорофора будет достаточно, чтобы максимизировать ответ топлива. Тем не менее, при высоких концентрациях явлений, например статическим или столкновительного тушения может привести к потере флуоресцентного сигнала. Выполнение серии разведений путем независимого изменения концентрации источника люминесцентного и флуорофора будет способствовать оптимизации желаемых концентраций. Создание и оптимизация ТОПЛИВА под концентраций естественных условиях гораздо сложнее и требует решения на индивидуальной основе к случаю. Это может быть трудно создать совместноеndition где флуоресцентный лицо может получить доступ оптически источником люминесцентного. Таким образом, начиная с прямого сотрудничества инъекций двух фрагментов может предоставить информацию относительно успеха ТОПЛИВА при оптимальных условиях. Существуют стандартные методики для маркировки бактерий и эукариотических клеток с флуоресцентными лиц, таких как серии Alexa и КТ. Часто это требует поверхности функционализации или активации с антителами, что может привести к нежелательным эффектам, как снижение жизнеспособности клеток или измененного метаболической активности. Чтобы преодолеть это, важно определить оптимальное количество антител или агента активации необходимо, что сводит к минимуму сотовой возмущения, максимизируя флуоресцентных меток. Использование КТ выгодно из-за их характерно широком спектре возбуждения, узким и перестраиваемого эмиссионных спектров, а также возможность большого сдвига Стокса. Тем не менее, КТ может быть цитотоксическое и не может быть желательным в некоторых случаях. <pкласс = &quot;jove_content&quot;&gt; ТОПЛИВА это явление, которое присутствует во многих экспериментах BRET 13 и применим к различным люминесцентных и флуоресцентных источников. До сих пор, фотоны в результате использования топлива считались продуктом неспецифических взаимодействий или несчастного фонового сигнала в результате плохо спланированных экспериментов BRET. Это только с виду эксперименты показали здесь, что мы были в состоянии идентифицировать полезность этого нежелательного сигнала. В показанных примерах, люминесцентные бактерии действуют как диффузный источник возбуждения способны вызывать стандартный флуоресцентный отклик от самых разнообразных флуоресцентных лиц. Кроме того, в связи с существенным рабочим расстоянием, можно с уверенностью сделать вывод, что в то время как топливо может быть построена без возникновения BRET, в общем BRET не могут наблюдаться без вклада ТОПЛИВА. Важно отметить, что из-за отсутствия ориентации требованию, топливо может использоваться для покрытия пространственное разрыв, который существует между BRET и сonventional методы визуализации целого животных.

Генетическая модификация организмов, таких как вирусы 1, 2, бактерий 3 или мелких млекопитающих 4 либо вызвать или конструктивно экспресс биолюминесценции, была весьма успешной и широко продемонстрировали 5-7. Биолюминесценция, хемилюминесцентный реакции в естественных условиях с участием реагентов в природе, имеет то преимущество, производя свет без необходимости внешнего источника света. Таким образом, биолюминесцентное изображений не страдает от общих недостатков авто-и неспецифической сигнала найденных из флуоресцентного изображения 8. Следовательно, биолюминесценции имеет значительное отношение сигнал-шум, так как любое обнаруженное сигнал исходит исключительно от предполагаемого источника. В то время как многие модели эксплуатировали лк оперона от Photorhabdus luminescens (максимум выбросов по центру между 480 и 490 нм) для в пробирке и в естественных приложений 9, его использование в небольшом Mammлов был проблематичным из-за самой природы условиях визуализации; пронизывает существование оптических абсорбентов, таких как гемоглобин, рассеяния агентов, таких как ткани и кости, сильно влияют синего цвета на желтый длин волн 3. Выражение сконструированного люциферазы светляков (максимум излучения на 617nm) недавно был разработан и включен, обеспечивая инструмент, который значительно преодолевает оптического поглощения 10, но все еще ​​является предметом эффекты рассеяния. В ответ, их было несколько попыток красное смещение излучаемого сигнала в нужную оптического окна 650-900 нм, область свернутом поглощения и рассеяния, используя биолюминесценции резонансный перенос энергии (Bret) 11-13. В качестве инструмента для улучшения обнаружения сигнала, Брет, которая использует биолюминесцентного источник в качестве донора и дополнительного флуорофором как акцептора, нашел ограниченный успех. Как семенной пример этого явления, &quot;самоизлучающие квантовые точки4; (SIQDs) 14 состоят из модифицированного Renilla reniformis люциферазы, связанных с внешним слоем полимера-лизин коммерчески доступного квантовые точки (КТ). После подложки Кроме того, в результате реакции биолюминесцентного вызывает флуоресцентное излучение от КТ, генерируя значительную выработку красных фотонов. Однако эти SIQDs ограничили применимость в естественных условиях визуализации физиологически соответствующих мероприятий. Эта ограниченная применимость, вероятно, из-за трудности увязывания двойной зонд к органа, клетки или интересующего гена, так как SIQDs не может быть генетически закодированы, а потому потребует вторичного модификацию полимерной оболочки. Для улучшения их применимости, альтернативные SIQDs, где люцифераз которые связаны непосредственно с ядром люминесцентного, недавно были заняты 15. Строительство от концепции SIQD, более применимо система BRET было достигнуто путем присоединения Cypridina люциферазу к инdocyanine краситель 16, который был способен специально нацеленные опухолей у мышей при производстве существенную красное смещение от 460 нм до 675 нм. Чтобы пройти безызлучательной передачи энергии, BRET следует тем же первичных связей, как его флуоресцентного коллегой: там должна быть сильная спектральная перекрытие между испусканием доноров и спектров возбуждения акцептора и рабочего расстояния между двумя фрагментами должна быть порядка радиус Ферстер (5-14 нм в зависимости от пары донор-акцепторного, с эффективным расстоянии не более удвоенным радиусом Ферстер 17). Это расстояние зависимость существенно ограничивает типы событий, которые можно наблюдать с помощью Брет в качестве средства для улучшения обнаружения. Недавно новый подход был идентифицирован и продемонстрировал в как в пробирке и в условиях естественных условиях. Строительство от фундамента Брет, флуоресценции по несвязанным возбуждения от люминесценции (топливо) 18, 19 </suр&gt; также требует сильного спектрального перекрытия между люминесцентных и флуоресцентных компонентов. Однако, в отличие BRET, топливо полностью радиационного процесс, при котором излучается фотон от источника люминесцентного поглощается оптически доступным флуорофора, который впоследствии испускает красное смещение фотона в соответствии с квантовым выходом флуорофора. Родственный BRET, этот подход также может быть использован для преодоления ограничений изображений в присутствии оптических абсорбентов. Полученный красный сдвиг обеспечивает общее увеличение и специфичность обнаруженного сигнала из-за уменьшения затухания и сокращению воздействия оптических рассеяния. ТОПЛИВО, как сообщается, происходят между биолюминесцентных кишечной палочки, выражающих лк оперона и КТ 18, 19. В то время как экспериментально похожи на SIQDs, существует фундаментальное различие: в топливном, это не является необходимым для источника люминесцентного быть физически связанный с флуорофора, что позволяет FOг генетическую кодировку люминесцентного зонда. Благодаря успешному обнаружению ТОПЛИВА между светящихся бактерий и КТ, не исключено, что этот метод может быть применен как к поверхностным (кожи) и внутренних органах (легких, печени) инфекций, таких как золотистый стафилококк и Klebsiellia пневмонии. Поскольку доклад его экспериментального значения, ТОПЛИВО стали включать надежную математическую модель 20, которая может использоваться для прогнозирования приемлемый люминесцентные и флуоресцентные пары, и ее приложения были распространены на использование в идентификации фотофизических характеристик, таких как квантовый выход. Ниже мы описываем некоторые из основных методов топлива. Во-первых, мы показываем доказательства этого явления более короткий и (мкм) и длинной (см) рабочие расстояния, которые принципиально отличает топливо из BRET. Во-вторых, мы расширяем на возможных пар ТОПЛИВА, исследуя разнообразные флуорофорами и флуоресцентных наночастиц. Thirд, ТОПЛИВО приложения исследованы путем сопоставления целевых и нецелевых пары топлива.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:764px;" width="764">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:175px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="2" height="21" style="height:21px;">Escherichia coli expressing the luxABCDE operon&#160;</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>kindly provided by Jos&#233; A. Bengoechea with permission from Herbert P. Schweizer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Klebsiella pneumoniae 52145&#160;</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>52145 is a serotype K2 reference strain</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Luria Bertani (LB)&#160;</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>standard growth media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Q-Tracker 705&#160;</td>
			<td style="width:175px;">Life Sciences</td>
			<td>Q21061MP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Q-Tracker 800</td>
			<td style="width:175px;">Life Sciences</td>
			<td>Q21071MP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Alexa 555</td>
			<td style="width:175px;">Life Sciences</td>
			<td style="width:119px;">S21381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Alexa 568</td>
			<td style="width:175px;">Life Sciences</td>
			<td style="width:119px;">S11226</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Alexa 633</td>
			<td style="width:175px;">Life Sciences</td>
			<td style="width:119px;">S21375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Alexa 700</td>
			<td style="width:175px;">Life Sciences</td>
			<td style="width:119px;">S21383</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Non-fluorescent microspheres</td>
			<td style="width:175px;">Polysciences, Inc</td>
			<td align="right" style="width:119px;">15913</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Pink microspheres</td>
			<td style="width:175px;">Life Sciences</td>
			<td>F8887</td>
			<td>40nm diameter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">yellow microspheres</td>
			<td style="width:175px;">Life Sciences</td>
			<td style="width:119px;">F8888</td>
			<td>40nm diameter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Ivis Spectrum</td>
			<td style="width:175px;">PerkinElmer</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin</td>
			<td style="width:175px;">Thermo Scientific Pierce</td>
			<td align="right">21425</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Zeba Spin Desalting Columns 7K MWCO</td>
			<td style="width:175px;">Thermo Scientific Pierce</td>
			<td align="right">21425</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HABA assay kit&#160;</td>
			<td style="width:175px;">Thermo Scientific Pierce</td>
			<td align="right">28005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Bradford assay</td>
			<td style="width:175px;">Bio-Rad</td>
			<td>500-0201</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a step beyond bret: fluorescence by unbound excitation from luminescence (fuel)

Флуоресценции по несвязанным возбуждения от люминесценции (топлива) является радиационного процесс возбуждения излучения, которая производит повышенную сигнал и повышение контрастности в пробирке и в естественных условиях. ТОПЛИВО разделяет многие из тех же основных принципах, что Биолюминесценция резонансный перенос энергии (BRET), еще сильно отличается в приемлемых рабочих расстояний между источником люминесцентного и флуоресцентного лица. В то время как BRET эффективно ограничивается максимум 2 раза радиуса Ферстер, обычно менее 14 нм, ТОПЛИВО может произойти на расстояниях до мкм или даже см при отсутствии оптического поглотителя. Здесь мы расширяем на фундаменте и применимости ТОПЛИВА, просмотрев соответствующие принципы, лежащие в основе явления и продемонстрировать свою совместимость с широким спектром флуорофорами и флуоресцентных наночастиц. Кроме того, утилита антител, ориентированных на топливо изучены. В примерах, приведенных здесь свидетельствуют, что топливо может быть использован для заявлications где BRET не возможно, наполняя пространственную пустоту, которая существует между BRET и традиционной целого изображения животных.

Watch this Scientific Journal Video about A Step Beyond BRET: Fluorescence by Unbound Excitation from Luminescence FUEL at JoVE.com

A Step Beyond BRET: Fluorescence by Unbound Excitation from Luminescence FUEL

Расширение основу и применимость флуоресценции по несвязанным возбуждения от люминесценции (топлива) по межеванию соответствующие принципы и демонстрирует свою совместимость с множеством флуорофорами и условий антител целевых.

Step Beyond BRET: флуоресценции по несвязанным возбуждения от люминесценции (ТОПЛИВО)

Fluorescence by Unbound Excitation from Luminescence (FUEL) is a radiative excitation-emission process that produces increased signal and contrast ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

A Step Beyond BRET: Fluorescence by Unbound Excitation from Luminescence (FUEL)

Thermodynamics of Membrane Protein Folding Measured by Fluorescence Spectroscopy

Термодинамика Мембранные белки Складные Измеряется флуоресцентной спектроскопии

Membrane protein folding is an emerging topic with both fundamental and health-related significance.  The abundance of membrane proteins in cells ...

Fluorescence Lifetime Imaging of Molecular Rotors in Living Cells

Флуоресценции жизни молекулярных роторов в живых клетках

Diffusion is often an important rate-determining step in chemical reactions or biological processes and plays a role in a wide range of intracellular ...

Generation and Recovery of &beta;-cell Spheroids From Step-growth PEG-peptide Hydrogels

Generation and Recovery of ÃƒÅ½Ã‚Â²-cell Spheroids From Step-growth PEG-peptide Hydrogels

Создание и восстановление β-клетки сфероидов Из Шаг рост PEG-пептида Гидрогели

Hydrogels are hydrophilic crosslinked polymers that provide a three-dimensional  microenvironment with tissue-like elasticity and high permeability for  ...

High-resolution Spatiotemporal Analysis of Receptor Dynamics by Single-molecule Fluorescence Microscopy

Высокое разрешение Пространственно-временная Анализ рецептора Dynamics по одиночных молекул флуоресцентной микроскопии

Single-molecule microscopy is emerging as a powerful approach to analyze the behavior of signaling molecules, in particular concerning those aspect (e.g., ...

3D Orbital Tracking in a Modified Two-photon Microscope: An Application to the Tracking of Intracellular Vesicles

3D Орбитальная слежения в модифицированной двухфотонного микроскопа: Приложение к отслеживая внутриклеточного везикулы

The objective of this video protocol is to discuss how to perform and analyze a three-dimensional fluorescent orbital particle tracking experiment using a ...

From Fast Fluorescence Imaging to Molecular Diffusion Law on Live Cell Membranes in a Commercial Microscope

От быстрого флуоресценции визуализации к молекулярной диффузии Закона о живых клеточных мембран в торговом микроскоп

It has become increasingly evident that the spatial distribution and the motion of membrane components like lipids and proteins are key factors in the ...

Engineering 'Golden' Fluorescence by Selective Pressure Incorporation of Non-canonical Amino Acids and Protein Analysis by Mass Spectrometry and Fluorescence

Инжиниринг «Золотой» флуоресценции путем селективного давления включения неканонических аминокислот и белков анализ по масс-спектрометрии и флуоресценции

Fluorescent proteins are fundamental tools for the life sciences, in particular for fluorescence microscopy of living cells. While wild-type and ...

Scalable Fabrication of Stretchable, Dual Channel, Microfluidic Organ Chips

Масштабируемые изготовление растягивается, двойной канал, орган Microfluidic фишки

A significant number of lead compounds fail in the pharmaceutical pipeline because animal studies often fail to predict clinical responses in human ...

Conducting Multiple Imaging Modes with One Fluorescence Microscope

Проведение нескольких режимов изображения с одной флуоресцентным микроскопом

Fluorescence microscopy is a powerful tool to detect biological molecules in situ and monitor their dynamics and interactions in real-time. In addition to ...

Visualizing Adhesion Formation in Cells by Means of Advanced Spinning Disk-Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

Визуализация адгезии образование в клетках посредством передовых спиннинг диска всего внутреннего отражения микроскопии флуоресцирования

In living cells, processes such as adhesion formation involve extensive structural changes in the plasma membrane and the cell interior. In order to ...